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Artigo de método

Produção de colágeno estampado nanofibrilar para engenharia de tecidos

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DOI:

10.3791/67165

⸱

20 de setembro de 2024

 ,  , 
1Department of Biomedical Engineering, Oregon Health & Science University, 2Department of Orthopaedics and Rehabilitation, Oregon Health & Science University

* These authors contributed equally

Neste artigo

Resumo

O protocolo a seguir apresenta um método de extrusão baseado em cisalhamento para a fabricação de hidrogéis de colágeno com fibrilas padronizadas em nanoescala, que pode ser aplicado a uma ampla gama de aplicações de engenharia de tecidos.

Resumo

Os biomateriais regenerativos são projetados para facilitar as interações célula-material para orientar o reparo de tecidos e órgãos danificados. Esses materiais são projetados para emular as propriedades biofísicas do tecido nativo, fornecendo orientação fenotípica e morfológica celular que contribui para a restauração do nicho do tecido regenerativo. O colágeno, uma proteína da matriz extracelular prevalente, é um componente comum desses biomateriais regenerativos devido à sua biocompatibilidade e outras propriedades favoráveis. O presente estudo descreve um método novo e direto para a fabricação de colágeno nanofibrilar projetado com padrão de fibrila direcionada. Através da manipulação da tensão de cisalhamento, temperatura e pH, a fibrilogênese e o alinhamento do colágeno são controlados com precisão sem a necessidade de equipamentos especializados. Essa abordagem permite a criação de biomateriais de colágeno nanofibrilar que imitam a estrutura nativa de tecidos exibindo características anisotrópicas ou isotrópicas. A flexibilidade na padronização de nanofibrilas de colágeno não apenas facilita o estudo da padronização em nanoescala no comportamento celular, mas também oferece diversas possibilidades para aplicações de engenharia de tecidos padronizados.

Introdução

O objetivo da medicina regenerativa é melhorar a regeneração e a cicatrização dos tecidos por meio da aplicação de terapias projetadas. Uma abordagem envolve a fabricação de construções de biomateriais que emulam de perto a composição e a estrutura dos tecidos nativos. Ao projetar essas construções, uma consideração crítica é a matriz extracelular subjacente nativa (MEC), que fornece pistas instrucionais para proliferação, migração e diferenciação celular, impulsionando a regeneração do tecido 1,2. A MEC nativa é predominantemente composta por colágeno fibrilar 3,4. Em tecidos altamente organizados, como músculo esquelético e tendão, esses ECMs exibem um padrão alinhado, que é fundamental para apoiar a transmissão de força através do tecido, bem como a função motora 5,6.

A utilidade do colágeno como biomaterial para aplicações de engenharia de tecidos vai além de sua extensa prevalência em tecidos nativos, pois também apresenta boa biocompatibilidade, biodegradabilidade e afinidade celular 7,8,9. Avanços recentes no desenvolvimento de biomateriais à base de colágeno se concentraram no refinamento das propriedades biofísicas para melhor orientar as pistas mecânicas e bioquímicas que são essenciais para a regeneração específica do tecido. A criação de biomateriais de colágeno com estrutura fibrilar in vitro é relativamente simples, pois as moléculas de colágeno solúveis em ácido são capazes de se auto-montar em nanofibrilas quando expostas a temperaturas quentes e pH neutro10,11. No entanto, sem manipulação guiada, essas fibrilas se formarão em redes aleatórias, tornando-as inadequadas para aplicações de engenharia de tecidos anisotrópicos. As técnicas capazes de produzir fibrilas alinhadas incluem eletrofiação e fiação úmida, juntamente com outras técnicas de extrusão de solução12,13, liofilização14, fabricação eletroquímica ou magnética15,16, deposição de fluxo de cisalhamento17, cristalização induzida por fluxo18, extrusão em gel19, alinhamento induzido por deformação20 e alinhamento guiado por força por meio da manipulação de fluidos fluxo 21,22. No entanto, muitos desses métodos não são altamente compatíveis com o colágeno, produzem alinhamento em microescala, mas não em nanoescala, requerem etapas adicionais de pós-processamento para induzir alinhamento e estabilidade ou requerem equipamentos e reagentes altamente especializados, tornando sua adoção generalizada desafiadora.

