Name: measuring protein concentration with absorbance
Uploaded: 2023-04-30T06:31:14.000Z
Duration: 8 min 49 s
Channel: JoVE

K12 Standards

Next Generation Science Standards

High School

Physical Science

waves-and-their-applications-in-technologies-for-information-transfer

Waves and Their Applications in Technologies for Information Transfer

HS-PS4-4

Photometric Protein Determination

Konsantrasyonun ölçülmesi, birçok biyokimyasal analizin temel bir adımıdır. Fotometrik protein tayini, bir numune ne kadar çok ışık emici madde içerirse, ışığın içinden o kadar az geçeceği gerçeğinden yararlanır. Konsantrasyon ve absorpsiyon arasındaki ilişki doğrusal olduğundan, bu fenomen, bilinmediği numunelerdeki konsantrasyonu ölçmek için kullanılabilir. 
Bu videoda fotometrik protein tayininin temelleri açıklanmakta ve Bradford Deneyi ile Lowry Metodu tanıtılmaktadır. Videodaki prosedür tipik bir Bradford testini kapsayacaktır. Kapsanan uygulamalar arasında, konsantrasyon ve saflığı karakterize etmek için çok küçük hacimlerde nükleik asitlerin doğrudan ölçümü, bir biyomimetik malzemenin birleştirme verimliliğinin belirlenmesi ve Remazol boyası kullanılarak fotometrik protein tayininin başka bir varyasyonu yer alır.

