Este protocolo descreve uma abordagem de ablação a laser de dois fótons realizada em larvas de peixe-zebra, que serve como modelo para estudar a regeneração óssea e os efeitos da resposta imune à ablação.
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Artigo de método
Ablação mediada por laser de dois fótons de osteoblastos em larvas de peixe-zebra em desenvolvimento
Neste artigo
Resumo
Resumo
O peixe-zebra (Danio rerio) tem uma excelente capacidade de regenerar diferentes órgãos e apêndices. A regeneração óssea em peixe-zebra tem sido estudada usando diferentes métodos, como amputação de barbatanas, arrancamento de escamas, trepanação de crânio e abordagens microscópicas. Usando uma configuração de varredura a laser confocal equipada com um laser de dois fótons, um método de ablação a laser foi desenvolvido como um paradigma de lesão para ablação de células formadoras de osso (osteoblastos) no opérculo em desenvolvimento de larvas de peixe-zebra. O método descrito aqui permite a ablação das células de maneira precisa, pois a área, a forma e a profundidade podem ser ajustadas com precisão. Além disso, esse método permite a obtenção de imagens da área antes e logo após a ablação, para que os efeitos de curto prazo da lesão possam ser analisados. Nesta configuração experimental, a resposta imune após a ablação de osteoblastos na área lesada foi estudada. Observou-se um aumento no recrutamento de macrófagos após a ablação, indicando a relevância de sua presença durante a regeneração óssea.
Introdução
O peixe-zebra regenera diversos órgãos, como retina, cérebro, coração e pâncreas1. Além disso, o peixe-zebra regenera elementos esqueléticos, razão pela qual tem sido usado para estudar a regeneração de barbatanas, escamas e calvárias (calotas cranianas)2. Diferentes paradigmas experimentais têm sido utilizados para estudar a regeneração tecidual e óssea, como ressecção de nadadeiras (amputação), fratura de nadadeiras, trepanação craniana 3,4, crioleferimento 5,6 ou ablação
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Protocolo
O protocolo do estudo recebeu aprovação da Landesdirektion Sachsen, números de licença 25-5131/564/2, DD25-5131/450/4, 25-5131/496/56, DD25.1-5131/354/87. As linhagens de peixe-zebra utilizadas foram mantidas de acordo com a legislação nacional e sob condições padronizadas, conforme descrito anteriormente27,28. Os detalhes de todos os reagentes e equipamentos utilizados no estudo estão listados na Tabela de Materiais.
1. Preparação de materiais e soluções
- Mantenha os embriões em 1x meio E3. Prepare o meio 1x E3 diluindo 170 mL de um estoqu....
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Resultados
A ablação a laser foi realizada conforme indicado no protocolo acima. O sinal GFP dos osteoblastos na área ablacionada desapareceu instantaneamente após a ablação. Para estudar a resposta da ablação de osteoblastos em termos de resposta imune, foi observada a presença de macrófagos em larvas de 6 dpf antes e em 6 hpl. Antes da ablação, muito poucos macrófagos foram observados na área do opérculo10 (Figura 2). Aos 6 hpl, foi detectado um forte acúmulo de macrófagos na .......
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Discussão
A ablação a laser tem sido aplicada em várias disciplinas da pesquisa biológica. Em particular, tem sido útil como método para estudar a regeneração tecidual 10,11,12. Por exemplo, o recrutamento e as alterações fenotípicas das células imunes inatas foram recentemente analisados ao longo do tempo usando ensaios de ablação a laser UV ou laser de dois fótons, juntamente com a recuperação de osteob.......
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Divulgações
Os autores não têm nada a divulgar.
Agradecimentos
Este trabalho foi apoiado pela Fundação Alemã de Pesquisa (DFG) Transregio 67 (projeto 387653785), o DFG SPP 2084 μBone (projeto KN 1102/2-1) para FK. Este trabalho foi apoiado pela Light Microscopy Facility (DFG project 413875620), uma instalação central da Plataforma de Tecnologia CMCB na TU Dresden. Os trabalhos na TU Dresden foram cofinanciados com receitas fiscais baseadas no orçamento acordado pelo Parlamento da Saxónia («Landtag»).
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Cloreto de cálcio di-hidratado, CaCl2· H2O | Carl Roth | 5239.1 | |
| Placa de Cultura de Células, PS, 100/20 mm | Greiner Bio-one | 664160 | |
| Dumont #55 Foceps | FST | 11295-51 | Forma da ponta reta, 11 cm, 0,05 x 0,02 mm |
| Placa Falcon de 6 poços | Corning | 353502 | |
| Placa de micropoços com fundo de vidro | MatTek | P35G-1.5-14-C | Prato de 35 mm, Nº 1.5 Lamínula, Diâmetro de Vidro de 14 mm, Não Revestido |
| Laser multifotônico Insight X3 | Spectra-Physics | ||
| Leica Application Suite | LAS X, Leica Microsystems | ||
| Baixo ponto de fusão de agarose | Biozyme | 840101 | Biozym Plaque Agarose |
| Sulfato de magnésio heptahidratado, MgSO4· 7H2O | Sigma-Aldrich | M5921 | |
| Gaiolas | muitas variedades, por exemplo, Tecniplast | ||
| Methyleneblue | Carl Roth | A514.1 | |
| MS-222 | SIGMA Aldrich | A5040 | |
| Cloreto de potássio, KCl | PanReac AppliChem | 131494 | |
| Cloreto de sódio, NaCl | Carl Roth | 3957.1 | |
| SP8 FALCON | Leica Microsystems | Equipado com um laser multifotônico Insight X3 e software Leica Application Suite | |
| Agulha de dissecação de aço inoxidável | Bochem | 12010 | 140 mm |
| SZX16 | Olympus | Equipado com uma base de iluminação LED SZX2-ILLTQ | |
| Gabinetes termostáticos TS - WTW | xilema | TS 608/2-i | Para incubação (embrião) |
| Transferência pipeta, 3,5 mL | SARSTEDT | 861171 | 155 x 15 mm, LD-PE, transparente |
| Zeiss SteREO Discovery.V12 versão 4.7.1.0. | Zeiss | Equipado com câmera Axiocam MRm e software AxioVision |
Referências
- Marques, I. J., Lupi, E., Mercader, N. Model systems for regeneration: Zebrafish. Dev. 146 (18), dev167692(2019).
- Dietrich, K., Fiedler, I. A. K., Kurzyukova, A. Skeletal biology and disease modeling in zebrafish. J Bone Miner Res. 36 (3), 436-458 (2021).
- Geurtzen, K., Knopf, F.
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Reimpressões e permissões
