Étiquetage des cellules souches avec des colorants fluorescents pour les non-invasive de détection avec l'imagerie optique

Summary

Cette vidéo montre des techniques pour l'étiquetage des cellules souches embryonnaires humaines et des cellules souches mésenchymateuses avec des colorants fluorescents. Cette technique peut être utilisée pour un suivi in ​​vivo des cellules souches transplantées avec l'imagerie optique et des corrélations histopathologiques avec la microscopie à fluorescence.

Abstract

Imagerie optique (IO) est un outil facile, rapide et peu coûteuse pour la surveillance in vivo de nouvelles thérapies basées sur les cellules souches. La technique est basée sur l'étiquetage ex vivo de cellules souches avec un colorant fluorescent, après injection intraveineuse de cellules marquées et la visualisation de leur accumulation dans les organes cibles spécifiques ou des pathologies. La technique présentée montre comment nous appelons cellules souches mésenchymateuses humaines (hMSC) par simple incubation avec le colorant lipophile fluorescent DID (C67H103CIN2O3S) et comment nous l'étiquette des cellules souches embryonnaires humaines (CSEh) avec la FDA a approuvé un colorant fluorescent vert d'indocyanine (ICG). Le mécanisme d'absorption se fait par l'adhésion et la diffusion du colorant lipophile travers la bicouche membranaire phospholipidique cellulaire. L'efficacité du marquage est généralement améliorée si les cellules sont incubées avec du colorant dans un milieu sans sérum, par opposition à l'incubation dans le sérum contenant des médias. Par ailleurs, l'ajout de l'agent de transfection sulfate de protamine améliore significativement l'absorption de produit de contraste.

Protocol

Étiquetage des cellules souches mésenchymateuses avec le colorant fluorescent DiD

1. Pour commencer la procédure de marquage des cellules souches mésenchymateuses, trypsiniser et compter les cellules pour obtenir une suspension avec un nombre défini de cellules.
2. Prenez les cellules de l'incubateur et aspirer à de vieux médias des flacons contenant les cellules à être étiquetés
3. Laver les cellules avec 10 ml de Mg / Ca sans PBS. Aspirer le PBS. Le Mg et Ca serait inhiber la trypsine, donc nous utilisons PBS sans eux.
4. Ajouter préchauffé trypsine à 0,05%, pour un flacon de 5ml T75 que nous utilisons. Assurez-vous que toute la surface du flacon est recouverte.
5. Incuber à 37 ° C dans l'incubateur pendant environ 5 minutes.
6. Confirmer le détachement sous le microscope. Si les cellules adhèrent encore à la fiole, appuyez quelques fois et d'attendre un peu plus longtemps jusqu'à ce que le traitement à la trypsine est réussie.
7. Maintenant, il est nécessaire de neutraliser la trypsine en ajoutant un milieu contenant 10% de FCS. Nous utilisons une quantité égale de médias comme il ya la trypsine.
8. Pipeter haut et en bas à quelques reprises pour s'assurer que toutes les cellules sont remises en suspension dans les médias.
9. Transférer la solution de cellules dans un tube stérile en polypropylène 15ml plafonné.
10. Centrifuger à 400 rcf pendant 5 minutes.
11. Aspirer le surnageant veillant à ne pas perturber le culot cellulaire.
12. Resuspendre les cellules dans du DMEM et procéder à la numération cellulaire.
13. Suspendre les cellules pour être étiquetés avec une densité de 1x10 ^ 6 par ml dans un milieu de culture sans sérum (DMEM).
14. Ce fut toute la préparation de la suspension cellulaire. Maintenant, il est prêt à commencer à l'étiquetage.
15. D'abord, ajouter 5 uL d'agent de contraste DiD par ml de suspension cellulaire.
16. Ensuite, mélanger la solution par un léger pipetage.
17. Incuber les cellules avec la solution d'étiquetage à 37 ° C pendant 20 minutes dans un 6-même faible attachement plat.
18. Une fois que le simple incubation est terminée, il est nécessaire de transférer la solution de cellules dans un tube de 15 ml en polypropylène plafonné.
19. Il Centrifugeuse bas à 400 fcr pendant 5 minutes.
20. Aspirer le milieu de marquage, assurant ne pas perturber le culot cellulaire.
21. Laver les cellules avec du PBS. Pipeter les cellules de haut en bas, en veillant à briser le culot cellulaire.
22. Répétez les deux dernières étapes deux fois plus, il ya donc un total de 3 étapes de lavage.
23. Compter les cellules et effectuer un test au bleu Trypan pour déterminer la viabilité cellulaire. Ce sont des protocoles standard de culture de cellules que nous n'allons pas expliquer ici.
24. Vos cellules sont maintenant prêtes à être visualisées dans imageur optique.