fotometrik protein tayini

Konsantrasyonun ölçülmesi, birçok biyokimyasal analizin temel bir adımıdır. Fotometrik protein tayini, bir numune ne kadar çok ışık emici madde içerirse, ışığın içinden o kadar az geçeceği gerçeğinden yararlanır. Konsantrasyon ve absorpsiyon arasındaki ilişki doğrusal olduğundan, bu fenomen, bilinmediği numunelerdeki konsantrasyonu ölçmek için kullanılabilir. 
Bu videoda fotometrik protein tayininin temelleri açıklanmakta ve Bradford Deneyi ile Lowry Metodu tanıtılmaktadır. Videodaki prosedür tipik bir Bradford testini kapsayacaktır. Kapsanan uygulamalar arasında, konsantrasyon ve saflığı karakterize etmek için çok küçük hacimlerde nükleik asitlerin doğrudan ölçümü, bir biyomimetik malzemenin birleştirme verimliliğinin belirlenmesi ve Remazol boyası kullanılarak fotometrik protein tayininin başka bir varyasyonu yer alır. 
<div class="chapter_text" id="script_0">
	Numunelerdeki bir proteinin konsantrasyonunun belirlenmesi, birçok biyokimyasal analizde temel bir adımdır. Fotometrik belirleme küçük numune boyutları ile yapılabilir. Bir numune ne kadar çok ışık emici madde içeriyorsa, ışık içinden o kadar az geçecektir. Bu, emici maddelerin kantitatif bir ölçümünü sağlar. Bu kavramlar bilim için o kadar temeldir ki, tekniklerden ikisini tanıtan makaleler tüm zamanların en çok alıntı yapılan üç makalesinde yer almaktadır. Bu video, en yaygın fotometrik protein belirleme tekniklerinden bazılarının arkasındaki kavramları, bunların nasıl gerçekleştirildiğini ve toplanan verilerin nasıl analiz edildiğini gösterecektir. 
</div>
<div class="chapter_text" id="script_1">
	Fotometrik protein tayini, konsantrasyon ve ışık emiciliği arasındaki ilişkiye dayanmaktadır. Bu, ışığı emen bir türün konsantrasyonunun absorbansı ile orantılı olduğunu belirten Beer-Lambert Yasası olarak bilinir. 
	Bu ilke, tüm fotometrik protein belirleme yöntemlerinin temelini oluşturur. 
	Doğrudan absorpsiyon analizi için, değiştirilmemiş protein numunelerinin absorbans değerleri ölçülür. Aromatik yan zincirleri nedeniyle, triptofan ve tirozin kalıntıları, 280 nm dalga boyunda en yüksek absorbans okumalarını verir. 
	Bununla birlikte, proteinlerde en az bulunan iki amino asit, her proteinde farklı miktarlarda bulunur, bu nedenle her belirleme benzersizdir. Bu sınırlamanın üstesinden gelmek için, bu amino asitlere bağımlı olmayan daha karmaşık tahliller geliştirilmiştir. 
	Bir örnek, numuneye renkli boyanın eklendiği Bradford Testi'dir. Coomassie Blue olarak bilinen boya, orantılı olarak yanıt verir - ne kadar fazla protein varsa, boya ile o kadar fazla bağlanma olayı olur. 
	Daha sonra, protein konsantrasyonu, 594 nm'de ışığı emen bağlı Coomassie Blue boyasının absorbansı ölçülerek belirlenir. Bununla birlikte, Bradford testi kısa bir konsantrasyon aralığında doğrusaldır, bu nedenle analizden önce genellikle seyreltmeler gereklidir. 
	Lowry Yöntemi, peptit bağlarıyla reaksiyona giren alkali bir bakır iyonu çözeltisi olan Biuret reaktifini ve aromatik protein kalıntılarını oksitleyen Folin-Ciocâlteu reaktifini birleştirir. Numunenin ortaya çıkan renk değişimi, protein konsantrasyonu ile orantılıdır. 
	İndirgenmiş Folin reaktifinin emilimi 750 nm'de belirlenebilir. Doğrudan absorpsiyon gibi, her proteinin benzersiz bir tepkisi vardır ve ilgilenilen protein için kalibre edilmesi gerekir. Artık en yaygın tahlillerden bazılarının arkasındaki temel ilkeleri gözden geçirdiğimize göre, doğrudan absorpsiyon ve Bradford tahlilinin nasıl yapıldığına bakalım. 
</div>
<div class="chapter_text" id="script_2">
	Doğrudan absorpsiyon analizine başlamak için, spektrofotometre sıfır absorbansı belirlemek için bir boşluk ile kalibre edilir. Kalibrasyon eğrisinin oluşturulmasında kullanılmak üzere standart çözeltiler hazırlanır. Daha sonra, birinci standardın bir alikotu bir küvete eklenir ve spektrofotometreye yerleştirilir. 