O presente estudo apresenta um método fácil baseado em cisalhamento para a fabricação de colágeno nanofibrilar, com padrão de fibrila alinhado ou orientado aleatoriamente, sem a necessidade de equipamentos especializados, como bombas de seringa ou eletrospinners. Esta técnica capitaliza a dependência do pH da fibrilogênese do colágeno. A aplicação de força de cisalhamento ao colágeno monomérico ácido dentro de um tampão neutralizante promove a fibrilogênese alinhada ao longo da direção do cisalhamento. Da mesma forma, o colágeno pode ser induzido a sofrer fibrilogênese na ausência de cisalhamento, o que produz fibrilas com padrões aleatórios. As tiras de colágeno 3D resultantes, compostas por colágeno nanofibrilar alinhado ou padronizado aleatoriamente, podem servir como ferramentas para estudar os efeitos da padronização em nanoescala no comportamento celular. Além disso, eles oferecem diversas possibilidades para aplicações de engenharia de tecidos anisotrópicos e isotrópicos 23,24,25,26,27. O padrão pode ser personalizado para corresponder à estrutura do tecido nativo de interesse. As tiras de colágeno também podem ser combinadas em feixes de vários tamanhos para servir como uma terapia projetada transplantada em diversos tamanhos e formas de lesões.

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Protocolo

1. Preparação do colágeno dialisado ( Figura 1)

  1. Corte o tubo de diálise em um comprimento de aproximadamente 3 polegadas. Use tubos com as seguintes especificações: largura plana de 32 mm, diâmetro inflado de 20 mm e tamanho de poro de 4,8 nm.
  2. Reidrate o tubo de diálise em água ultrapura.
  3. Prenda uma extremidade do tubo com um clipe de tubo de diálise.
  4. Transfira 5-6 mL de colágeno de cauda de rato tipo I (concentração: 9-10 mg / mL em ácido acético 0,02 N) para o tubo usando uma seringa de 10 mL equipada com uma agulha de 18 G. Prenda a outra extremidade do tubo para fechar.
  5. Coloque uma camada de 0,5-1 cm de espessura de flocos de polietilenoglicol (PEG) no fundo de um prato de vidro e, em seguida, coloque o tubo de diálise cheio de colágeno em cima da camada de PEG.
    NOTA: Um prato de vidro de 13 polegadas x 9 polegadas x 2 polegadas normalmente pode acomodar uma fileira de 4-5 tubos cheios de colágeno. O tamanho do prato pode ser ajustado com base no volume de colágeno necessário.
  6. Adicione mais flocos de PEG para cobrir completamente o tubo e coloque a bandeja em uma geladeira a 4 °C.
  7. A cada 10-15 min, remova os flocos de PEG úmidos da superfície do tubo de diálise e cubra novamente o tubo com uma nova camada de PEG seco. Retorne o prato à geladeira a 4 °C.
  8. Repita a etapa 1.7 mais duas vezes e, após 30-35 min, enxágue os flocos de PEG úmidos com água da torneira.
  9. Enxágue o tubo mais uma vez com água ultrapura e seque o tubo com um lenço de papel.
  10. Solte uma extremidade do tubo e transfira o colágeno dialisado (concentração final: ~ 30 mg / mL) para tubos de microcentrífuga. Gire brevemente as bolhas de ar no colágeno usando uma minicentrífuga (2.000 x g, ≤30 s, temperatura ambiente [RT]) e armazene a 4 ° C para uso posterior.
  11. Um dia antes do uso, coloque o colágeno em seringas.
    1. Usando uma agulha de calibre 16, retire ~ 1 mL de colágeno dialisado em uma seringa de 1 mL.
      NOTA: O colágeno é uma substância viscosa. A cabeça da agulha pode precisar ser pré-carregada com colágeno antes de extrair mais colágeno. Remova a cabeça da agulha e expulse grandes bolsas de ar conforme necessário
    2. Retire a agulha e envolva a cabeça da seringa com parafilme.
    3. Guarde a seringa cheia de colágeno na vertical a 4° C durante a noite para permitir que pequenas bolhas de ar estourem.

2. Preparação de lascas de vidro (Figura 1)

CUIDADO: Utilize proteção para os olhos nesta parte do protocolo.

NOTA: Lâminas de vidro hidrofóbicas especialmente revestidas são usadas para experimentos de cultura de células. As corrediças devem ser manuseadas pelas bordas para evitar a remoção do revestimento da superfície. Execute o procedimento de corte de vidro em uma superfície de corte adequada.