Étiquetage des cellules souches embryonnaires humaines avec le GIC colorant fluorescent

1. Pour commencer la procédure d'étiquetage cellules souches embryonnaires humaines, préparer l'agent de contraste vert d'indocyanine. Mélangez-le avec l'agent de transfection de protamine.
2. Mesurer 1mg de la poudre vert d'indocyanine. Dissoudre la poudre ICG dans 100 ul de diméthylsulfoxyde (DMSO).
3. Ajouter 400 ul de milieu de Dulbecco Modified Eagles (DMEM + 10% de veau foetal Sérum) médias pour le mélange et bien brasser. Il en résulte une concentration finale de 2mg/ml du vert d'indocyanine.
4. Ajouter la protamine agent de transfection. Actes de protamine comme une navette pour l'agent de contraste, de sorte qu'elle pénètre dans la cellule de manière plus efficace.
5. Mélanger 5 Sulfate de protamine uL, qui est fourni à une concentration de 10mg/ml, avec 300 uL GIC et 300 uL sans sérum modifié par Dulbecco Eagles Medium.
6. Secouez la solution de transfection de nouvelles pendant 5 minutes pour permettre des opérations complexes à se former.
7. La solution d'étiquetage est prêt.
8. Aspirer le vieux médias à partir de CSEh 10mm boîte de Petri.
9. Ajouter 5 ml de pré-chauffé DMEM sans sérum.
10. Ajouter la solution préparée précédemment protamine / GIC pour les cellules. Démarrer l'incubation 1 heure en plaçant le plat dans un incubateur à 37 ° C.
11. Après l'incubation est terminée, retirez le plat de l'incubateur et aspirer la solution d'étiquetage.
12. Laver les cellules en rinçant le plat avec 5 ml de PBS.
13. Aspirer le PBS et le remplacer par 5ml de trypsine à 0,25%. Incuber le plat à 37 ° C pendant 5 minutes pour permettre à trypsinisation de se produire. Il contribue à secouer le plat un peu chaque fois dans un moment.
14. Délicatement la pipette de haut en bas, pour briser les colonies restantes.
15. Neutraliser la trypsine en ajoutant une quantité égale de KSR au plat.
16. Transférer la solution de cellules dans un tube de 15ml et centrifuger la solution à 400 rcf pendant 5 minutes.
17. Resuspendre les cellules dans les médias complet.
18. Si il ya encore des touffes à ce point, trypsiniser et centrifuger à nouveau.
19. Une fois un bouquet solution sans cellule est atteint, aspirer le vieux médias et resuspendre le culot dans 10 ml de pré-chauffé médias ESC complet.
20. À ce stade, il est nécessaire de séparer les cellules nourricières de souris de la CSEh. Ceci est fait pour assurer que, plus tard, seulement l'imagerie des cellules de la tige se produit.
21. Pour cela, le transfert èmesolution cellulaire e pour une gélatine revêtement plat 10 cm.
22. Mettez le plat dans l'incubateur 37 ° C et laissez-le reposer pendant 45 minutes. Pendant ce temps, assurez-vous de ne pas déranger le plat. Maintenant, les mangeoires se conformer à l'antenne et les cellules souches ne sera pas.
23. Transférer la solution de la boîte de Pétri. et maintenant nous avons une solution unique étiquetés cellules de cellules souches embryonnaires humaines.
24. Les cellules peuvent maintenant être comptés et un test au bleu Trypan peut être effectué sur eux.
25. Les cellules sont prêtes à être imagé!

Discussion

OI est une technique relativement nouvelle imagerie, basée sur la détection de la fluorescence. OI est aussi sensible que les techniques d'imagerie basée sur radiotraceur, mais pas associée à une exposition à l'irradiation. OI fournit un moyen efficace de cellules de suivi de façon non invasive et répétitive, offrant ainsi un aperçu de la migration des cellules vers le site cible. Une limitation majeure de la technique est la pénétration tissulaire limité de sondes fluorescentes in vivo. Ainsi, une accumulation de traceur dans les tissus profonds, plus de 5-10 cm de la surface de la peau, peuvent ne pas être détecté. Courant applications cliniques sont limitées à des techniques superficielles telles que l'endoscopie, imagerie cardio-vasculaire et la rétine (Funovics et al. 2003), mais ce domaine de recherche continuera de se développer grâce à la reconnaissance des vastes possibilités offertes par la cellule de suivi in ​​vivo.

Materials

Name	Type	Company	Catalog Number	Comments
Indocyanine Green (IR-125)	Reagent	Fisher Scientific	AC41254-1000
DMSO	Reagent	Sigma-Aldrich	D-2650
D-MEM High Glucose	Reagent	Sigma-Aldrich	D5648
Gelatin	Reagent	Sigma-Aldrich	G1890	Dilute to final concentration of 0.1% in PBS
PBS, Mg and Ca free	Reagent	GIBCO, by Life Technologies	14190-144
Trypsin-EDTA 0.05%	Reagent	Invitrogen	25300-120
Trypsin-EDTA 0.25%	Reagent	Invitrogen	25200-114
FCS, characterized	Reagent	Hyclone	SH30071.03
Cell Strainer (40 μm Nylon)	Reagent	BD Biosciences	352340
DiD	Reagent	Molecular Probes, Life Technologies	V-22887
Knockout DMEM	Reagent	GIBCO, by Life Technologies	10829018
Knockout Serum Replacer	Reagent	GIBCO, by Life Technologies	10828028
b-Mercapt–thanol	Reagent	Sigma-Aldrich	7522
Non-essential Amino Acids	Reagent	GIBCO, by Life Technologies	11140050
FGF-2	Reagent	R&D Systems	233-FB-025
Glutamine 200mM	Reagent	GIBCO, by Life Technologies	25030081
Penicillin/Streptomycin	Reagent	GIBCO, by Life Technologies	15140-122
Protamine Sulfate	Reagent	American Pharmaceutical Partners