استخدمنا تلطيخ تكاثر الخلايا لتحديد الخلايا الهادئة في نموذج سرطان الدم الليمفاوي الحاد T-zebrafish. يتم الاحتفاظ بالبقعة في الخلايا غير المنقسمة وتقليلها أثناء تكاثر الخلايا ، مما يتيح اختيار الخلايا الخاملة لمزيد من الاستجواب. يوفر هذا البروتوكول أداة وظيفية لدراسة التجديد الذاتي في سياق السكون الخلوي.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
تحديد الخلايا الهادئة في نموذج سرطان الدم الليمفاوي الحاد في الخلايا التائية الزرد باستخدام تلطيخ تكاثر الخلايا
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
السكون الخلوي هو حالة توقف النمو أو تباطؤ الانتشار الموصوف في الخلايا الجذعية الطبيعية والسرطانية (CSCs). قد يحمي الهدوء الخلايا الجذعية السرطانية من أدوية العلاج الكيميائي المضادة للتكاثر. في نماذج الفئران المصابة بابيضاض الدم الليمفاوي الحاد للخلايا التائية (T-ALL) المشتقة من المريض (PDX) ، ترتبط الخلايا الهادئة بمقاومة العلاج والجذع. أصباغ تكاثر الخلايا هي أدوات شائعة لتتبع انقسام الخلايا. ترتكز صبغة الفلورسنت تساهميا في مجموعات الأمين على الغشاء والجزيئات الكبيرة داخل الخلية. يسمح هذا بتتبع الخلايا المصنفة لما يصل إلى 10 أقسام ، والتي يمكن حلها عن طريق قياس التدفق الخلوي.
في النهاية ، سيكون للخلايا ذات أعلى معدلات الانتشار احتفاظ منخفض بالصبغة ، حيث سيتم تخفيفها مع كل انقسام خلوي ، في حين أن الخلايا الخاملة ذات الانقسام البطيء سيكون لها أعلى احتفاظ. تم تحسين استخدام أصباغ تكاثر الخلايا لعزل الخلايا الخاملة ووصفها في نماذج الماوس T-ALL. استكمالا لنماذج الفئران الحالية ، يوفر نموذج T-ALL المشتق من rag2: Myc مكانا ممتازا لاستجواب التجديد الذاتي في T-ALL بسبب التردد العالي للخلايا الجذعية اللوكيمية (LSCs) وراحة الزرد لتجارب الزرع واسعة النطاق.
هنا ، نصف سير العمل لتلطيخ خلايا الزرد T-ALL بصبغة تكاثر الخلايا ، وتحسين تركيز الصبغة لخلايا الزرد ، وتمرير الخلايا الملطخة بنجاح في الجسم الحي ، وجمع الخلايا بمستويات متفاوتة من الاحتفاظ بالصبغة عن طريق فرز الخلايا الحية من المزروعة. نظرا لعدم وجود صانعي أسطح خلايا راسخين ل LSCs في T-ALL ، يوفر هذا النهج وسيلة وظيفية لاستجواب الخلايا الهادئة في الجسم الحي. للحصول على نتائج تمثيلية ، نصف كفاءة النقش وتردد LSC للخلايا ذات الاحتفاظ بالصبغة العالية والمنخفضة. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في التحقق من الخصائص الإضافية للخلايا الهادئة ، بما في ذلك الاستجابة للأدوية ، وملفات تعريف النسخ ، والتشكل.
المقدمة
الخلايا الجذعية البالغة هي المسؤولة عن تجديد أنواع الخلايا المتمايزة في عضو معين وهي موجودة في الغالب في حالة نائمة وغير مقسمة 1,2. على سبيل المثال ، تظل الخلايا الجذعية المكونة للدم (HSCs) ، التي تحافظ على الدم ، هادئة إلى حد كبير ، ولا يدخل سوى جزء صغير دورة الخلية للتجديد الذاتي أو التمايز لتوليد مكونات دم ناضجة3. وبالمثل ، في السرطانات ، تمتلك مجموعة فرعية نادرة من الخلايا تسمى الخلايا الجذعية السرطانية (CSCs) القدرة على التجديد الذاتي وهي مسؤولة عن الحفاظ على الورم الخبيث على المدى الطويل4. توجد الخلايا الجذعية السرطانية
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
في هذا البروتوكول ، نستخدم خلايا T-ALL التي تحمل علامة GFP والتي تم إنشاؤها مسبقا في سلالة CG1 وبالتالي يمكن حقنها مباشرة في الزرد CG1 المتلقي15. باختصار ، تم إنشاء سرطان الدم عن طريق الحقن المجهري للحمض النووي من rag2: Myc و rag2: GFP في أجنة الزرد CG1 أحادية الخلية. تمت مراقبة لتطور سرطان الدم بدءا من 3 أسابيع بعد الحقن ، باستخدام الفحص المجهري الفلوري. تم عزل خلايا ابيضاض الدم الإيجابية ل GFP FACS وزرعها بشكل متسلسل في سمك الزرد CG1 المتلقي لتوليد استنساخ بتردد عال من LSC. تم وصف تفاصيل البروتوكول بأكمله بواسطة Blackburn et al.15.
