Summary
Abbiamo usato sincrotrone tomografia a raggi X alla European Synchrotron Radiation Facility (ESRF) a non invasivo produrre set di dati 3D tomografiche con un pixel-risoluzione di 0.7μm. Utilizzando il software di rendering del volume, questo permette la ricostruzione di strutture interne allo stato naturale, senza gli artefatti prodotti dal sezionamento istologico.
Abstract
Poco si sa circa l'organizzazione interna di molte micro-artropodi corpo con dimensioni inferiori a 1 mm. Le ragioni di che sono le dimensioni ridotte e la cuticola dura che rende difficile utilizzare protocolli di istologia classica. Inoltre, sezionamento istologici distrugge il campione e non può quindi essere utilizzato per materiale unico. Quindi, un metodo non distruttivo è auspicabile che consente di visualizzare all'interno di piccoli campioni, senza la necessità di sezionamento.
Abbiamo usato sincrotrone tomografia a raggi X alla European Synchrotron Radiation Facility (ESRF) a Grenoble (Francia) per non invasivo produrre set di dati 3D tomografiche con un pixel-risoluzione di 0.7μm. Utilizzando il software di rendering del volume, questo ci permette di ricostruire l'organizzazione interna nel suo stato naturale, senza gli artefatti prodotti dal sezionamento istologico. Queste data può essere utilizzato per la morfologia quantitativa, punti di riferimento, o per la visualizzazione di film d'animazione per capire la struttura delle parti del corpo nascoste ed a seguire sistemi di organi o tessuti completi attraverso i campioni.
Protocol
Animali utilizzati in questo studio
I campioni dell'acaro partenogenetica oribatid Archegozetes longisetosus (Acari, Oribatida) sono state prese dalla nostra cultura di laboratorio. La cultura si sviluppa su un intonaco di Parigi / mix carbone (9:1) in vasi di plastica, nel buio costante a 20-23 ° C con circa il 90% di umidità dell'aria.
Preparazione del campione
- I campioni sono stati prelevati dalla cultura, pulita con un pennello fine e collocato in una miscela 06:03:01 del 80% etanolo, 35% di formaldeide e il 100% di acido acetico per 24 ore.
- Successivamente, i campioni sono stati disidratati in una serie graduata di etanolo al 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% e 100% con 3 cambi per ogni concentrazione, e 10 minuti tra i gradini.
- Infine, i campioni sono stati messi in fresco punto di etanolo al 100% durante la notte e critico secco di CO 2 (CPD 020, Balzers). Esemplari secchi sono state allegate alla punta di perni di plastica (1,2 lunga cm 3,0 millimetri di diametro).
Sincrotrone tomografia a raggi X
Tomografia a raggi X è stata eseguita in linea di luce ID19 (ESRF, Grenoble, Francia, esperimento SC-2127).
- I campioni sono stati montati nel supporto del campione e regolato su una posizione centrale nel fascio.
- I campioni sono stati misurati con una energia di 20,5 keV. Le radiografie sono state registrate con una CCD raffreddata (ESRF Frelon telecamera) con un 14-bit gamma dinamica, 2048 × 2048 pixel e una dimensione di pixel effettivo di 0,7 micron. 1500 proiezioni sono state registrate oltre la rotazione di 180 ° campione con un tempo di esposizione di 0,35 s per ogni proiezione. Il rilevatore a distanza campione era di 20 mm.
Utilizzando una certa distanza tra campione e rivelatore consente l'imaging differenziale di materiali con bassa raggi X coefficienti di attenuazione (Cloetens, et al. 1996), che produrrebbe insufficiente contrasto nella diagnostica per immagini di assorbimento (dove il campione è situato direttamente di fronte al rivelatore ). Conta di più biologici sono oggetti fase, composti da materiali con basso assorbimento e / o solo piccole differenze nel numero atomico (Betz, et al. 2007). Tuttavia, la fase migliore tomografia richiede una coerenza elevata spaziale di un omogeneo fascio di raggi X. Pertanto, la radiazione di sincrotrone è più adatta desktop-scanner per questo tipo di misurazioni.
Analisi dei dati
- Le radiografie risulta 2D sono stati trasformati in dati 3D voxel (8-bit grigio-valori) con un retro-proiezione filtrata algoritmo (Cloetens, et al, 1997).