	280 nm'deki absorbans değeri daha sonra kaydedilir. Bu işlem, her çalışma için temiz bir küvet kullanılarak her standart için tekrarlanır. Tamamlandığında, absorbansa karşı konsantrasyon çizilerek bir kalibrasyon eğrisi oluşturulur. Bu çizginin eğimi, absorbansı konsantrasyonla ilişkilendiren molar zayıflama katsayısıdır. 
	Daha sonra, bilinmeyen numune bir küvete eklenir ve absorbans değeri kaydedilir. Farklı fotometrik belirleme yöntemleri için veri analizi benzer olduğundan, Bradford testine baktıktan sonra bunu ele alacağız. 
	Burada, Bradford protein testi, 96 oyuklu bir plaka üzerinde bir BSA standardı ile gerçekleştirilir. Başlangıç olarak, BSA stok çözümleri hazırlanır. 
	Bilinmeyen çözeltiler, konsantrasyonların tahlil aralığında olduğundan emin olmak için deiyonize su ile seyreltilir. Kite bağlı olarak, Coomassie boyasının seyreltilmesi de gerekebilir. Daha sonra, 96 oyuklu plakaya BSA standartları eklenerek kalibrasyon eğrisi oluşturulur. 
	Standart bir eğri oluşturmak için gerekli konsantrasyona ulaşmak için deiyonize su eklenir. Doğru bir ölçümün alındığından emin olmak için bilinmeyen numune plakaya üç nüsha halinde eklenmelidir. Coomassie boyası daha sonra pipetle karıştırılarak her bir oyuğa eklenir. 
	Deiyonize su, emiciliği ölçmek için boş bir kuyuya boş olarak eklenir. Boyanın bağlanması için 5 dakika bekledikten sonra, absorbans 590 nm'de bir plaka okuyucuda ölçülür. 
</div>
<div class="chapter_text" id="script_3">
	Şimdi birkaç tahlil yaptığımıza göre, verileri nasıl analiz edeceğimize bakalım. Her fotometrik protein belirleme yöntemi, Beer-Lambert Yasasına dayanmaktadır. 
	Standartların ölçülen absorbansı, daha sonra bilinmeyen numunelerin konsantrasyonunu belirlemek için kullanılan bir kalibrasyon eğrisi oluşturmak için kullanılır. Bu eğri manuel olarak çizilebilir, ancak daha yeni spektrofotometrik araçlar, tüm standartlar ölçüldükten sonra kalibrasyon eğrisini oluşturacaktır. Bu sistemler, bilinmeyen numuneler analiz edilirken protein konsantrasyonunu da hesaplayacaktır. 
</div>
<div class="chapter_text" id="script_4">
	Fotometrik protein belirleme verilerinin nasıl analiz edileceğini gözden geçirdiğimize göre, bu prosedürlerin kullanıldığı bazı yollara bakalım. 
	Fotometrik protein tayininin ilkeleri, nükleik asit konsantrasyonunu doğrudan ölçmek için de kullanılabilir. Nanodrop spektrofotometresi, optik olarak aktif bir kaide üzerine çok küçük hacimli numuneleri kabul eder. Absorbans daha sonra ölçülür ve sistem otomatik olarak nükleik asit konsantrasyonunu belirler. Proteinler ve diğer kaynaklar ölçümlerle çakışabileceğinden, numune saflığı 260 ila 280 nm ve 260 ila 230 nm absorbans oranları analiz edilerek belirlenir. Saf nükleik asitler tipik olarak DNA ve RNA için sırasıyla yaklaşık 1.8 ve yaklaşık 2.0 oranları verir. 
	Fotometrik protein tayini, belirli hücresel tepkileri ortaya çıkarmak için doğadan ilham alan biyomimetik malzemelerin üretiminde de kullanılabilir. Rekombinant adezinler, konakçı hücrelere bakteri bağlanmasını simüle etmek için polistiren boncuklara bağlanır. Bradford testi, biyomimetik malzemenin üretiminde boncuklara rekombinant yapışmanın birleştirme verimliliğini belirlemek için kullanılır. 
	Alternatif fotometrik protein tahlilleri, protein antimikrobiyallerinin tespiti ve karakterizasyonunda kullanılabilir. Remazol parlak mavi R boyası, ısıyla öldürülen bakterilere kovalent olarak bağlanır. Antimikrobiyal protein, boyalı çözelti içinde inkübe edilir. Daha sonra numune santrifüjlenir ve süpernatantın 595 nm'deki emilimi bir mikroplaka spektrofotometresi kullanılarak ölçülür. Etiketli bakterilerden süpernata salınan çözünür boya ile artan absorbans, enzimatik aktivitenin kantitatif bir ölçümüdür. 
</div>
<div class="chapter_text" id="script_5">
	Az önce JoVE'nin fotometrik protein tayini ile ilgili videosunu izlediniz. Bu video, fotometrik belirlemenin altında yatan ilkeleri açıkladı, bazı yaygın tahliller için genel prosedürleri gözden geçirdi ve tekniklerdeki bazı yeni gelişmeleri kapsıyordu. İzlediğiniz için teşekkürler! 
</div>