  1. Meça e marque as dimensões desejadas do chip de vidro usando um marcador permanente
    1. Se estiver criando andaimes de 8 tiras, marque incrementos de aproximadamente 1 cm ao longo da borda longa do slide. Ajuste as dimensões conforme necessário com base no tamanho desejado do andaime.
  2. Usando uma borda reta (ou seja, uma borda de placa de 6 poços), deslize o cortador de vidro ao longo do comprimento da primeira medição para marcar o vidro.
  3. O slide quebrará ao longo da linha marcada por conta própria ou virará o slide sobre um lenço de papel (lado hidrofóbico para baixo) e aplicará pressão manualmente na região marcada.
  4. Marque o lado revestido da lâmina de vidro hidrofóbico usando uma caneta marcadora de etanol.
  5. Enxágue o chip de vidro em água ultrapura para remover a poeira residual do vidro.
  6. Seque as aparas de vidro usando um bico de bancada para ar pressurizado ou empilhando-as em ângulo na capela de exaustão.
  7. Repita conforme necessário para o número necessário de fichas. Armazene os chips em RT. Para obter melhores resultados de cultura de células, use chips preparados dentro de 7 dias.

3. Preparação de solução salina tamponada com fosfato 10x (PBS)

  1. Encha uma garrafa de vidro com 500 mL de água ultrapura.
  2. Adicione 10 comprimidos de PBS ao frasco.
    NOTA: Este protocolo pressupõe que a proporção de comprimidos para 1x PBS é de 1 comprimido por 500 mL. Ajuste o número de comprimidos conforme necessário se estiver usando um tamanho ou marca de tablet diferente.
  3. Adicione um barra de agitação ao frasco e coloque em uma placa de agitação até que os comprimidos estejam dissolvidos.
  4. No dia da fabricação do hidrogel, transfira o volume necessário de 10x PBS para tubos cônicos de 50 mL.
  5. Coloque os tubos cheios de PBS em banho-maria a 37 °C por pelo menos 15 minutos antes da fabricação do colágeno.

4. Fabricação de nanofibrilas de colágeno alinhadas (Figura 2)

  1. Retire uma seringa de colagénio do frigorífico e coloque uma agulha cega de 22 G.
  2. Coloque uma lâmina de vidro na tampa de uma placa de 4 poços.
  3. Cubra a lâmina com PBS 10x a 37 °C aquecido o suficiente para submergi-la (30-50 mL).
  4. Segurando a seringa em um ângulo de aproximadamente 30-45°, extrude manualmente tiras finas de colágeno no chip de vidro usando uma velocidade de ~340 mm/s e uma taxa de fluxo de ~3.2 mL/min.
    NOTA: Complete a extrusão de colágeno dentro de 30-60 s após a adição do PBS aquecido para garantir que o PBS não esfrie excessivamente.
  5. Aguarde 1-2 minutos para permitir que o colágeno complete a fibrilogênese ou até que o colágeno fique com uma cor branca opaca.
  6. Use uma pinça para cortar as tiras de colágeno no comprimento. Certifique-se de que as tiras sejam longas o suficiente para que 3-5 mm possam ser dobradas sob cada extremidade do chip.
  7. Uma de cada vez, coloque suavemente as tiras de colágeno longitudinalmente (paralelas à região marcada) sobre uma lasca de vidro preparada. Coloque as bordas sob o chip.
  8. Continue colocando tiras de colágeno até que as dimensões desejadas sejam alcançadas.
  9. Posicione o hidrogel de colágeno recém-formado em dois poços de uma placa de 12 poços. Isso permite o fluxo de ar durante o processo de secagem e evita que as extremidades da cauda do colágeno adiram a superfícies indesejadas.
  10. Deixe os hidrogéis na bancada secarem por 1-3 h ou até que os cristais de sal PBS cubram 50% -90% da superfície do hidrogel.
    NOTA: O tempo de secagem varia de acordo com o tamanho do hidrogel e a presença de excesso de líquido.
  11. Mergulhe cada hidrogel em 1x PBS por cerca de 30-60 s ou até que os cristais de sal sejam dissolvidos.
  12. Enxugue suavemente o excesso de PBS com um lenço de papel.
  13. Colocar os hidrogéis de volta na placa do poço e deixar secar num exaustor durante a noite.
  14. Armazene os hidrogéis secos em RT por cerca de 1 semana.

