이 프로토콜은 제브라피시 유충에서 수행된 이광자 레이저 절제 접근법을 설명하며, 이는 뼈 재생과 절제에 대한 면역 반응의 효과를 연구하기 위한 모델 역할을 합니다.
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이 논문에서
요약
초록
제브라피시(Danio rerio)는 다양한 장기와 부속기관을 재생하는 뛰어난 능력을 가지고 있습니다. 제브라피쉬의 뼈 재생은 지느러미 절단, 비늘 뽑기, 두개골 박리 및 현미경 접근법과 같은 다양한 방법을 사용하여 연구되었습니다. 이광자 레이저가 장착된 컨포칼 레이저 스캐닝 설정을 사용하여 제브라피시 유충의 발달 중인 배엽에서 뼈 형성 세포(조골세포)를 절제하는 병변 패러다임으로 레이저 절제 방법을 개발했습니다. 여기에 설명된 방법은 면적, 모양 및 깊이를 미세하게 조정할 수 있으므로 정확한 방식으로 세포를 절제할 수 있습니다. 또한 이 방법을 사용하면 절제 전후 부위를 이미징할 수 있으므로 부상의 단기적인 영향을 분석할 수 있습니다. 이 실험 설정에서는 손상 부위의 조골세포 절제 후 면역 반응을 연구했습니다. 절제 후 대식세포의 모집 증가가 관찰되었으며, 이는 뼈 재생 중 대식세포의 존재 관련성을 나타냅니다.
서론
제브라피쉬는 망막, 뇌, 심장, 췌장 등 다양한 장기를 재생한다1. 또한 제브라피쉬는 골격 요소를 재생하기 때문에 지느러미, 비늘 및 calvariae(두개골 모자)의 재생을 연구하는 데 사용되었습니다2. 지느러미 절제술(절단), 지느러미 골절, 두개골 절단술 3,4, 냉동 손상 5,6 또는 유전자 절제술 7,8,9와 같은 조직 및 뼈 재생을 연구하기 위해 다양한 실험 패러다임이 사용되었습니다. 최근에는 제브라피시에서 부상 후 치유 및 재생 반응을 연구하기 위해 레이저 절제 접근법이 널리 사용되고 있습니다 10,11,12,13,14.
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프로토콜
연구 프로토콜은 Landesdirektion Sachsen의 승인을 받았으며 허가 번호는 25-5131/564/2, DD25-5131/450/4, 25-5131/496/56, DD25.1-5131/354/87입니다. 사용된 제브라피시 균주는 국내법에 따라 그리고 앞서 설명한 바와 같이 표준화된 조건 하에서 유지되었다27,28. 연구에 사용된 모든 시약 및 장비의 세부 사항은 재료 표에 나열되어 있습니다.
1. 재료 및 용액의 준비
- 배아를 1x E3 배지에서 유지합니다. 170mL의 60x E3 스톡을 탈이온수 10L에 희석하고 2mL의 0.1% 메틸렌 블루를 첨가하여 1x E3 배지를 준비합니다.
- 탈이온수 30L에 NaCl 17.2g, KCl 0.76g, CaCl2·2 H2O 2.90g, MgSO4·7 H2O 4.90g을 혼합하여 1x E3 미디어 스톡을 준비합니다.
- 유충 매립을 위해 1% 저융점 아가로스(LMA)의 부분 표본을 미리....
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결과
레이저 절제술은 위의 프로토콜에 표시된 대로 수행되었습니다. 절제 부위의 조골세포의 GFP 신호는 절제 후 즉시 사라졌습니다. 면역 반응 측면에서 조골세포 절제의 반응을 연구하기 위해 6 dpf 유충에서 6 hpl 전과 6hpl에서 대식세포의 존재를 이미지화했습니다. 절제 전에는 수술 영역(opercle area) 10 에서 대식세포가 거의 관찰되지 않았습니다(그림 2). 6 hp에서, 절제된 opercle 영역에 대식세포가 강하게 축적되고 opercle 및 opercle 주변 영역을 포함하여 시야에서 대식세포의 수가 증가하는 것이 감지되었습니다10 (그림 2).