Fotometrik Protein Tayini

Measuring the concentration is a fundamental step of many biochemical assays. Photometric protein determination takes advantage of the fact that the more ...

Numunelerdeki bir proteinin konsantrasyonunun belirlenmesi, birçok biyokimyasal analizde temel bir adımdır. Fotometrik belirleme küçük numune boyutları ile yapılabilir. Bir numune ne kadar çok ışık emici madde içeriyorsa, ışık içinden o kadar az geçecektir. Bu, emici maddelerin kantitatif bir ölçümünü sağlar. Bu kavramlar bilim için o kadar temeldir ki, tekniklerden ikisini tanıtan makaleler tüm zamanların en çok alıntı yapılan üç makalesinde yer almaktadır. Bu video, en yaygın fotometrik protein belirleme tekniklerinden bazılarının arkasındaki kavramları, bunların nasıl gerçekleştirildiğini ve toplanan verilerin nasıl analiz edildiğini gösterecektir. Fotometrik protein tayini, konsantrasyon ve ışık emiciliği arasındaki ilişkiye dayanmaktadır. Bu, ışığı emen bir türün konsantrasyonunun absorbansı ile orantılı olduğunu belirten Beer-Lambert Yasası olarak bilinir. Bu ilke, tüm fotometrik protein belirleme yöntemlerinin temelini oluşturur. Doğrudan absorpsiyon analizi için, değiştirilmemiş protein numunelerinin absorbans değerleri ölçülür. Aromatik yan zincirleri nedeniyle, triptofan ve tirozin kalıntıları, 280 nm dalga boyunda en yüksek absorbans okumalarını verir. Bununla birlikte, proteinlerde en az bulunan iki amino asit, her proteinde farklı miktarlarda bulunur, bu nedenle her belirleme benzersizdir. Bu sınırlamanın üstesinden gelmek için, bu amino asitlere bağımlı olmayan daha karmaşık tahliller geliştirilmiştir. Bir örnek, numuneye renkli boyanın eklendiği Bradford Testi'dir. Coomassie Blue olarak bilinen boya, orantılı olarak yanıt verir - ne kadar fazla protein varsa, boya ile o kadar fazla bağlanma olayı olur. Daha sonra, protein konsantrasyonu, 594 nm'de ışığı emen bağlı Coomassie Blue boyasının absorbansı ölçülerek belirlenir. Bununla birlikte, Bradford testi kısa bir konsantrasyon aralığında doğrusaldır, bu nedenle analizden önce genellikle seyreltmeler gereklidir. Lowry Yöntemi, peptit bağlarıyla reaksiyona giren alkali bir bakır iyonu çözeltisi olan Biuret reaktifini ve aromatik protein kalıntılarını oksitleyen Folin-Ciocłteu reaktifini birleştirir. Numunenin ortaya çıkan renk değişimi, protein konsantrasyonu ile orantılıdır. İndirgenmiş Folin reaktifinin emilimi 750 nm'de belirlenebilir. Doğrudan absorpsiyon gibi, her proteinin benzersiz bir tepkisi vardır ve ilgilenilen protein için kalibre edilmesi gerekir. Artık en yaygın tahlillerden bazılarının arkasındaki temel ilkeleri gözden geçirdiğimize göre, doğrudan absorpsiyon ve Bradford tahlilinin nasıl yapıldığına bakalım. Doğrudan absorpsiyon analizine başlamak için, spektrofotometre sıfır absorbansı belirlemek için bir boşluk ile kalibre edilir. Kalibrasyon eğrisinin oluşturulmasında kullanılmak üzere standart çözeltiler hazırlanır. Daha sonra, birinci standardın bir alikotu bir küvete eklenir ve spektrofotometreye yerleştirilir. 280 nm'deki absorbans değeri daha sonra kaydedilir. Bu işlem, her çalışma için temiz bir küvet kullanılarak her standart için tekrarlanır. Tamamlandığında, absorbansa karşı konsantrasyon çizilerek bir kalibrasyon eğrisi oluşturulur. Bu çizginin eğimi, absorbansı konsantrasyonla ilişkilendiren molar zayıflama katsayısıdır. Daha sonra, bilinmeyen numune bir küvete eklenir ve absorbans değeri kaydedilir. Farklı fotometrik belirleme yöntemleri için veri analizi benzer olduğundan, Bradford testine baktıktan sonra bunu ele alacağız. Burada, Bradford protein testi, 96 oyuklu bir plaka üzerinde bir BSA standardı ile gerçekleştirilir. Başlangıç olarak, BSA stok çözümleri hazırlanır. Bilinmeyen çözeltiler, konsantrasyonların tahlil aralığında olduğundan emin olmak için deiyonize su ile seyreltilir. Kite bağlı olarak, Coomassie boyasının seyreltilmesi de gerekebilir. Daha sonra, 96 oyuklu plakaya BSA standartları eklenerek kalibrasyon eğrisi oluşturulur. Standart bir eğri oluşturmak için gerekli konsantrasyona ulaşmak için deiyonize su eklenir. Doğru bir ölçümün alındığından emin olmak için bilinmeyen numune plakaya üç nüsha halinde eklenmelidir. Coomassie boyası daha sonra pipetle karıştırılarak her bir oyuğa eklenir. Deiyonize su, emiciliği ölçmek için boş bir kuyuya boş olarak eklenir. Boyanın bağlanması için 5 dakika bekledikten sonra, absorbans 590 nm'de bir plaka okuyucuda ölçülür. Şimdi birkaç tahlil yaptığımıza göre, verileri nasıl analiz edeceğimize bakalım. Her fotometrik protein belirleme yöntemi, Beer-Lambert Yasasına dayanmaktadır. Standartların ölçülen absorbansı, daha sonra bilinmeyen numunelerin konsantrasyonunu belirlemek için kullanılan bir kalibrasyon eğrisi oluşturmak için kullanılır. Bu eğri manuel olarak çizilebilir, ancak daha yeni spektrofotometrik araçlar, tüm standartlar ölçüldükten sonra kalibrasyon eğrisini oluşturacaktır. Bu sistemler, bilinmeyen numuneler analiz edilirken protein konsantrasyonunu da hesaplayacaktır. Fotometrik protein belirleme verilerinin nasıl analiz edileceğini gözden geçirdiğimize göre, bu prosedürlerin kullanıldığı bazı yollara bakalım. Fotometrik protein tayininin ilkeleri, nükleik asit konsantrasyonunu doğrudan ölçmek için de kullanılabilir. Nanodrop spektrofotometresi, optik olarak aktif bir kaide üzerine çok küçük hacimli numuneleri kabul eder. Absorbans daha sonra ölçülür ve sistem otomatik olarak nükleik asit konsantrasyonunu belirler. Proteinler ve diğer kaynaklar ölçümlerle çakışabileceğinden, numune saflığı 260 ila 280 nm ve 260 ila 230 nm absorbans oranları analiz edilerek belirlenir. Saf nükleik asitler tipik olarak DNA ve RNA için sırasıyla yaklaşık 1.8 ve yaklaşık 2.0 oranları verir. Fotometrik protein tayini, belirli hücresel tepkileri ortaya çıkarmak için doğadan ilham alan biyomimetik malzemelerin üretiminde de kullanılabilir. Rekombinant adezinler, konakçı hücrelere bakteri bağlanmasını simüle etmek için polistiren boncuklara bağlanır. Bradford testi, biyomimetik malzemenin üretiminde boncuklara rekombinant yapışmanın birleştirme verimliliğini belirlemek için kullanılır. Alternatif fotometrik protein tahlilleri, protein antimikrobiyallerinin tespiti ve karakterizasyonunda kullanılabilir. Remazol parlak mavi R boyası, ısıyla öldürülen bakterilere kovalent olarak bağlanır. Antimikrobiyal protein, boyalı çözelti içinde inkübe edilir. Daha sonra numune santrifüjlenir ve süpernatantın 595 nm'deki emilimi bir mikroplaka spektrofotometresi kullanılarak ölçülür. Etiketli bakterilerden süpernata salınan çözünür boya ile artan absorbans, enzimatik aktivitenin kantitatif bir ölçümüdür. Az önce JoVE'nin fotometrik protein tayini ile ilgili videosunu izlediniz. Bu video, fotometrik belirlemenin altında yatan ilkeleri açıkladı, bazı yaygın tahliller için genel prosedürleri gözden geçirdi ve tekniklerdeki bazı yeni gelişmeleri kapsıyordu. İzlediğiniz için teşekkürler!

Education

JoVE Science Education

Chemistry

Kimya

Biochemistry

Biyokimya

measuring protein concentration with absorbance

Measuring protein concentration with absorbance is a key step in many biochemical assays. Photometric methods use the fact that samples with more light-absorbing material transmit less light. Because concentration and absorption are directly related, this makes it possible to measure an unknown sample.

