تحضير الصفائح الدموية البشرية المغسولة لدراسات التدفق الأيضي الكمي

ملخص

يعتبر استقلاب الصفائح الدموية ذا أهمية ، لا سيما فيما يتعلق بدور فرط الصفائح الدموية ونقص النشاط في النزيف واضطرابات التخثر. يعد عزل الصفائح الدموية من البلازما ضروريا لبعض فحوصات التمثيل الغذائي. معروضة هنا هي طريقة لعزل المستقلبات داخل الخلايا من الصفائح الدموية المغسولة.

الملخص

الصفائح الدموية هي خلايا الدم التي تلعب دورا أساسيا في الإرقاء والاستجابة المناعية الفطرية. تورط فرط الصفائح الدموية ونقص النشاط في اضطرابات التمثيل الغذائي ، مما يزيد من خطر الإصابة بالجلطات والنزيف. يرتبط تنشيط الصفائح الدموية والتمثيل الغذائي ارتباطا وثيقا ، مع الطرق العديدة لقياس الأول ولكن قليلة نسبيا للأخير. لدراسة استقلاب الصفائح الدموية دون تدخل خلايا الدم الأخرى ومكونات البلازما ، يجب عزل الصفائح الدموية ، وهي عملية ليست تافهة بسبب حساسية قص الصفائح الدموية والقدرة على التنشيط بشكل لا رجعة فيه. يعرض هنا بروتوكول لعزل الصفائح الدموية (الغسيل) الذي ينتج الصفائح الدموية الهادئة الحساسة للتحفيز بواسطة ناهضات الصفائح الدموية. يتم استخدام خطوات الطرد المركزي المتتالية مع إضافة مثبطات الصفائح الدموية لعزل الصفائح الدموية من الدم الكامل وإعادة تعليقها في مخزن مؤقت متساوي التنافر الخاضع للرقابة. تنتج هذه الطريقة بشكل متكرر 30٪ -40٪ من استعادة الصفائح الدموية من الدم الكامل مع تنشيط منخفض كما تم قياسه بواسطة علامات إفراز الحبيبات ونشاط الإنتجرين. يمكن التحكم في عدد الصفائح الدموية وتركيز الوقود بدقة للسماح للمستخدم بالتحقيق في مجموعة متنوعة من حالات التمثيل الغذائي.

المقدمة

الصفائح الدموية صغيرة (قطرها 2-4 ميكرومتر) ، والخلايا التي تلعب دورا مهما في الإرقاء ، وهي عملية منظمة بإحكام لتكوين^{الجلطة 1}. في حين أن الصفائح الدموية حيوية لسلامة الأوعية الدموية ، إلا أنها متورطة أيضا في الأحداث الصحية الضارة. تشارك الصفائح الدموية في تجلط الأوردة العميقة (DVT) وتجلط الشرايين (AT) ، وهي جلطات تسد الأوعية الدموية ، مما يؤدي إلى انخفاض إمدادات الدم محليا ، أو إذا انفصلت أجزاء من الجلطة (تجسد) ، فإنها يمكن أن تمنع تدفق الدم إلى الرئتين أو القلب أو^{الدماغ 2،3،4،5،<....}

البروتوكول

حصلت الدراسة على موافقة مجلس المراجعة المؤسسية من الحرم الجامعي الطبي بجامعة كولورادو أنشوتز. تم الحصول على موافقة كتابية من جميع المشاركين في الدراسة. أفاد المشاركون أنهم لم يستهلكوا الكحول لمدة 48 ساعة السابقة أو العقاقير غير الستيرويدية المضادة للالتهابات (NSAIDs) خلال الأيام العشرة السابقة. يتم دعم هذا المشروع من قبل المعهد الوطني للقلب والرئة والدم التابع للمعاهد الوطنية للصحة بموجب الجائزة رقم R61HL141794.

1. جمع الدم

1. إعداد لسحب الدم. يوصى بجمع الدم بواسطة أخصائي فصد مدرب.
2. قم بإجراء بزل الوريد على الذراع الداخلي باستخدام إبرة 19 جراما.
3. اجمع أول ~ 2 مل في مكنسة كهربائية خالية من الإضافات....

النتائج

تمثل النتائج التمثيلية في الشكل 2 6 متبرعين مختلفين بالدم ، بما في ذلك 3 ذكور و 3 إناث. يظهر محصول الصفائح الدموية بالنسبة للدم الكامل في الشكل 2 أ. كان الاسترداد النهائي للصفائح الدموية في المتوسط 52٪ ± 3٪ (الانحراف المعياري ، العدد = 6). تم قياس العدد النهائي للصفائح الدموية مقارنة بتلوث خلايا الدم البيضاء باستخدام محلل أمراض الدم الآلي. كان عدد خلايا الدم البيضاء أقل من 0.1٪ من إجمالي الخلايا (الشكل 2 ب). من خلال عملية الغسيل وال.......