5. Fabricação de nanofibrilas de colágeno aleatórias (Figura 3)

  1. Retire uma seringa de colagénio do frigorífico e coloque uma agulha cega de 22 G.
  2. Extrude colágeno a ~ 3,2 mL / min em um chip de vidro seco. Extrude colágeno suficiente para obter dimensões semelhantes aos hidrogéis de colágeno alinhados. Evite o acúmulo de bolhas de ar conforme necessário.
  3. Faça a extrusão de colágeno adicional para envolver as bordas do chip de vidro. Isso minimiza o risco de descolamento acidental.
  4. Use uma pinça para submergir o colágeno extrudado em um tubo de 50 mL de PBS 10x aquecido.
  5. Aguarde 45-60 s para que o colágeno complete a fibrilogênese ou até que o colágeno fique com uma cor branca opaca.
  6. Enxugue suavemente o excesso de PBS com um lenço de papel.
  7. Conclua as etapas 4.9-4.14 para enxaguar e secar os hidrogéis

6. Esterilização e reidratação

NOTA: Conclua todas as etapas a seguir em um gabinete de biossegurança

  1. Esterilize os hidrogéis de colágeno e a placa do poço circundante em etanol a 70% por 15 min.
    1. Eleve brevemente os hidrogéis na metade da esterilização usando uma pinça para garantir que a parte inferior do chip de vidro e o hidrogel estejam em contato com o etanol.
  2. Remova o etanol e deixe os hidrogéis secarem ao ar por 10 min.
  3. Lave os hidrogéis 3 vezes em PBS 1x estéril, por 10 min cada, para remover o etanol residual e reidratar os hidrogéis. Os hidrogéis estão agora prontos para uso (cultura de células, etc.). Os hidrogéis podem ser deixados brevemente no PBS após a etapa final de lavagem se não estiverem imediatamente prontos para uso.

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Resultados

Este protocolo descreve uma técnica de extrusão baseada em cisalhamento simples para a fabricação de hidrogéis de colágeno compostos por nanofibrilas orientadas alinhadas (Figura 2) ou aleatoriamente (Figura 3). A padronização de nanofibrilas depende do controle preciso das forças de cisalhamento, que é alcançada por meio da modulação combinada da velocidade da seringa e da taxa de extrusão de colágeno. Os valores ideais para induzir o alinhamento das fibrilas f...

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Discussão

As etapas críticas do protocolo podem ser destiladas em três partes principais: 1) fibrilogênese do colágeno, 2) montagem do hidrogel e 3) lavagem. O processo de fibrilogênese do colágeno ocorre espontaneamente sob condições neutralizantes e depende da automontagem de moléculas individuais de colágeno em estruturas fibrilares estabilizadas maiores10,11. Isso é obtido através da aplicação de um meio tamponado neutralizante como 10...

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Divulgações

Não há conflitos de interesse a declarar.

Agradecimentos

Esta pesquisa foi apoiada em parte pelo financiamento da Alliance for Regenerative Rehabilitation Research & Training, MTF Biologics, Oregon Health & Science University Foundation e Collins Medical Trust. K.M.H. foi apoiado pela National Science Foundation Graduate Research Fellowship (DGE-1937961) e pela Oregon Students Learn and Experience Research (OSLER) Fellowship (5TL1TR2371-8). K.H.N. foi apoiado por doações do NIH / NHLBI (R00HL136701) e NIH / NIAMS (R01AR080150).

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Colágeno I, Alta Concentração, Cauda de RatoCorningCB354249
Eclipse TE-2000-U microscópioNikonTE-2000-U Microscópio invertido
Lâminas de Microscópio Extra GrossasFisher Scientific22-267-005Funciona bem para superfície de extrusão de colágeno
FEI Helios G3 NanoLab DualBeamThermo Fisher ScientificN/AMicroscópio eletrônico de varredura
Conjunto de ferramentas de corte de vidro Ponta de carboneto de alimentação de óleo estilo lápis 2mm-20mmde B07Y1D243HAmazon/MOARMORpara um cortador de vidro
Agulhas de ponta romba Hamilton Kel-F Hub (Luer Lock, 22 G)Fisher Scientific14-815-574Agulhas para extrusão de colágeno
Corrediça H 3-DSchottNC0782819Lâminas hidrofóbicas
PBS ComprimidosThermo Fisher Scientific18912014
Polietilenoglicol 8000Fisher BioReagentsBP233-1
Tubo de diálise de celulose sem costura Fisher ScientificS25645G
SnakeSkin Clipes de DiáliseThermo Fisher ScientificPI68011
Synthware Cortador de VidroSynthware31-501-927Opção para um cortador de vidro
Opção

Referências

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