The core idea comes from the Beer-Lambert Law. This law states that the concentration of a light-absorbing species is proportional to its absorbance. The video also introduces the Bradford assay and the Lowry method, which are two common ways to measure protein without relying only on direct absorption.

Direct absorption analysis measures the absorbance of an unaltered protein sample. At 280 nm, tryptophan and tyrosine give the strongest readings because of their aromatic side chains. However, these amino acids are present in different amounts in different proteins, so each sample has to be treated on its own.

The Bradford assay solves that limitation by adding Coomassie Blue dye to the sample. The dye binds to protein, and the more protein present, the more dye binds. The bound dye is read at 594 nm, but the assay is linear only over a short range, so samples often need dilution before analysis.

The Lowry method uses two reagents. The Biuret reagent contains alkaline copper ions that react with peptide bonds, and the Folin-Ciocalteu reagent oxidizes aromatic residues. The resulting color change is proportional to protein concentration, and the reduced Folin reagent is measured at 750 nm. Like direct absorption, the method must be calibrated for the protein being tested.

A direct absorption run starts by blanking the spectrophotometer to set zero absorbance. Standard solutions are then measured in clean cuvettes at 280 nm, and the absorbance values are plotted to make a calibration curve. The slope of that line is the molar attenuation coefficient, and the unknown sample is measured against the same curve.

The Bradford assay is often done on a 96-well plate using BSA standards. The unknown samples are diluted with deionized water so they fall within the assay range, and the standards are added to build a standard curve. The unknowns are usually added in triplicate, Coomassie dye is mixed into each well, a blank well contains deionized water, and the plate is read after 5 min at 590 nm.

Data analysis for these assays is based on the same Beer-Lambert relationship. The standard readings create a calibration curve that is used to find the concentration of unknown samples. Some newer spectrophotometric systems build this curve automatically and calculate protein concentration as samples are analyzed.

These ideas also apply to other measurements. Very small amounts of nucleic acids can be measured with a Nanodrop spectrophotometer, which reads absorbance on an optically active pedestal and estimates concentration automatically. Sample purity is checked with the 260/280 and 260/230 absorbance ratios, which are typically about 1.8 and 2.0 for pure DNA and RNA, respectively.

Photometric methods are also used in biomimetic materials, which are inspired by nature to trigger specific cellular responses. In one example, recombinant adhesins are attached to polystyrene beads to mimic bacterial binding to host cells, and the Bradford assay measures coupling efficiency. Another variation uses Remazol brilliant blue R dye on heat-killed bacteria to detect protein antimicrobials by measuring dye released into the supernatant at 595 nm after centrifugation.

Measuring Protein Concentration with Absorbance

measuring-protein-concentration-with-absorbance

dialysis: diffusion based separation

Dialysis for Buffer Exchange in Biochemistry

Dialysis is a common biochemistry technique for buffer exchange and desalting. It separates molecules by diffusion through a semipermeable membrane, which lets small molecules pass while holding larger biomolecules inside the sample. The membrane is the key part of the setup. Its pores create a molecular weight cutoff, so a membrane such as a 10 kDa membrane usually keeps molecules larger than 10 kilodaltons inside. This cutoff is not exact, because membranes have a range of pore sizes.

enzyme assays and kinetics

Measuring Enzyme Reaction Rates

Enzyme reaction rates can be measured with assays that track how substrate or product levels change over time. Enzymes are proteins, or sometimes RNAs, that speed up chemical reactions by lowering the activation energy needed to start them. They act on a specific substrate and help form a product that supports life processes. Enzymatic reactions are often described in three steps. First, the substrate binds to the enzyme active site and forms an enzyme-substrate complex. That complex can fall...

maldi-tof mass spectrometry

How MALDI-TOF Reads Biomolecules

MALDI-TOF mass spectrometry reads biomolecules by using a laser, a matrix, and a time-of-flight analyzer. MALDI, or matrix-assisted laser desorption ionization, helps fragile molecules keep their structure while they are moved into the mass analyzer. The analyzer then separates compounds based on size and charge. In MALDI, the sample is mixed into a matrix, usually an organic compound with aromatic and conjugated double bonds. A laser pulse strikes the spot, and the matrix absorbs most of the...

tandem mass spectrometry

Tandem Mass Spectrometry for Biomolecule Analysis

Tandem mass spectrometry is used to isolate a biomolecule and break it into smaller pieces so its makeup can be studied. Because biomolecules often have large, complex structures, it can be hard to identify their molecular composition and sequence from a single measurement. By linking mass spectrometers in series, the technique first selects one ion and then analyzes the fragments it produces. The process starts with an ion source that converts the sample into ions. A mass analyzer then...

protein crystallization

Protein Crystals for Structure Analysis

Protein crystals help scientists study protein structure and function. A crystal is a solid lattice made from purified protein molecules. These crystals are useful in structural biology because they reveal details that methods like mass spectrometry and SDS-PAGE cannot show on their own. Protein crystallization is paired with recombinant protein expression and x-ray diffraction to support this work. The process starts with a large amount of very pure protein. Researchers often make that...

