כאן, אנו מציגים פרוטוקול לבידוד אקסוזומים שמקורם בטחול עכברים באמצעות שילוב של עיכול עם קולגן מסוג I ואולטרה-צנטריפוגה.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
בידוד ואפיון אקסוזומים שמקורם ברקמת הטחול של העכבר
* These authors contributed equally
במאמר זה
סיכום
תקציר
אקסוזומים (Exo) הם מבנים דו-שכבתיים ליפידים המופרשים על ידי תאים שונים, כולל אלה של בעלי חיים, צמחים ופרוקריוטים. מחקרים קודמים גילו כי אקסו שמקורו בהומור או בסופרנאטנט תאי הם מטרות מבטיחות לסמנים ביולוגיים אבחוניים או פרוגנוסטיים חדשים, מה שמדגיש את תפקידם המשמעותי בפתוגנזה של מחלות. Exo שמקורו ברקמה (Ti-Exo) משך תשומת לב גוברת בשל יכולתו לשקף במדויק את ספציפיות הרקמה ואת המיקרו-סביבה. Ti-Exo, הנוכח בחלל הבין-תאי, ממלא תפקידים מכריעים בתקשורת בין-תאית ובאיתות חוצה איברים. למרות הערך המוכר שלהם בהבהרת מנגנוני המחלה, בידוד Ti-Exo נותר מאתגר בשל מורכבות מטריצות הרקמה והשונות בשיטות החילוץ. במחקר זה, פיתחנו פרוטוקול מעשי לבידוד אקסוזומים מרקמת הטחול של עכברים, המספק טכניקה הניתנת לשחזור לניתוח זיהוי עוקב ולמחקרים פונקציונליים. השתמשנו בעיכול קולגנאז מסוג I בשילוב עם אולטרה-צנטריפוגה דיפרנציאלית כדי לבודד אקסו שמקורו בטחול. המאפיינים של אקסו המבודד נקבעו באמצעות מיקרוסקופ אלקטרונים, ציטומטר זרימת ננו וכתם מערבי. אקסו המבודד שמקורו בטחול הציג את המורפולוגיה האופיינית של שלפוחיות דו-שכבתיות ליפידיות, עם גדלי חלקיקים הנעים בין 30 ננומטר ל-150 ננומטר. בנוסף, פרופיל הביטוי של סמנים אקסוזום אישר את נוכחותם וטוהרתם של אקסוזומים. יחד, ביססנו בהצלחה פרוטוקול מעשי לבידוד אקסו שמקורו בטחול בעכברים.
מבוא
אקסוזומים (Exo) הם תת-קבוצה של שלפוחיות חוץ-תאיות (EVs), שגודלן נע בין 30 ל-150 ננומטר, והיא מכילה מגוון רחב של ביומולקולות, כולל חלבונים, חומצות גרעין ושומנים1. ביומולקולות אלה נגזרות מתאי ההורים ומשוחררות לחלל החוץ תאי. אקסו מאפשרת חילופי מידע ביומולקולריים בין תאים והמיקרו-סביבה הסובבת אותם, וממלאת תפקידים הן במערכות פרוקריוטיות והן במערכות אאוקריוטיות2. המאפיינים של אקסוזומים, כגון תוכן, גודל, מרכיבי קרום ומקור תאי, משתנים מאוד ומושפעים מסוג התא המקורי, מצב התא ותנאי הסביבה.
אקסוזומים מסווגים בדרך כלל לשלוש קטגוריות בהתבסס על המקור שלהם: תרבית תאים, נוזל ג....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
הדגימות נלקחו מעכברים, עם אישור אתי שניתן על ידי ועדת האתיקה של האוניברסיטה הרפואית גואנגדונג. תיאורים מפורטים של חומרים, ציוד ותוכנות המשמשים בפרוטוקול זה מופיעים בטבלת החומרים. פרטי ההכנה לפני השאיבה מתוארים באיור 1, בעוד שתהליך המיצוי וההעשרה של הטחול-אקסו מתואר באיור 2.
1. הכנה
- קירור מראש של צנטריפוגות במהירות גבוהה ובמהירות גבוהה במיוחד ל -4 ° C והגדר את הטמפרטורה של שייקר שולחני ל -37 ° C.
- הכינו צלחות תרבית תאים (
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
בידוד וטיהור של אקסוזומים שמקורם בטחול
כדי לבודד אקסוזומים מרקמת הטחול של עכבר השתמשנו בשילוב של עיכול קולגן ואולטרה-צנטריפוגה דיפרנציאלית (איור 2). השלבים הראשונים כללו טיפול מקדים ברקמת הטחול כדי להסיר דם פני השטח, ולאחר מכן עיכול עם collagenase מסוג I. טיפול אנזימטי זה הקל על פירוק רכיבי המטריקס החוץ תאיים, ובכך שחרר את האקסוזומים תוך שמירה על שלמותם. לאחר העיכול, נעשה שימוש בסדרה של צעדי צנטריפוגה כדי להסיר ברצף פסולת תאית, גופים אפופטוטיים ובועיות גדולות יותר, שהגיעו.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
מחקרים אחרונים דיווחו כי אקסוזומים שמקורם בטחול (Spleen-Exo) ממלאים תפקיד קריטי בטיפול בסרטן קיבה12. כדי להבהיר עוד יותר את הפונקציות של טחול-Exo, יש צורך להקים שיטה לשחזור אופטימלי עבור מיצוי שלהם מרקמת הטחול. בעוד שקיימים פרוטוקולים לבידוד אקסוזומים מסרטן המוח והכבד13,14, שיטות לרקמות אחרות אינן מפותחות ודורשות אימות נוסף. במחקר זה התווינו שיטה מעשית לבידוד אקסו מרקמת הטחול.
