A purificação de proteínas recombinantes de sistemas vegetais é geralmente desafiada por proteínas vegetais. Este trabalho fornece um método para extrair e purificar efetivamente uma proteína recombinante secretada do apoplasto de Nicotiana benthamiana.
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Artigo de método
Método baseado em extração de apoplastos para melhorar a pureza da proteína recombinante produzida pela planta
Neste artigo
Resumo
Resumo
As plantas são um sistema de expressão eucariótico em desenvolvimento que está sendo explorado para produzir proteínas terapêuticas. A purificação de proteínas recombinantes de plantas é uma das etapas mais críticas do processo de produção. Normalmente, as proteínas foram purificadas a partir de proteínas solúveis totais (TSP), e a presença de diversas proteínas intracelulares e citocromos apresenta desafios para as etapas subsequentes de purificação de proteínas. Além disso, a maioria das proteínas terapêuticas, como antígenos e anticorpos, são secretadas para obter glicosilação adequada, e a presença de proteínas incompletamente modificadas leva a estruturas inconsistentes de antígenos ou anticorpos. Este trabalho apresenta um método mais eficaz para obter proteínas recombinantes altamente purificadas do espaço apoplástico vegetal. A proteína fluorescente verde recombinante (GFP) é projetada para ser secretada no apoplasto de Nicotiana benthamiana e é então extraída usando um método de infiltração-centrifugação. O GFP-His do apoplasto extraído é então purificado por cromatografia de afinidade de níquel. Em contraste com os métodos tradicionais do TSP, a purificação do apoplasto produz proteínas recombinantes altamente purificadas. Isso representa uma importante melhoria tecnológica para os sistemas de produção vegetal.
Introdução
Atualmente, várias proteínas terapêuticas recombinantes produzidas em plantas estão em estudo, incluindo anticorpos, vacinas, proteínas bioativas, enzimas e pequenos polipeptídeos 1,2,3,4,5,6. As plantas estão se tornando uma plataforma cada vez mais utilizada para a produção de proteínas terapêuticas devido à sua segurança, baixo custo e capacidade de escalar rapidamente a produção 7,8. A expressão e modificação d....
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Protocolo
1. Preparação de plantas de N. benthamiana
- Coloque os blocos de mudas em uma bandeja, adicione 1 L de água e deixe de molho por aproximadamente 2 h até saturar totalmente.
- Polvilhe uniformemente sementes de N. benthamiana do tipo selvagem nos blocos de mudas, cubra com uma tampa e germine por 1 semana. Cultive N. benthamiana em estufa com fotoperíodo de 18 h, 24 °C, 45% de umidade relativa e fertilize a cada 2 semanas.
- Depois que as sementes germinarem, use uma pinça para remover suavemente uma muda, tomando cuidado para não causar danos às raízes. Cave um peque....
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Resultados
GFP-His é alvo de secreção no espaço apoplástico de N. benthamiana
A GFP foi clonada no plasmídeo pCAMBIA1300 com um peptídeo sinal N-terminal PR1a para secreção e um His-tag C-terminal para purificação, gerando p35s-PR1a-GFP-His (Figura 1A). A proteína recombinante foi expressa transitoriamente em N. benthamiana e uma banda de 30 kDa foi detectada por western blot usando anticorpo anti-His 3 dias após a agroinfiltração (
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Discussão
O uso de plantas para produzir proteínas terapêuticas expandiu-se rapidamente nos últimos anos 1,2,3,4,5,6. Os genes codificadores de proteínas são clonados em vetores de expressão e entregues aos tecidos vegetais por meio de agroinfiltração. Após a produção por células vegetais, as proteínas são purificadas para aplicações a.......
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Divulgações
Os autores declaram não haver conflito de interesses.
Agradecimentos
Este trabalho é apoiado pela Associação de Promoção da Inovação Juvenil CAS (2021084) e pelo Fundo de Apoio ao Projeto de Implantação Chave do Plano de Ação Trienal do Instituto de Microbiologia da Academia Chinesa de Ciências.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| 100 fios de malha fina de nylon | Guangzhou Huayu Trading limited company | hy-230724-2 | Para extração de proteína AWF |
| de centrífuga de 50 ml | Vazyme | TCF00150 | Para centrífuga |
| ClonExpress II kit de clonagem de uma etapa | Vazyme | C112-02 | Para clone |
| FastDigest Sac1 | NEB | R3156S | Para clone |
| FastDigest XbaI | NEB | FD0685 | Para clone |
| ImageJ 1.5.0 | / | /Para | análise em escala de cinza |
| Filtro grande | Thermo Fisher | NEST | Para filtragem |
| Microscopia confocal de varredura a laser | Leica SP8 | Para localização subcelular | |
| Ni sepharose excel | Cytiva | 10339806 | Para purificação de proteínas |
| Proteína pré-fabricada mais gel | YEASEN | 36246ES10 | Para SDS-PAGE |
| Filtro pequeno | Nalgene | 1660045 | Para filtragem |
| Kit de teste de substrato SuperSignal West Femto | Thermo Fisher | 34076 | Para western blotting |
| Triton X-100 | SCR | 30188928 | Para configurar o tampão de extração |
| Tipo bomba de vácuo rotaryvang | Zhejiang taizhouqiujing bomba de vácuo empresa | limitada2XZ-2 | Para infiltração a vácuo |
| Misturador vertical | Haimen Qilinbel Instrument Manufacturing empresa limitada | BE-1200 | Para mistura |
| β-mercaptoetanol | SIGMA | BCBK8223V | Para configurar o tampão de extração |
Referências
- Zahmanova, G., et al. Green biologics: Harnessing the power of plants to produce pharmaceuticals. Int J Mol Sci. 24 (24), 1757(2023).
- PREVAIL II Writing Group. A randomized, controlled trial of ZMapp for Ebola virus infection. N Engl J Med. 37....
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Reimpressões e permissões
