Demonstração do Transporte de Membrana de Histidina usando Sacos Invertidos de Intestino de Cabra: Uma Ferramenta Pedagógica Experiencial para Alunos de Graduação
Summary
Aqui, relatamos um método barato e reprodutível que demonstra o transporte de histidina por membrana em um intestino de cabra. Esse processo ocorre pelo co-transporte de íons histidina e sódio possibilitados pelo gradiente de sódio através da membrana do enterócito. Este método explora a pedagogia da aprendizagem experiencial para entender melhor o movimento do soluto através das membranas biológicas.
Abstract
A histidina é um aminoácido essencial que também é um precursor de metabólitos implicados no sistema imunológico, ventilação pulmonar e circulação vascular. A absorção da histidina dietética depende em grande parte do transporte de aminoácidos neutros acoplados ao sódio pelo transportador de aminoácidos neutros largos (B0AT) presente na membrana apical do enterócito. Aqui, demonstramos a absorção de histidina pelos enterócitos das vilosidades intestinais a partir do lúmen usando sacos invertidos jejunais de cabra. Os sacos jejunais expostos a concentrações variáveis de sódio e histidina foram testados para determinar a concentração de histidina no interior dos sacos em função do tempo. Os resultados mostram absorção ativa de histidina. O aumento da concentração de sal resultou em maior absorção de histidina, sugerindo um sporte de absorção de sódio e histidina nos sacos invertidos intestinais de cabras. Este protocolo pode ser aplicado para visualizar a mobilidade intestinal de aminoácidos ou outros metabólitos com modificações apropriadas. Propomos este experimento como uma ferramenta pedagógica experiencial que pode ajudar os alunos de graduação a compreender o conceito de transporte de membrana.
Introduction
As células biológicas são circundadas por uma bicamada lipídica de membrana que separa o citosol intracelular do conteúdo extracelular. A membrana serve como uma barreira semipermeável que regula o movimento dos solutos1. O transporte através das membranas biológicas é afetado pelo coeficiente de permeabilidade de um soluto, que depende de vários fatores, incluindo a concentração e a carga do soluto. Em geral, os solutos se movem através da membrana usando três mecanismos (Figura 1): difusão passiva, difusão facilitada e transporte ativo2. A difusão simples é o processo pelo qual solutos solúveis, não carregados e apolares passam por seu gradiente de concentração através de uma membrana semipermeável (Figura 1A). As proteínas de membrana não auxiliam nesse processo, pois envolve o movimento de solutos de uma região de maior concentração para uma região de menor concentração. A taxa de difusão é baseada na Lei de Fick3. Por outro lado, a difusão facilitada é um transporte dependente de proteínas em que a membrana permite que apenas solutos seletivos passem por um gradiente de concentração sem o gasto de energia (Figura 1B). Este tipo de transporte é específico e difere da difusão simples por exibir cinética de saturação.
O transporte ativo é um transporte dependente de proteínas de moléculas contra seu gradiente de concentração, ou seja, da região de menor concentração para uma região de maior concentração com o uso de ATP ou gradientes de íons (Figura 1C). Quando o transportador hidrolisa ATP, o transporte é denominado transporte ativo primário (Figura 1C; painel esquerdo). Outra forma de transporte ativo é o transporte ativo secundário (Figura 1C; painel direito). No transporte ativo secundário, os solutos são movidos com base em um gradiente eletroquímico. Ocorre quando uma proteína transportadora acopla o movimento de um íon (normalmente Na+) em seu gradiente de concentração com o movimento de outra molécula ou um íon contra seu gradiente de concentração. Esse tipo de movimento de soluto pode ser um co-transporte (Symport) em que tanto o soluto quanto o íon se movem na mesma direção ou uma troca (Antiport), caso em que o soluto e o íon se movem em direções opostas.
Os aminoácidos e monossacarídeos dietéticos de fontes alimentares são absorvidos no intestino delgado. O intestino delgado pode ser funcionalmente dividido em três segmentos: Duodeno, Jejuno e Íleo (Figura 2). A absorção do soluto ocorre em todo o intestino delgado, com a absorção máxima ocorrendo no jejuno e na extremidade proximal do íleo. Os enterócitos intestinais são células polarizadas e as junções apertadas que conectam duas células adjacentes criam dois locais de membrana distintos – o basolateral e o local da membrana apical (Figura 2). A absorção de solutos luminais gerados pela digestão ocorre no local da membrana apical4.
O transporte de histidina nos enterócitos intestinais na membrana apical é um exemplo de um sporte ativo secundário dependente de sódio. Na extremidade basolateral, a histidina que entra no enterócito desce o gradiente de concentração até a circulação portal hepática. As concentrações intracelulares de sódio no interior do enterócito são mantidas em 12 mmoles/L1, o que é menor do que as concentrações extracelulares/luminais, devido ao bombeamento ativo de sódio para fora da célula pela Na+ K+ATPase localizada na membrana basolateral (Figura 3). Na membrana apical dos enterócitos, o AT B0e o transportador de aminoácidos neutros em sódio (SNAT) 5 são os principais transportadores que transportam não apenas histidina, mas também aminoácidos como asparagina e glutamina em um cotransporte dependente de sódio 5,6. Outra proteína de transporte chamada Large Amino Acid Transporter (LAT)1 presente na membrana basolateral dos enterócitos transporta grandes aminoácidos neutros, como leucina, triptofano, tirosina e fenilalanina, através da membrana7.