ב.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
המחברים מצהירים כי אין להם אינטרסים מתחרים.
תודות
עבודה זו נתמכה על ידי הקרן הלאומית למדעי הטבע של סין (82370281, 81870222), הקרן למדעי הטבע של מחוז גואנגדונג (2022A1515012103), והמדע, פרויקט ההקצאה התחרותית של הקרן המיוחדת לפיתוח טכנולוגיה של העיר ג'נג'יאנג (2021A05086), וקרן הסטארט-אפ מבית החולים המסונף השני של האוניברסיטה הרפואית גואנגדונג (23H03).
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| 70 ומיקרו; m מסננת תאים | Biologix Group Co., Ltd.ארה"ב | 15-1070 | |
| נוגדן CD9 | Cell Signaling Technology, Inc (CST), ארה"ב | 983275 | |
| נוגדן Anti GM130 | Proteintech Group, Inc.סין | 66662-1-LG | |
| אנטי TSG101 נוגדן | Abcam Plc, בריטניה | 125011 | |
| צלחת תרבית תאים | Wuxi NEST ביוטכנולוגיה ושות', בע"מ, סין | 704001 | |
| צינור צנטריפוגה | Wuxi NEST ביוטכנולוגיה ושות', בע"מ, סין | 788211 | |
| קולגנאז סוג I | Sigma-Aldrich Corp., ארה"ב | C2674 | |
| שייקר | תרמוסטטי שולחנישנחאי bluepard מכשירים ושות', בע"מ, סין | THZ-100 | |
| מאגר אלקטרופורזה | ווהאן Servicebio Technology Co., Ltd., סין | G2081-1L | |
| ערכת בדיקת חלבון BCA משופרת | שנחאי Beyotime ביוטכנולוגיה ושות', בע"מ, סין | P0010S | |
| Flow NanoAnalyzer | NanoFCM Inc., סין | N30E | |
| מערכת הדמיה פלואורסצנטית/כימילומינסנציה | גואנגג'ואו ביולייט ביוטכנולוגיה ושות', בע"מ, סין | GelView 6000Plus | |
| HRP עז נגד עכבר IgG | Proteintech Group, Inc.סין | 15014 | |
| HRP עז נגד ארנב IgG | Proteintech Group, Inc.סין | 15015 | |
| קורא מיקרו-פלטות | מכשירים מולקולריים, ארה"ב | CMax Plus | |
| Microscissors | שנחאי רפואי מכשירים (קבוצה) Co., Ltd.,סין | WA1010 | |
| פינצטה מיקרוסקופית | שנחאי רפואי מכשירים (קבוצה) Co., Ltd., סין | WA3010 | |
| Multifuge X1R Pro צנטריפוגה | תרמו פישר מדעי, ארה"ב | 75009750 | |
| מספריים עיניים | שנחאי רפואי מכשירים (קבוצה) Co., Ltd., סין | Y00030 | |
| פינצטה עיניים | שנחאי רפואי מכשירים (קבוצה) Co., Ltd., סין | JD1060 | |
| Optima XPN-100 צנטריפוגה אולטרה-סינון | בקמן קולטר, ארה"ב | A94469 | |
| פוספט חוצץ מלח (PBS) | בייג'ינג Solarbio מדע & טכנולוגיה ושות', בע"מ, סין | P1003 | |
| RIPA מאגר ליזה (חזק, ללא מעכבים) | שנחאי Beyotime ביוטכנולוגיה ושות', בע"מ, סין | P0013K | |
| מעדניית סרגל | ייצור חברה, סין | ||
| SDS-PAGE מאגר טעינה לדוגמא, 5x | שנחאי Beyotime ביוטכנולוגיה ושות', בע"מ, סין | P0015 | |
| העברת Pipet | Biologix Group Co., Ltd.USA | 30-0238A1 | |
| מיקרוסקופ אלקטרונים שידור | היטאצ'י, יפן | H-7650 | |
| צינור אולטרה-צנטריפוגה | בקמן קולטר, ארה"ב | 355618 | |
| מאגר העברה מערבית | ווהאן Servicebio טכנולוגיה ושות', בע"מ, סין | G2028-1L |
מקורות
- Meldolesi, J. Exosomes and Ectosomes in Intercellular Communication. Curr Biol. 28 (8), R435-R444 (2018).
- Costa-Silva, B., et al. Pancreatic cancer exosomes initiate pre-metastatic niche formation in the liver. Nat Cell Biol. 17 (6), 816-826 (2015)....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
