Isolement mitochondrial robuste à partir de tissu cardiaque de rongeur

Résumé

Des études bioénergétiques et métabolomiques sur les mitochondries ont révélé leur rôle multiforme dans de nombreuses maladies, mais les méthodes d’isolement de ces organites varient. La méthode détaillée ici est capable de purifier des mitochondries de haute qualité à partir de plusieurs sources tissulaires. La qualité est déterminée par les rapports de contrôle respiratoire et d’autres paramètres évalués à l’aide de la respirométrie à haute résolution.

Résumé

L’isolement mitochondrial est pratiqué depuis des décennies, suivant des procédures établies par des pionniers dans les domaines de la biologie moléculaire et de la biochimie pour étudier les déficiences métaboliques et les maladies. Une qualité mitochondriale constante est nécessaire pour étudier correctement la physiologie mitochondriale et la bioénergétique ; Cependant, de nombreuses méthodes d’isolement publiées sont disponibles pour les chercheurs. Bien que différentes stratégies expérimentales nécessitent des méthodes d’isolement différentes, les principes et procédures de base sont similaires. Ce protocole détaille une méthode capable d’extraire des mitochondries bien couplées à partir de diverses sources tissulaires, y compris de petits animaux et des cellules. Les étapes décrites comprennent la dissection d’organes, la purification mitochondriale, la quantification des protéines et divers contrôles de qualité. La principale mesure de contrôle de la qualité utilisée pour identifier les mitochondries de haute qualité est le rapport de contrôle respiratoire (RCR). Le RCR est le rapport entre la fréquence respiratoire lors de la phosphorylation oxydative et la fréquence en l’absence d’ADP. D’autres indicateurs sont abordés. Bien que des valeurs RCR élevées par rapport à leur source tissulaire soient obtenues à l’aide de ce protocole, plusieurs étapes peuvent être optimisées pour répondre aux besoins individuels des chercheurs. Cette procédure est robuste et a toujours abouti à des mitochondries isolées avec des valeurs RCR supérieures à la moyenne dans les modèles animaux et les sources tissulaires.

Introduction

Les mitochondries sont des organites subcellulaires qui établissent des conditions énergétiques cytoplasmiques optimisées pour des fonctions cellulaires spécifiques. Alors que les études cellulaires, tissulaires et organisationnelles peuvent fournir des informations sur la fonction mitochondriale, l’isolement des organites offre un niveau de contrôle expérimental qui n’est pas possible autrement. Des isolements mitochondriaux sont effectués depuis les années 1940, ce qui permet d’étudier mécaniquement le métabolisme et la respiration dans une variété de cellules et de tissus ^1,2

Protocole

L’utilisation et le traitement de tous les animaux vertébrés ont été effectués conformément aux protocoles approuvés examinés et acceptés par le Comité institutionnel de soin et d’utilisation des animaux (IACUC) de l’Université d’État du Michigan. Ce protocole a été conçu à l’aide de cobayes Hartley albinos mâles et femelles et de rats Sprague Dawley (SD). Pour l’isolement des mitochondries cardiaques de cobayes, des animaux ont été sacrifiés à des âges compris entre 4 et 6 semaines (300 à 450 g). Des mitochondries cardiaques de rats SD des deux sexes ont été obtenues entre l’âge de 10 et 13 semaines (250 à 400 g). Les recettes de tam....

Résultats

Une fois l’isolement mitochondrial terminé, la qualité et la fonctionnalité des isolats doivent être testées en quantifiant les taux de consommation d’oxygène (J_O2) à l’aide d’une respirométrie à haute résolution. Pour ce faire, les stocks mitochondriaux ont été dilués à 40 mg/mL pour permettre des concentrations de travail de 0,1 mg/mL dans 2 mL de RB pour tous les tests de respirométrie utilisant des mitochondries cardiaques isolées. La respiration a été alimentée par 5 mM de pyruvate de sodium et 1.......

Discussion

Le respect des méthodes décrites de manière concise dans ce protocole garantira l’isolement des mitochondries bien couplées du tissu cardiaque de petits rongeurs, en plus d’autres types et sources de tissus. Dans l’ensemble, le processus devrait durer de 3 à 3,5 heures, au cours desquelles tous les tissus animaux, les échantillons et les isolats devraient rester sur la glace à 4 °C autant que possible pour limiter la dégradation. Cette procédure est robuste et peut être modifiée de plusi.......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
			de microcentrifugation de 1,7 mL
Bécher			Pour la dsection et le hachage d’organes Tubes
centrifugation Centrifugation
Adénosine 5'-diphosphate sel monopotassique dihydraté	Sigma  ;	A5285	Dosages de respirométrie
BSA Kit de dosage des protéines Thermo	Scentific	PI23225	Quantification des protéines mitochondriales
Dextrose	Sigma  ;	DX0145	Pour tampon (CB)
Éthylène glycol-bis(2-amino-éthylétre)-N,N,N',N'-acide tétraacétique  ;	Sigma  ;	E4378	Pour les tampons (CB et IB) et les tests de respirométrie
Canule en verre	Radnoti		Perfusion cardiaque de cobaye et de rat
Héparine sodique muqueuse porcine	Sigma  ;	SRE0027-250KU	Injection IP animale
Respiromètre			Électrode de type Clark ; oxygraphe avec chambres de 2 mL
Chambre d’induction
Isoflurane	Sigma  ;	792632	Anesthésique  ;
Acide L-malique	Sigma  ;	02288-50G	Dosages de respirométrie
Chlorure de magnésium hexahydraté	Sigma  ;	M9272	Pour tampon (RB)
Mannitol	Sigma  ;	MX0214	Pour tampon (IB)
Seringues			d’un microlitre Tailles allant de 5&ndash ; 50 et micro ; L
Lecteur			Doit pouvoir incuber à 37 ° ; C  ;
MOPS	Sigma  ;	475898	Pour tous les tampons
O2 réservoir
OMNI THQ Homogénéisateur	OMNI International  ;	12-500	Des homogénéisateurs à rotor et stator similaires peuvent faire fonctionner
des pipettes			Volumes de  ; 2&ndash ; 20 et micro ; L; 20&ndash ; 200 et micro ; L; 200&ndash ; 1000 et micro ; L
Chlorure de potassium	Sigma  ;	P3911	Pour tampons (RB et CB)
Phosphate de potassium dibasique	Sigma  ;	795496	Pour tampons (IB et RB)
Protéase de Bacillus licheniformis	Sigma  ;	P5459
Chlorure de sodium	Sigma  ;	S9888	Pour tampon (CB)
Pyruvate de sodium	Fisher bioréactifs	BP356-100	Dosages
Saccharose	Sigma  ;	8510-OP	Pour tampon (IB)
		dissection chirurgicale	Dépend de la source animale et tissulaire
Centrifugeuse			Doit refroidir à 4 ° ; C  ;

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