chromatography-based biomolecule purification methods

chromatography-based-biomolecule-purification-methods

Protein Purification with SEC and IMAC

Protein purification with size-exclusion chromatography and affinity chromatography helps isolate biomolecules from complex mixtures. These methods are common in biochemistry because purified samples are needed before a biomolecule’s properties and activity can be studied. The video focuses on the principles behind size-exclusion chromatography, affinity chromatography, and immobilized metal affinity chromatography, or IMAC. Size-exclusion chromatography, or SEC, separates molecules by size. A...

two-dimensional gel electrophoresis

Protein Mapping with 2D Gel Electrophoresis

Protein mapping with 2D gel electrophoresis separates complex protein mixtures across two steps. The method combines isoelectric focusing, or IEF, with sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis, or SDS-PAGE. Together, these methods can resolve thousands of biomolecules from a single sample by their isoelectric point and molecular weight. The first dimension is IEF. Each protein has an isoelectric point, or pI, which is the pH where its net charge is zero. Proteins are loaded...

metabolic labeling

Tracking Cell Chemistry with Metabolic Labels

Metabolic labeling tracks cell chemistry by using chemical analogs that cells take up and build into biomolecules. These labels help scientists follow biochemical changes and modifications inside cells. The labeled products can then be studied with tools such as SDS-PAGE and NMR to learn more about metabolic pathways. Several labeling strategies are shown here. Isotopic labeling uses analogs that match the natural molecule but contain uncommon isotopes, such as carbon-13 and nitrogen-15 in an...

electrophoretic mobility shift assay (emsa)

electrophoretic-mobility-shift-assay-emsa

Detecting Protein-DNA Binding by EMSA

Electrophoretic mobility shift assay, or EMSA, is a biochemical method used to detect binding between proteins and nucleic acids. It is also called a gel shift assay. The test compares how a labeled nucleic acid moves through a gel before and after it binds a protein. EMSA is used to see whether a specific protein binds to a specific nucleic acid. First, the nucleic acid is labeled to make a probe. The transcript describes radioactive phosphorus-32 as a common label. The probe is then mixed...

photometric protein determination

Measuring protein concentration with absorbance is a key step in many biochemical assays. Photometric methods use the fact that samples with more light-absorbing material transmit less light. Because concentration and absorption are directly related, this makes it possible to measure an unknown sample. The core idea comes from the Beer-Lambert Law. This law states that the concentration of a light-absorbing species is proportional to its absorbance. The video also introduces the Bradford assay...

density gradient ultracentrifugation

Sucrose Gradient Separation in an Ultracentrifuge

Sucrose gradient separation in an ultracentrifuge is a lab method for isolating cell parts and biomolecules. It uses differences in density to make particles sink or rise in a liquid. A high-speed ultracentrifuge speeds up this process so components can be separated without destroying them. The basic idea starts with a suspension, which is particles mixed in a liquid solvent. Particles that are denser than the solvent sediment, while less dense particles float. A rotor inside the...

co-immunoprecipitation and pull-down assays

co-immunoprecipitation-and-pull-down-assays

Protein Interaction Capture Methods in Cells

Co-immunoprecipitation and pull-down assays are laboratory methods used to capture stable protein-protein interactions. Protein-protein interactions help control many biological functions, but many of them have not yet been identified. These assays are related to immunoprecipitation, which isolates a target protein from a mixed sample using an antibody. In co-immunoprecipitation, or CoIP, an antibody binds the target protein, and that protein is already attached to another protein that the...

reconstitution of membrane proteins

Membrane Proteins in Liposome Models

Membrane proteins can be moved into liposome models so their function can be studied outside a cell. Reconstitution means restoring an isolated biomolecule to a working form. For membrane proteins, that usually means placing a purified protein into an artificial lipid membrane. Cell membranes are made mainly of phospholipids and membrane proteins. The phospholipids form a bilayer with hydrophilic phosphate heads facing water and hydrophobic fatty acid tails facing inward. Some membrane...

f&#246;rster resonance energy transfer (fret)

FRET as a Molecular Ruler in Cells

Föster resonance energy transfer, or FRET, is a way to study close-range biochemical interactions using light-emitting molecules. A donor fluorophore can pass energy to an acceptor fluorophore when their emission and absorption spectra overlap. This transfer happens only when the pair is very close together, usually within 10 nm. Because FRET depends on distance, it is often called a molecular or spectroscopic ruler. The strength of the signal is measured as FRET efficiency, which describes...

surface plasmon resonance (spr)

SPR Biosensors for Tracking Binding Kinetics

Surface plasmon resonance, or SPR, is a way to track biomolecular binding on a label-free biosensor. It is used to measure molecular affinity, kinetics, specificity, and concentration. The method works with a thin metal layer on a prism, where changes in reflected light reveal interactions in real time. SPR sensors use a thin layer of a noble metal on the face of a prism. Light is reflected from the prism-metal interface into a photodetector. At one specific angle, called the surface plasmon...

biochemistry

Bu koleksiyon, afinite kromatografisi gibi yaygın olarak kullanılan saflaştırma yöntemlerinin yanı sıra MALDI-TOF gibi analitik yöntemleri de sunmaktadır. Ayrıca videolar, biyomolekül etkileşimini ve işlevini değerlendirmek için kullanılan ko-immünopresipitasyon ve metabolik etiketleme gibi yöntemleri de sergilemektedir.