- I dati voxel sono stati analizzati con il software vgstudio Max 1.2.1. (Grafica del volume, Heidelberg, Germania).
- Grigio-valori del fondo sono stati rimossi dalla istogramma per la visualizzazione 3D.
- Predefiniti fotocamera percorsi sono stati utilizzati per generare animazioni di rotazione e piani di ritaglio animati.
- Un percorso definito dall'utente fotocamera è stata generata per seguire l'apparato digerente di A. longisetosus.
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Discussion
In questa presentazione, ci siamo concentrati sulla visualizzazione 3D dell'anatomia interna di un chelicerate micro-artropodi. I raggi X di sincrotrone misurazioni permettono un pixel di risoluzione fino a 0.3μm, a seconda delle dimensioni del campione. Qui, abbiamo dimostrato con dati 0.7μm pixel di risoluzione. In generale, sincrotrone tomografia a raggi X può essere utile per analizzare piccoli materiali biologici (o tessuti) a basso raggi X attenuazione. La risoluzione raggiunge quasi quella della microscopia ottica convenzionale. La tecnica può essere applicata a qualsiasi tipo di materiale per il quale l'organizzazione interna è di interesse e che non deve essere distrutto da sezionamento. Sezionamento istologico, però, ha il vantaggio che i tessuti possono essere colorati in modo differenziale, che non è possibile con la tomografia a raggi X. Ma qui, a differenza di grigio i valori corrispondono a tessuti con differenti raggi X attenuazione, e il grigio-valore di distribuzione può essere espansa utilizzando la tomografia quantitativa fase (holotomography;. Cloetens et al, 1999; Heethoff & Cloetens, 2008). La tecnica di sincrotrone tomografia a raggi X è prezioso straordinario per i seguenti motivi:
- preparazione del campione è facile e limitata alla fissazione e l'essiccazione, senza sezionamento istologico è necessario
- il metodo è non invasivo: l'organizzazione interna del campione può essere osservato in stato naturale
- il set di dati risultante può essere analizzato in qualsiasi posizione desiderata che è diverso dal sezionamento istologici in cui sono fissate le sezioni per un orientamento.
Vi consigliamo considerare questa tecnica ogni volta che le strutture interne allo stato naturale o di piccoli campioni di campioni che non devono essere distrutti (per esempio, i fossili in ambra o tipo-campioni) devono essere analizzati. Naturalmente, questa tecnica non si limita ai materiali biologici, ma qui è il più grande vantaggio per la possibilità di analizzare i materiali con i raggi X che hanno una bassa attenuazione dei raggi X.
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Acknowledgments
Ringraziamo Paavo Bergmann, Michael Laumann, e Sebastian Schmelzle per il loro aiuto presso l'ESRF. Questo lavoro è stato supportato dal progetto europeo delle radiazioni al sincrotrone SC-2127 attraverso l'assegnazione di tempo del fascio.
References
- Betz, O., Wegst, U., Weide, D., Heethoff, M., Helfen, L., Lee, W. -K., Cloetens, P. Imaging applications of synchrotron X-ray phase-contrast microtomography in biological morphology and biomaterial science. I. General aspects of the technique and its advantages in the analysis of millimetre-sized arthropod structure. J. Microscopy. 22, 51-71 (2007).
- Cloetens, P., Barrett, R., Baruchel, J., Guigay, J. P., Schlenker, M. Phase objects in synchrotron radiation hard X-ray imaging. J. Phys. D: Appl. Phys. 29, 133-146 (1996).
- Cloetens, P., Pateyron-Salome, M., Buffiere, J. Y., Peix, G., Baruchel, J., Peyrin, V., Schlenker, M. Observation in microstructure and damage in materials by phase sensitive radiography and tomography. J. Apll. Phys. 81, 5878-5886 (1997).
- Clotens, P., Ludwig, W., Baruchel, J., van Dyck, D., van Landyut, J., Guigay, J. P., Schlenker, M. Holotomography: quantitative phase tomography with micrometer resolution using hard synchrotron radiation X-rays. Appl. Phys. Lett. 75, 2912-2914 (1999).
- Heethoff, M., Cloetens, P. A Comparison of aynchrotron X-ray phase contrast tomography and holotomography for non-invasive investigations of the internal anatomy of mites. Soil Organisms. , (2008).