المناقشة

الصفائح الدموية حساسة جدا لبيئتها ، بما في ذلك إجهاد القص ووجود ناهضات^38،39. وهذا يجعل التعامل مع الصفائح الدموية وعزلها أمرا صعبا، مما يجعل استخدام المثبطات والماصات ذات التجويف العريض أمرا بالغ الأهمية⁴⁰. يعد التخزين والإعداد المناسبان ل PGI₂ أمرا حيويا ، حيث أن الفشل في إعداد PGI₂ في PBS الأساسي سيؤدي إلى تدهور سريع ل PGI₂⁴¹. لتقليل مخاطر التنشيط .......

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة

الاسم	الشركة	رقم فهرسي	التعليقات
0.22 وميكرو ؛ أنابيب M filter Spin-X	Millapore-Sigma	CLS8160	كاشف الإعدادية
19 G × 3/4 "إبرة	McKesson Corporation	448406	Phlebotomy
21 G 1.5 بوصة إبرة مع قفل لور	Amazon	B0C39PJD23	Reagent Prep
96 لوحة بئر ، نصف منطقة	Greiner Bio-One	675101	Flow Cytometry
ACD-A vaccutainers   ؛	فيشر	364606	الفصد
محول	McKesson Corporation	609
مسحة الكحول	VWR	15648-916	الفصد
أبيراز من البطاطس	Sigma	A6410-100UN	الكاشف الإعدادية
CD42a الجسم المضاد أحادي النسيلة	الحراري فيشر العلمي	48-0428-42	قياس التدفق الخلوي
مبرد أجهزة الطرد المركزي الدقيقة	ThermoFisher Scientific	75002441	التبريد
D-Glucose	Sigma	G7021	كاشف الإعدادية
FITC الأجسام المضادة المضادة للفيبرينوجين	Abcam	4217	مقياس التدفق
التدفق	الخلوي بيكمان كولتر	82922828	التدفق الخلوي
شاش	VWR	76049-110	الفصد
الجلسرين	سيجما ألدريتش	G5516	كاشف الإعدادية
HEPES	Sigma Aldrich	H4034	كاشف الإعدادية
البشرية ألفا ثرومبين	Prolytix	HCT-0020	قياس التدفق
الخلوي KCl	Sigma Aldrich	P9333	كاشف الإعدادية
KH2< / sub>PO4< / sub>	Sigma Aldrich	P5655	كاشف الإعدادية
MgCl2	Sigma	M8266	الكاشف الإعدادية
أنابيب الطرد المركزي	الدقيقة VWR	87003-292	عام
Na2< / sub>HPO4< / sub>	Sigma	S3264	الكاشف الإعدادية
NaCl	Sigma Aldrich	S7653	الكاشف الإعدادية
NaHCO3< / sub> / sub	Sigma Aldrich	S5761	كاشف الإعدادية
ماصة نقل التجويف الضيق	VWR	16001-176	الصفائح
محلول بارافورمالدهيد ، 4٪ في PBS	Santa Cruz Biotechnology	sc-281692	قياس التدفق
الخلوي PECy5 الفأر المضاد للإنسان CD62P	BD Pharmingen	551142	غطاء لوحة قياس التدفق
	الخلوي Thermo Fisher Scientific	AB0626	التدفق الخلوي
البولي بروبيلين 15 مل أنابيب مخروطية	VWR	89039-658	الكاشف الإعدادي
البولي بروبيلين 50 مل أنابيب مخروطية	VWR	352070	غسل الصفائح
البروستاجلاندين I2 (ملح الصوديوم)	كايمان كيميكال	18220	كاشف الإعدادية
SKC Inc. C-Chip مقاييس الدم القابل للتصرف	فيشر سينتيفيك	22-600-100
حقنة	BD Pharmingen	14-823-41	كاشف الإعدادية
عاصبة	VWR	76235-371	الفصد
حامل إبرة Vacutainer	BD	364815	Phrebotomy
Vortexer	VWR	102091-234	كاشف الإعدادية
حمام مائي	Thermo Fisher Scientific	TSGP02	غسيل الصفائح
الدموية ماصة نقل التجويف	العريض VWR	76285-362	الصفائح الدموية

الفصد الفصد الخلوي مقياس قياس غسل الدموية قياس الدموية عد الخلايا غسيل