Questo lavoro spiega come trasformare i mitocondri del lievito utilizzando un metodo biolistico. Mostriamo anche come selezionare e purificare i trasformanti e come introdurre la mutazione desiderata nella posizione target all'interno del genoma mitocondriale.
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Articolo metodologico
Trasformazione mitocondriale in Baker
* These authors contributed equally
In questo articolo
Sommario
Abstract
Il lievito di birra Saccharomyces cerevisiae è stato ampiamente utilizzato per decenni per comprendere la biologia mitocondriale. Questo modello ha fornito conoscenze sulle vie mitocondriali essenziali e conservate tra gli eucarioti e sulle vie specifiche dei funghi o dei lieviti. Una delle molte capacità di S. cerevisiae è la capacità di manipolare il genoma mitocondriale, che finora è possibile solo in S. cerevisiae e nelle alghe unicellulari Chlamydomonas reinhardtii. La trasformazione biolistica dei mitocondri del lievito ci permette di introdurre mutazioni sito-dirette, effettuare riarrangiamenti genici e introdurre reporter. Questi approcci sono utilizzati principalmente per comprendere i meccanismi di due processi altamente coordinati nei mitocondri: la traduzione da parte dei mitoribosomi e l'assemblaggio di complessi respiratori e ATP sintasi. Tuttavia, la trasformazione mitocondriale può potenzialmente essere utilizzata per studiare altri percorsi. Nel presente lavoro, mostriamo come trasformare i mitocondri del lievito mediante bombardamento di microproiettili ad alta velocità, selezionare e purificare il trasformante desiderato e introdurre la mutazione desiderata nel genoma mitocondriale.
Introduzione
Il lievito Saccharomyces cerevisiae è un modello ampiamente riconosciuto utilizzato per studiare la biogenesi mitocondriale. Poiché il lievito è un organismo anaerobio e facoltativo, è possibile studiare ampiamente le cause e le conseguenze dell'introduzione di mutazioni che compromettono la respirazione. Inoltre, questo organismo possiede strumenti genetici e biochimici amichevoli per studiare le vie mitocondriali. Tuttavia, una delle risorse più potenti per esplorare i meccanismi dell'assemblaggio dei complessi respiratori e della sintesi proteica mitocondriale è la capacità di trasformare i mitocondri e modificare il genoma dell'organello. In precedenza, è....
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Protocollo
NOTA: Si consiglia di effettuare sei trasformazioni per ogni costrutto poiché l'efficienza della trasformazione mitocondriale è solitamente bassa. La composizione dei diversi mezzi di crescita è mostrata nella Tabella 2.
1. Preparazione delle particelle di tungsteno
- Pesare 30 mg di particelle di tungsteno da 0,7 μm (WP, microcarrier) in una microprovetta. Aggiungere 1,5 ml di etanolo al 70% (EtOH) per sterilizzare. Agitare i WP e lasciarli riposare per 10 minuti a temperatura ambiente.
- Centrifugare a 13.200 x g per 15 min a temperatura ambiente. Lavare i WP aggiungendo 1,5 ml di....
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Risultati
Questa sezione presenta alcuni risultati rappresentativi delle diverse fasi della trasformazione mitocondriale. La Figura 6 mostra una procedura di bombardamento. Le cellule rho- sintetiche portavano un plasmide batterico con il gene reporter ARG8m, che sostituirà la sequenza codificante di un gene mitocondriale (Figura 6A). Dopo il bombardamento, la placca è stata replicata su un mezzo privo di uracile (-URA); questa è la .......
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Discussione
Il presente lavoro descrive come trasformare con successo i mitocondri dal lievito S. cerevisiae. Il processo, dal bombardamento di microproiettili ad alta velocità fino alla purificazione del ceppo di lievito previsto, richiede ~8-12 settimane, a seconda di quanti cicli di purificazione del ceppo sintetico di rho- sono necessari. Alcuni dei passaggi critici del metodo sono i seguenti. In primo luogo, più grandi sono le regioni fiancheggianti aggiunte intorno al sito di mutazione nel costrutto genico .......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno conflitti di interesse da rivelare.