Learn how absorbance helps measure protein concentration with the Bradford assay, Lowry method, and direct absorption, plus related nucleic acid and biomaterial uses.

Measuring Protein Concentration with Absorbance | JoVE K12

HS-PS4-5

new-york-state-science-learning-standards

New York State Science Learning Standards

HS. Structure and Properties of Matter

HS-PS1-10.

HS. Waves and Electromagnetic Radiation

HS-PS4-4.

HS-PS4-5.

Life Science

Structure and Function

HS-LS1-1.

matter-and-energy-in-organisms-and-ecosystems

Matter and Energy in Organisms and Ecosystems

HS-LS1-6.

Inheritance and Variation of Traits

HS-LS3-1.

Overview

Principles of Photometric Protein Determination

Execution of Assays

Data Analysis

Applications

Summary

Travelling Waves

A wave is a disturbance that propagates from its source, repeating itself periodically, and is typically associated with simple harmonic motion. ...

Wave Parameters

The simplest mechanical waves are associated with simple harmonic motion and repeat themselves for several cycles. These simple harmonic waves can be ...

Equations of Wave Motion

Mathematically, the motion of a wave can be studied using a wavefunction. Consider a string oscillating up and down in simple harmonic motion, having a ...

Graphing the Wave Function

Consider the wave equation for a sinusoidal wave moving in the positive x-direction. The wave equation is a function of both position and time. From the ...

/files/media/science-education/science-education-thumbs/14721.jpg

Velocity and Acceleration of a Wave

A wave propagates through a medium with a constant speed, known as a wave velocity. It is different from the speed of the particles of the medium, which ...

Speed of a Transverse Wave

The speed of a wave depends on the characteristics of the medium. For example, in the case of a guitar, the strings vibrate to produce the sound. The ...

/files/media/science-education/science-education-thumbs/14722.jpg

Kinetic and Potential Energy of a Wave

All forms of waves carry energy; this is directly visualized in nature. For instance, the waves of earthquakes are so intense that they can shake huge ...

Energy and Power of a Wave

The total energy associated with a wavelength is the sum of the potential energy and the kinetic energy. The average rate of energy transfer associated ...

Propagation of Waves

When a wave propagates from one medium to another, part of it may get reflected in the first medium, and part of it may get transmitted to the second ...

Sound Waves

Sound waves can be thought of as fluctuations in the pressure of a medium through which they propagate. Since the pressure also makes the medium&#39;s ...

Sound as Pressure Waves

Sound waves, which are longitudinal waves, can be modeled as the displacement amplitude varying as a function of the spatial and temporal coordinates. As ...

/files/media/science-education/science-education-thumbs/14724.jpg

Speed of Sound in Solids and Liquids

Most solids and liquids are incompressible&#8212;their densities remain constant throughout. In the presence of an external force, the molecules tend to ...

Speed of Sound in Gases

The speed of sound in a gaseous medium depends on various factors. Since gases constitute molecules that are free to move, they are highly compressible. ...

Doppler Effect - I

The Doppler effect and Doppler shift were named after the Austrian physicist and mathematician Christian Johann Doppler in 1842, who conducted experiments ...

Doppler Effect - II

The Doppler effect has several practical, real-world applications. For instance, meteorologists use Doppler radars to interpret weather events based on ...

Shock Waves

While deriving the Doppler formula for the observed frequency of a sound wave, it is assumed that the speed of sound in the medium is greater than the ...

Echo

The human ear cannot distinguish between two sources of sound if they happen to reach within a specific time interval, typically 0.1 seconds apart. More ...

/files/media/science-education/science-education-thumbs/14729.jpg

Electromagnetic Waves

James Clerk Maxwell formulated a single theory combining all the electric and magnetic effects scientists knew during that time, calling the phenomena his ...

Generating Electromagnetic Radiations

The German physicist Heinrich Hertz (1857&#8211;1894) was the first to generate and detect certain types of electromagnetic waves in the laboratory. ...

Electromagnetic Wave Equation

Maxwell&#39;s equations for electromagnetic fields are related to source charges, either static or moving. These fields act on a test charge, whose ...

propagation-speed-of-electromagnetic-waves

Propagation Speed of Electromagnetic Waves

Electromagnetic waves are consistent with Ampere&#39;s law. Assuming there is no conduction current Ampere&#39;s law is given as:


Consider a plane ...

Electromagnetic Waves in Matter

Electromagnetic waves can travel in the vacuum as well as in matter. For example light, which is an electromagnetic wave, can travel through air, water, ...

Energy Carried By Electromagnetic Waves

Anyone who has used a microwave oven knows there is energy in electromagnetic waves. Sometimes, this energy is obvious, such as in the summer sun&#39;s ...