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토론
레이저 절제술은 생물학 연구의 다양한 분야에 적용되어 왔습니다. 특히, 조직 재생을 연구하는 방법으로 유용하였다10,11,12. 예를 들어, 선천성 면역 세포의 모집 및 표현형 변화는 최근에 레이저 절제 부위(10)에서 조골세포의 회수와 함께 UV 레이저 또는 이광자 레이저 절제 분석을 사용하여 시간 경과에 따른 분석을 수행했습니다. 면역 세포 모집의 실시간 이미징은 병변 후 최대 12시간(hpl)까지 수행되었습니다. 그러나 더 긴 이미징 기간은 마취의 적절한 조정과 해당 당국의 승인을 통해 구상할 수 있습니다. Geurtzen et al.에서는 레이저 절제 후 최대 며칠까지 분석을 수행하여 절제 부위의 염증성 환경을 정의하고 뼈 재생에서 대식세포의 지지 역할을.......
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공개 사항
저자는 밝힐 것이 없습니다.
감사의 글
이 연구는 독일 연구 재단(DFG) Transregio 67(프로젝트 387653785), DFG SPP 2084 μBone(프로젝트 KN 1102/2-1)의 지원을 받았습니다. 이 작업은 TU Dresden의 CMCB 기술 플랫폼의 핵심 시설인 Light Microscopy Facility(DFG 프로젝트 413875620)의 지원을 받았습니다. TU 드레스덴의 작업은 작센 의회 ( 'Landtag')가 합의 한 예산에 기반한 세금 수입으로 공동 자금을 조달했습니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 염화칼슘 이수화물, CaCl2· H2O | Carl Roth | 5239.1 | |
| 세포 배양 접시, PS, 100/20 mm | Greiner Bio-one | 664160 | |
| Dumont #55 Foceps | FST | 11295-51 | 팁 모양 직선, 11 cm, 0.05 x 0.02 mm |
| Falcon 6웰 플레이트 | Corning | 353502 | |
| 유리 바닥 마이크로웰 접시 | MatTek | P35G-1.5-14-C | 35mm 접시, No. 1.5 커버슬립, 14mm 유리 직경, 코팅되지 않은 |
| Insight X3 다광자 레이저 | Spectra-Physics | ||
| Leica 응용 제품군 | LAS X, Leica Microsystems | ||
| 저융점 아가로스 | Biozyme | 840101 | Biozym 플라크 아가로스 |
| 마그네슘 설페이트 헵타하이드레이트, MgSO4· 7H2O | Sigma-Aldrich | M5921 | |
| 메이팅 케이지 | 다양한 종류(예: Tecniplast | ||
| Methyleneblue | Carl Roth | A514.1 | |
| MS-222 | SIGMA, Aldrich | A5040 | |
| 염화칼륨, KCl, | PanReac AppliChem | 131494 | |
| 염화나트륨, NaCl | Carl Roth | 3957.1 | |
| SP8 팔콘 | 라이카 마이크로시스템 | Insight X3 다광자 레이저 및 라이카 애플리케이션 제품군 소프트웨어 | |
| 장착 스테인리스 스틸 해부 바늘 | Bochem | 12010 | 140mm |
| 실체 현미경 시스템 SZX16 | 올림푸스 | LED 조명 베이스 장착 SZX2-ILLTQ | |
| 온도 조절 캐비닛 TS - WTW | 물관부 | TS 608/2-i | 배양(배아) |
| 이식용 피펫, 3.5 mL | SARSTEDT | 861171 | 155 x 15 mm, LD-PE, 투명 |
| Zeiss SteREO Discovery.V12 버전 4.7.1.0. | Zeiss | Axiocam MRm 카메라 및 AxioVision 소프트웨어 탑재 |
참고문헌
- Marques, I. J., Lupi, E., Mercader, N. Model systems for regeneration: Zebrafish. Dev. 146 (18), dev167692(2019).
- Dietrich, K., Fiedler, I. A. K., Kurzyukova, A. Skeletal biology and disease modeling in zebrafish. J Bone Miner Res. 36 (3), 436-458 (2021).
- Geurtzen, K., Knopf, F.
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재인쇄 및 허가