Ringraziamenti
Questa pubblicazione è stata sostenuta da Programa de Apoyo a Proyectos de Investigación e Innovación Tecnológica (PAPIIT), UNAM [IN223623 a XP-M]. UPD è un borsista CONAHCYT (CCU:883299). Vogliamo ringraziare la dottoressa Ariann Mendoza-Martínez per l'aiuto tecnico con le immagini del microscopio ottico. Licenze Biorender: DU26OMVLUU (Figura 2); BK26TH9GXH (Figura 3); GD26TH80R5 (Figura 4); PU26THARYD (Figura 7); ML26THAIFG (Figura 9).
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Puntali per pipette da 1 mL | Axygen | T-1000-B | |
| Microprovetta da 1,5 mL | Axygen | MCT-150-C | |
| 10 μ L puntali per pipette | Axygen | T-10-C | |
| 15 mL provetta a fondo conico | Axygen | SCT-25ML-25-S | |
| 200 μ L puntali per pipette | Axygen | T-200-Y | |
| 50 mL fondo conico provetta | Axygen | SCT-50ML-25-S | |
| AfiII | New England BioLabs | R0520S | |
| Agarose | SeaKem | 50004 | |
| Bilancia analitica | OHAUS | ARA520 | |
| Autoclave | TOMY | ES-315 | |
| Bacto agar | BD | 214010 | |
| Bacto peptone | BD | 211677 | |
| Supporto per macrocarrier biolisitico | BIO-RAD | 1652322 | |
| Bruciatore Bunsen | VWR | 89038-528 | |
| Cloruro di calcio | Fisher Scientific | C79-500 | |
| CSM -ADE | Formedium | DCS0049 | |
| CSM -ARG | Formedium | DCS0059 | |
| CSM -LEU | Formedium | DCS0099 | |
| CSM -URA | Formedium | ||
| Pallone di vetro per colture | KIMAX KIMBLE | 25615 | |
| Tubo di vetro per colture | Pyrex | 9820 | |
| Destrosio | BD | 215520 | |
| Etanolo | JT Baker | 9000 | |
| Pinze | Millipore | 620006 | |
| Perle di vetro | Sigma | Z265926 | |
| Manico in vetro | Sigma | S4647 | |
| Glicerolo | JT BAKER | 2136-01 | |
| Serbatoio di elio grado 5 (99,99 %) | - | - | |
| HSTaq Kit | PCR BIO | ||
| Microcentrifuga | Eppendorf | 022620100 | |
| NdeI | New England BioLabs | R0111L | |
| Agitatore orbitale | New Brunswick scientific | NB-G25 | |
| Provette per PCR | Axygen | PCR-02-C | |
| PDS-1000/He TM Sistema di somministrazione di particelle biolistiche | BIO-RAD | 165-2257 | |
| Piastre di Petri (100X10) | BD | 252777 | |
| QIAprep Spin Miniprep | Qiagen | 27106 | |
| Raffinose | Formedium | RAF03 | |
| Replica plater | Scienceware | Z363391 | |
| Dischi di rottura 1350 Psi | BIO-RAD | 1652330 | |
| Sorbitolo | Sigma | S7547 | |
| Spermidina | Sigma | S0266 | |
| T4 DNA Ligasi | Thermo Scientific | EL0011 | |
| Rotatore per colture tissutali | Thermo Scientific | 88882015 | |
| Microcarrier di tungsteno M10 | BIO-RAD | 1652266 | |
| Pompa per vuoto con capacità di 100 l/min | - | ||
| Cuscinetti in velluto | Bel-Art | H37848-0002 | |
| Vortice | Scientifc Industries | SI-0236 | |
| Bastone per aplicativi in legno | PROMA | 1820060 | |
| Estratto di lievito | BD | 212750 | |
| Lievito a base azotata senza aminoacidi | BD | 291920 |
Riferimenti
- Bonnefoy, N., Fox, T. D. In vivo analysis of mutated initiation codons in the mitochondrial COX2 gene of Saccharomyces cerevisiae fused to the reporter gene ARG8m reveals lack of downstream reinitiation. Mol Gen Genet. 262 (6), 1036-1046 (2000).
- Franco, L. V. R., Su, C. H., McStay, G. P., Yu, G. J., Tzagoloff, A.
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Ristampe e permessi