The Wave Nature of Light

The nature of light has been a subject of inquiry since antiquity. In the seventeenth century, Isaac Newton performed experiments with lenses and prisms ...

Use mathematical representations to support a claim regarding relationships among the frequency, wavelength, and speed of waves traveling in various media. [Clarification Statement: Examples of data could include electromagnetic radiation traveling in a vacuum and glass, sound waves traveling through air and water, and seismic waves traveling through the earth.] [Assessment Boundary: Assessment is limited to algebraic relationships and describing those relationships qualitatively.]

HS-PS4-1

The Electromagnetic Spectrum

Electromagnetic waves are categorized according to their wavelengths and frequencies, giving the electromagnetic spectrum. These waves are classified as ...

Classification of Signals

Signals are categorized as Continuous-time or discrete-time, Periodic or aperiodic, Analog or digital, and Causal or noncausal.
A continuous-time signal ...

Discrete Fourier Transform

Consider a vibration sensor that continuously captures data in the form of a continuous time-dependent signal.
However, in reality, the sensor can only ...

Discrete-Time Fourier Series

The Discrete-Time Fourier Series is a counterpart to the Fourier-series expansion of continuous-time periodic signals.
Calculating the expansion ...

Sampling Theorem

Consider the continuous-time signal x(t), and a train of impulses where Ts,&#xA0; is the sampling interval, and fs, is the sampling frequency.
Multiplying ...

Properties of Fourier Transform I

In radio broadcasting, Fourier Transform properties are applied in simultaneous multi-channel transmission, adjusting audio clip speeds, live broadcast ...

Signal and System

Signals are sets of data or information.
One-dimensional signals include single-variable functions, such as the variations in air pressure over time in ...

Methods of Documentation VII: EMR

Electronic Medical Records (EMRs) primarily center around electronically documenting patients&#39; health information within a single healthcare ...

Fast Fourier Transform

The Fast Fourier Transform, FFT, is a computational algorithm for calculating the Discrete Fourier Transform by breaking the calculations into smaller, ...

reconstruction-of-signal-using-interpolation

Reconstruction of Signal using Interpolation

Consider a continuous signal and its sampled counterpart with a sampling period T.
Applying a zero-order hold to the sampled signal results in a piecewise ...

Downsampling

Consider a sampled sequence with zero values between sampling instants. Replace it by taking every N-th value of the sampled sequence.
The original and ...

Design Example

An engineer designs a circuit for a speaker system with a 2 kHz crossover frequency requirement, considering the speaker&#39;s resistance of 8 ohms.
The ...

Upsampling

Consider a decimated signal with a reduced frequency range due to its lower sampling rate.
Insert zeros between each sample to upsample, that introduces ...

Properties of DTFT I

Consider two discrete-time signals, each with their respective Discrete-Time Fourier Transforms DTFTs.
The signals are first multiplied by constants a and ...

Relation of DFT to z-Transform

The Discrete Fourier Transform (DFT) analyzes the frequency content of discrete-time signals.
It maps the N-sampled discrete time-domain sequence to its ...

Feedback control systems

Feedback control systems are categorized as linear or nonlinear, time-varying or time-invariant, and classified by signal types as continuous or ...

Properties of the z-Transform I

Certain properties provide a solid foundation for analyzing discrete-time systems using the Z-transform.
Considering two discrete-time signals, the ...

Magnetic Resonance Imaging

Magnetic resonance imaging (MRI) is a noninvasive medical imaging technique based on a phenomenon of nuclear physics discovered in the 1930s, in which ...

Evaluate questions about the advantages of using digital transmission and storage of information. [Clarification Statement: Examples of advantages could include that digital information is stable because it can be stored reliably in computer memory, transferred easily, and copied and shared rapidly. Disadvantages could include issues of easy deletion, security, and theft.]

HS-PS4-2

Interference and Superposition of Waves

When two waves of the same nature occur in the same region simultaneously, they result in interference. Interference of waves implies that the net effect ...

Sound Waves: Interference

Sound waves can be modeled either as longitudinal waves, wherein the molecules of the medium oscillate around an equilibrium position, or as pressure ...

Interference: Path Lengths

Consider two sources of sound, that may or may not be in phase, emitting waves at a single frequency, and consider the frequencies to be the same.
Two ...

/files/media/science-education/science-education-thumbs/14727.jpg

concept-of-resonance-and-its-characteristics

Concept of Resonance and its Characteristics

If a driven oscillator needs to resonate at a specific frequency, then very light damping is required. An example of light damping includes playing piano ...

/files/media/science-education/science-education-thumbs/12772.jpg

Evaluate the claims, evidence, and reasoning behind the idea that electromagnetic radiation can be described either by a wave model or a particle model, and that for some situations one model is more useful than the other. [Clarification Statement: Emphasis is on how the experimental evidence supports the claim and how a theory is generally modified in light of new evidence. Examples of a phenomenon could include resonance, interference, diffraction, and photoelectric effect.] [Assessment Boundary: Assessment does not include using quantum theory.]

HS-PS4-3

Measuring Protein Concentration with Absorbance

Description

Transcript

Tags

More videos by Standards