Une stratégie de préparation d’échantillons pour l’imagerie d’embryons précoces de poisson-zèbre dans un chorion intact à l’aide d’un microscope à feuillet de lumière est décrite. Il analyse les différentes orientations que les embryons acquièrent à l’intérieur du chorion aux stades épibolique et bourgeonnaire à 70 % et détaille les stratégies d’imagerie pour obtenir une résolution à l’échelle cellulaire dans tout l’embryon à l’aide du système de feuillet lumineux.
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Article de méthode
Stratégies d’imagerie et de montage par microscopie à feuillet de lumière pour les embryons précoces de poisson-zèbre
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Dans cet article
Résumé
Résumé
La microscopie à feuillet de lumière est devenue la méthodologie de choix pour l’imagerie en direct d’embryons de poisson-zèbre sur de longues échelles de temps avec une phototoxicité minimale. En particulier, un système multiview, qui permet la rotation des échantillons, permet d’imager des embryons entiers sous différents angles. Cependant, dans la plupart des séances d’imagerie avec un système multivue, le montage des échantillons est un processus fastidieux car les échantillons sont généralement préparés dans un tube en polymère. Pour faciliter ce processus, ce protocole décrit les stratégies de montage de base pour l’imagerie du développement précoce du poisson-zèbre entre les stades épibolique de 70 % et les premiers stades somite. Plus précisément, l’étude fournit des statistiques sur les différentes positions par défaut des embryons aux stades de 70 % de l’épibolie et du bourgeon dans le chorion. De plus, il traite du nombre optimal d’angles et de l’intervalle entre les angles requis pour imager des embryons entiers de poisson-zèbre aux premiers stades du développement afin que des informations à l’échelle cellulaire puissent être extraites en fusionnant les différentes vues. Enfin, étant donné que l’embryon couvre tout le champ de vision de la caméra, ce qui est nécessaire pour obtenir une résolution à l’échelle cellulaire, ce protocole détaille le processus d’utilisation des informations de billes situées au-dessus ou en dessous de l’embryon pour l’enregistrement des différentes vues.
Introduction
Garantir une phototoxicité minimale est une exigence majeure pour l’imagerie d’embryons vivants avec une résolution spatio-temporelle élevée pendant de longues périodes. Au cours de la dernière décennie, la microscopie à feuillet de lumière est devenue la méthodologie de choix pour répondre à cette exigence 1,2,3,4,5,6,7. Brièvement, dans cette technique qui a été utilisée pour la première fois en 2004 po....
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Protocole
Les procédures d’entretien et expérimentales du poisson-zèbre utilisées dans cette étude ont été approuvées par le comité d’éthique animale de l’établissement, voir les références TIFR/IAEC/2023-1 et TIFR/IAEC/2023-5. Des embryons obtenus par croisement de poissons hétérozygotes exprimant Tg(actb2 :GFP-Hsa.UTRN)19 ont été injectés avec l’ARNm H2A-mCherry (30 pg) au stade unicellulaire. L’ARNm H2A-mCherry a été synthétisé à l’aide du plasmide pCS2+ H2A-mCherry (un don du laboratoire Oates, EPFL) par transcription in vitro . Les embryons exprimant les deux marqueurs, appelés respectivement Utr-G....
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Résultats
L’orientation précise de l’échantillon est un élément essentiel de l’utilisation efficace d’un dispositif de microscopie. Cependant, l’orientation manuelle des échantillons n’est souvent pas possible lors de l’utilisation d’un système de feuille lumineuse à vues multiples, étant donné la nécessité de préparer les échantillons dans un tube. Par conséquent, pour vérifier s’il existe des positions stéréotypées que les embryons occupent dans le chorion, les embryons de poisson-zèbre ont été imagés à 70% d’épibolie (environ 7.......
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Discussion
Le positionnement d’un embryon dans la bonne orientation pour imager la région d’intérêt est l’une des étapes limitant le débit qui entraîne souvent l’échec d’une séance de microscopie pour un utilisateur. C’est d’autant plus le cas dans un microscope à feuillet de lumière multivue, où la manipulation manuelle de l’orientation est difficile car les échantillons sont intégrés dans un tube. Pour faciliter ce processus, cette étude rapporte les statistiques des différentes positions qu’un e.......
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Déclarations de divulgation
Les auteurs ne déclarent aucun intérêt concurrent.
Remerciements
Nous remercions le Dr Kalidas Kohale et son équipe pour l’entretien de l’installation piscicole et KV Boby pour l’entretien du microscope à feuillet de lumière. SRN remercie le ministère de l’Énergie atomique (DAE) du gouvernement de l’Inde (Project Identification no. RTI4003, DAE OM n° 1303/2/2019/R\&D-II/DAE/2079 du 11.02.2020), le programme du groupe de partenaires de la Société Max Planck (M.PG. A MOZG0010) et la bourse de recherche pour start-up du Conseil de recherches en sciences et en ingénierie (SSR/2023/001716).
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Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| Agarose, basse température de gélification | Sigma-Aldrich | A9414 | |
| Chlorure de calcium dihydraté | Sigma-Aldrich | 12022 | |
| FIJI | Version : ImageJ 1.54f | ||
| Billes de latex, polystyrène modifié au carboxylate, rouge fluorescent, 0,5 &mu ; m taille moyenne des particules, suspension aqueuse | Sigma-Aldrich | L3280 | |
| Sulfate de magnésium heptahydraté | Sigma-Aldrich | M2773 | |
| mMESSAGE mMACHINE SP6 Kit de transcription | ThermoFischer Scientific | AM1340 | Pour la transcription in vitro de H2A-mPlasmide de cerisier |
| Potassium Chhloride | Sigma-Aldrich | P9541 | |
| Phosphate de potassium monobasique | Sigma-Aldrich | P0662 | |
| Gaine en PTFE AWG 15L - 1,58 mm ID x 0,15 mm Paroi +/-0,05 ; | Adtech Innovations dans les fluoroplastiques | STW15 | Tubes PTFE |
| Chlorure de sodium | Sigma-Aldrich | S3014 | |
| Phosphate de sodium dibasique | Sigma-Aldrich | 71640 | |
| Nettoyeur à ultrasons | Labman | LMUC3 | Ultrasoniseur |
| Zeiss LightSheet 7 Système | Zeiss |
Références
- Wan, Y., McDole, K., Keller, P. J. Light sheet microscopy and its potential for understanding developmental processes. Annu Rev Cell Dev Biol. 35, 655-681 (2019).
- Keller, P. J., Schmidt, A. D., Wittbrodt, J., Stelzer, E. H. Reconstruction of....
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Réimpressions et autorisations