Com o objetivo de ensinar o conceito de transporte de membranas integrado a técnicas como espectrofotometria e ensaios bioquímicos de rotina por meio da pedagogia da aprendizagem experiencial, é imperativo desenvolver metodologias que possam não apenas demonstrar o conceito em termos fáceis de entender, mas também possibilitar a aprendizagem participativa para alunos de graduação. Atualmente, existem recursos limitados disponíveis para os alunos para envolvimento prático para aprender esses conceitos de bioquímica. Aqui, relatamos um protocolo simples para demonstrar o transporte de histidina através da membrana intestinal de cabra que é fácil de reproduzir em laboratórios de graduação e pode ser adaptado para avaliar o transporte de outros metabólitos também. Mais importante, o método utiliza materiais baratos em um laboratório de graduação, permitindo assim o aprendizado experimental até mesmo nos ambientes de laboratório mais simples.
Protocol
Representative Results
Discussion
O transporte por membrana é um dos conceitos mais fundamentais ensinados a estudantes de graduação de todas as principais disciplinas de ciências biológicas, básicas ou aplicadas. Tradicionalmente, o movimento através das membranas tem sido visualizado usando metabólitos marcados com isótopos radioativos. No entanto, esses métodos são extremamente perigosos e inviáveis para o ensino ou aprendizagem. Embora a aprendizagem experiencial seja a melhor técnica pedagógica para en…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este estudo foi apoiado pelo Departamento de Bioquímica do Sri Venkateswara College, Universidade de Delhi. Os autores agradecem à equipe do laboratório por seu apoio.
Materials
| 1.5 mL Microcentrifuge Tubes | TARSONS | 500020 | |
| 10 mL Test Tubes | BOROSIL | 9800U04 | |
| 50 mL Sterile Falcon Tubes | TARSONS | 546041 | |
| 500 mL Beaker | BOROSIL | 10044977 | |
| 500 mL Conical Flask | BOROSIL | 691467 | |
| D-Glucose | SRL | 42738 | |
| Digital Spectrophotometer | SYSTRONICS | 2710 | |
| Ethanol | EMSURE | 1009831000 | |
| Finpipettes | THERMOFISHER | 4642090 | |
| Glass Stirrer Rod | BOROSIL | 9850107 | |
| L-Histidine | SRL | 17849 | |
| NaCl | SRL | 41721 | |
| Nitrile Gloves | KIMTECH | 112-4847 | |
| Petri Dish | TARSONS | 460090 | |
| Phosphate Buffered Saline (ph 7.4) | SRL | 95131 | |
| Pipette Tips | ABDOS | P10102 | |
| Sodium Carbonate | SRL | 89382 | |
| Sodium Nitrate | SRL | 44618 | |
| Sodium Phosphate Dibasic (anhydrous) | SRL | 53046 | |
| Sodium Phosphate Monobasic (anhydrous) | SRL | 22249 | |
| Sulphanilic Acid | SRL | 15354 |
References
- Nelson, D. L., Cox, M. M. . Lehninger Principles of Biochemistry. , (2017).
- Stillwell, W. Membrane Transport. An Introduction to Biological Membranes. , (2013).
- Fick, A. V. On liquid diffusion. The London, Edinburgh, and Dublin Philosophical Magazine and Journal of Science. 10 (63), 30-39 (1855).
- Sherwood, L. . Introduction to Human Physiology. , (2013).
- Bröer, S. Intestinal amino acid transport and metabolic health. Annu Rev Nutr. 43, 73-99 (2023).
- Avissar, N. E., Ryan, C. K., Ganapathy, V., Sax, H. C. Na+-dependent neutral amino acid transporter ATB0 is a rabbit epithelial cell brush-border protein. Am J Physiol Cell Physiol. 281 (3), C963-C971 (2001).
- Bröer, S. Amino acid transport across mammalian intestinal and renal epithelia. Physiol Rev. 88 (1), 249-286 (2008).
- Agar, W. T., Hird, F. J. R., Sidhu, G. S. The uptake of amino acids by the intestine. BBA – Biochim Biophys Acta. 14 (1), 80-84 (1954).
- Pauly, H. Über die Konstitution des Histidins: I. Mitteilung. Biological Chemistry. 42 (5-6), 508-518 (1904).
- Wilson, T. H., Wiseman, G. The use of sacs of everted small intestine for the study of the transference of substances from the mucosal to the serosal surface. J Physiol. 123 (1), 116-125 (1954).
- Barthe, L., Woodley, J. F., Kenworthy, S., Houin, G. An improved everted gut sac as a simple and accurate technique to measure paracellular transport across the small intestine. Eur J Drug Metab Pharmacokinet. 23 (2), 313-323 (1998).
- Alam, M. A., Al-Jenoobi, F. I., Al-Mohizea, A. M. Everted gut sac model as a tool in pharmaceutical research: Limitations and applications. J Pharm Pharmacol. 64 (3), 326-336 (2012).
- Pento, J. T., Mousissian, G. K. Time-dependent deterioration of active transport in duodenal segments of rat intestine. J Pharmacol Methods. 20 (1), 9-14 (1988).
- Williams, L., Sembiante, S. F. Experiential learning in U.S. undergraduate teacher preparation programs: A review of the literature. Teach Teach Educ. 112, 103630 (2022).
