La chromatographie en phase liquide à haute performance (CLHP)
1. rendre la Phase Mobile
- Préparer la phase mobile en ajoutant 400 mL d’acétonitrile à environ 1,5 L d’eau purifiée de DI.
- Ajouter avec précaution 2,4 mL d’acide acétique glacial à cette solution.
- Diluer la solution d’un volume total de 2.0 L dans une fiole jaugée avec de l’eau purifiée DI. La solution obtenue doit avoir un pH entre 2,8 à 3,2.
- Ajuster le pH à 4,2 en ajoutant 40 % d’hydroxyde de sodium, titration à l’aide d’un pH-mètre numérique calibré. Ajouter très lentement lorsque le pH atteint 4.0. Cela devrait prendre environ 50 gouttes d’accomplir.
- Filtrer la phase mobile à travers un filtre de membrane de Nylon 66 0,47 µm sous vide pour dégazer la solution et pour éliminer les solides qui pouvaient brancher la colonne chromatographique. Il est important de dégazer la phase mobile pour éviter d’avoir une bulle, ce qui pourrait provoquer un vide dans la phase stationnaire à l’entrée de la colonne ou faire son chemin dans la cellule du détecteur, causant l’instabilité avec l’absorbance UV.
2. créer les Solutions composant
Les trois composantes qui doivent être apportées sont la caféine (0,8 mg/mL), benzoate de potassium (1,4 mg/mL) et l’aspartame (ester méthylique de L-aspartyl-L-phénylalanine) (6,0 mg/mL). Ces concentrations, une fois diluées de la même façon, mettent les normes aux niveaux trouvés dans les échantillons de soude.
- Ajouter 0,40 g de caféine dans une fiole jaugée de 500 mL, puis diluer à la marque 500 mL avec de l’eau distillée.
- Ajoutez 0,70 g de benzoate dans une fiole jaugée de 500 mL, puis diluer à la marque 500 mL avec de l’eau distillée.
- Ajouter 0,60 g d’aspartame dans une fiole jaugée de 100 mL, puis diluer à la marque de 100 mL avec l’eau distillée. Place cette solution dans un réfrigérateur pour éviter la décomposition pendant l’entreposage.
3. rendre les Solutions Standard 7
Tous les trois composantes ont des coefficients de distribution différents, qui influe sur la manière dont chacun interagit avec tous les deux des phases. Plus le coefficient de distribution, le temps plus que le composant passe dans la phase stationnaire, ce qui entraîne une rétention plus longue fois pour atteindre le détecteur.
- Suivant le tableau dans le tableau 1, pipette une quantité suffisante de chaque composant dans une fiole jaugée de 50 mL.
- Diluer chaque solution stock à la marque 50 mL sur les fioles jaugées avec la phase mobile.
- Versez chaque solution étalon dans étiquetées petites fioles dans un rack d’échantillon.
- Rangez les grilles des échantillons dans un réfrigérateur, ainsi que les autres solutions dans les fioles jaugées de 50 mL.
4. vérifier les paramètres initiaux du système HPLC
- Confirmer que la conduite d’écoulement est dans un conteneur à déchets et n’est pas recyclage dans la phase mobile.
- Vérifiez que le débit de la phase mobile est défini sur 0,5 mL/min. C’est suffisamment élevé pour permettre tous les pics à éluer à moins de 5 min et ralentir suffisamment pour permettre une résolution agréable.
- Vérifier que la pression minimale et maximale et la vitesse d’écoulement sont définies pour les valeurs correctes sur le panneau avant du système solvant (la pompe).
- Réglage de la pression minimale : 250 lb/po2 (c’est à l’arrêt de la pompe, si une fuite se produit).
- Réglage de la pression maximale : 4 000 lb/po2 (c’est pour protéger la pompe contre la rupture, si une forme de sabot).
- Appuyez sur « zéro » sur la façade du détecteur afin de mettre à l’essai à blanc (le blanc est la phase mobile pure).
- Rincez une seringue de 100 µL d’eau déionisée, puis avec plusieurs volumes d’un étalons de travail pour être analysés et remplissez la seringue avec cette solution. Commencez avec les 3 échantillons mono-composant, qui permet d’identifier le pic de chaque composant d’intérêt.