بدلا من ذلك ، يمكن إنشاء rag2: T-ALL
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
لقد اتبعنا البروتوكول الموصوف أعلاه لفرز الخلايا التي احتفظت بصبغة تكاثر الخلايا ، CT-FR ، واستخدمناها لمقايسة التخفيف المحدد (LDA) لتقدير تردد LSC في مجموعات CT-FR العالية و CT-FR المنخفضة. لضبط البوابة لتجربة قياس التدفق الخلوي ، استخدمنا عنصر تحكم بدون فلوروفور (بدون لون) بالإضافة إلى عناصر تحكم أحادية اللون (الشكل 2 أ). تم استخدام هذه الأرباع لتحديد المجموعات الإيجابية والسلبية FITC و PE لإعداد بوابات الفرز. تم تحضير التحكم الإيجابي أحادي اللون CT-FR في نفس يوم الفرز عن .......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
من المعروف أن LSCs مقاومة للعلاجات الكيميائية التقليدية المضادة للتكاثر ، وإيجاد علاجات مستهدفة ضد هذه الخلايا يحمل وعدا كبيرا في الحد من حدوث الانتكاس وتحسين تشخيص المريض20. وصفت الأبحاث السابقة استخدام بقع تكاثر الخلايا الفلورية لتحديد مجموعة صغيرة من الخلايا الهادئة المرتبطة بمقاومة الأدوية والجذع في نماذج T-ALLPDX 13. في هذا العمل ، نصف استخدام صبغة تكاثر خلايا مماثلة لحل الخلايا بطيئة الانقسام أو الهادئة في نموذج الزرد من T-ALL. استخدم.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
ليس لدى المؤلفين أي تضارب في المصالح للكشف عنه.
شكر وتقدير
تم توفير التمويل لهذا البحث من قبل المعهد الوطني للسرطان (R37CA227656 إلى JSB). تم دعم هذا البحث أيضا من قبل الموارد المشتركة لقياس التدفق الخلوي ومراقبة المناعة لمركز السرطان بجامعة كنتاكي ماركي (P30CA177558).
....الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| 26 جم / 2 "حقنة صغيرة | هاميلتون | 87930 | NA |
| 35 & مايكرو; م غطاء مرشح أنابيب FACS | Falcon | 352235 | NA |
| 40 & micro ؛ مصفاة خلية m | CELLTREAT | 229482 | NA |
| 96 بئر لوحة PCR | Thermo Fisher Scientific | AB0800 | NA |
| Cell فارز | Sony Biotechnology | SY3200 | NA |
| CellTrace Far Red | Thermo Fisher Scientific | C34564 | NA |
| الأنابيب المخروطية | VWR | 10026-078 | NA |
| DAPI | ثيرمو فيشر العلمي | 62248 | NA |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D4818 | NA |
| Dulbecco's محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS) | مختبرات Caisson | 22110001 | NA |
| مجهر ستيريو epifluorescence | نيكون | SMZ25 | NA |
| مصل الأبقار الجنينية (FBS) | Sigma-Aldrich | 12306C | NA |
| نظام الأسماك المياه | N / A | N / A | 0.03-0.05٪ ملوحة ، درجة الحموضة 6.5-8 ، مخزنة بأنابيب أجهزة الطرد المركزي الدقيقة لبيكربونات الصوديوم |
| Thermo Fisher Scientific | C2171 | NA | |
| MS-222 | Pentaire | TRS-1 | tricaine mesylate ، أطباق مخدر |
| بتري | Corning | 07-202-011 | NA |
| شفرات الحلاقة | الأمريكية الخط | 66-0089 | NA |
| Trypan Blue | Thermo Fisher العلوم | T10282 | NA |
المراجع
- Reya, T., Morrison, S. J., Clarke, M. F., Weissman, I. L. Stem cells, cancer, and cancer stem cells. Nature. 414 (6859), 105-111 (2001).
- Arai, F., et al. Tie2/angiopoietin-1 signaling regulates hematopoietic stem cell quiescence in the bone marrow niche. Cell.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