5. manuellement par injection de l’échantillon et la collecte de données
- Avec le stylo injecteur dans la position de chargement, injecter lentement 100 µL de solution via le port de la cloison.
- Vérifiez que le programme de collecte de données est défini pour recueillir des données pour 300 s, ce qui permet de suffisamment de temps pour tous les 3 pics à éluer à travers le détecteur.
- Lorsque vous êtes prêt à commencer le procès, tourner la manivelle d’injecteur au poste inject (qui injecte l’échantillon dans la phase mobile) et cliquez sur « Commencer le procès » sur le programme de collecte de données ordinateur immédiatement. Pour les normes 1-3, seul les trois pics séquentielles apparaissent sur l’écran pendant la course (Figure 1).
- Une fois 300 s ont passé, la collecte de données envoie une invite à enregistrer le fichier de données. Enregistrer les données sous un nom de fichier approprié (par exemple, STD #1).
- Remarque la durée en secondes pour le sommet de chaque essai, qui est utilisé pour identifier ce composant.
- Retirer la seringue de la cloison et répétez le processus pour toutes les normes de travail restant, en utilisant le même temps par le chromatogramme comme déterminé à partir de la première manche.
Figure 1. Le chromatogramme des 3 composants. De gauche à droite, ils sont la caféine, l’aspartame et le benzoate.
6. les échantillons de boissons gazeuses diète
Diet Coke et Pepsi diète Coke Zero sont les « inconnues ». Ils ont été laissés dans des conteneurs ouverts toute la nuit pour se débarrasser de la carbonatation, comme les bulles ne sont pas bonnes pour le système de CLHP. Suffisamment, il se débarrasse de tout le gaz dans les échantillons.
- Attirer environ 2 mL de soda de la diète dans une seringue en plastique.
- Fixez l’extrémité du filtre à la seringue par l’intermédiaire de Luer-Lok en le tournant en place.
- Pousser le liquide dans la seringue à travers le filtre et dans un flacon de verre. Il se débarrasse des particules indésirables qui pourraient potentiellement bloquer la colonne de séparation.
- Diluer chaque échantillon avec une quantité égale de l’eau distillée, afin qu’ils soient à 50 % de pureté.
- Injecter 100 µL de l’échantillon dans la boucle d’échantillonnage et exécuter des essais avec les mêmes paramètres que pour les standards.
7. les calculs
- D’après les concentrations des solutions composant, calculer la concentration de tous les composants dans les normes, basés sur les dilutions qui ont été faites pour les 7 échantillons.
- Déterminer des pics sur les chromatogrammes pour chaque étalon et les échantillons inconnus par la méthode triangulaire, ce qui équivaut à périodes de hauteur, la largeur à ½ hauteur (Figure 2). Après avoir déterminé quel pic correspond à chaque composant basé sur le temps que nécessaire pour chaque composant montrer leur apogée respectif, entrer dans ces domaines de pointe dans un tableur informatique.
- Créer des courbes d’étalonnage de la surface du pic vs concentration (mg/L) dans les normes pour chacune des trois composantes.
- Définir les méthode des moindres carrés pour chaque courbe d’étalonnage.
- Calculer la concentration de chaque composante dans les boissons gazeuses diète de la montré dans les essais de la CLHP pour les échantillons de surface des pics. N’oubliez pas que le soda diète a été dilué par un facteur de 2 avant l’injection dans le système de CLHP.
- Calculer la quantité, en mg/L, de chaque composante dans les boissons gazeuses diète.
- Selon les résultats, calculer la milligrammes de chaque composant dans une canette de 12 onces de soude. Supposons que 12 oz = 354,9 mL.
La figure 2. Un exemple de base d’une courbe hauteur et largeur, qui doivent être multipliés (hauteur du pic fois largeur à ½ de la hauteur).
Source : Dr Paul Bower - Purdue University
Chromatographie en phase liquide à haute performance (HPLC) est une méthode d’analyse importante couramment…
1. rendre la Phase Mobile
- Préparer la phase mobile en ajoutant 400 mL d’acétonitrile à environ 1,5 L d’eau purifiée de DI.
- Ajouter avec précaution 2,4 mL d’acide acétique glacial à cette solution.
- Diluer la solution d’un volume total de 2.0 L dans une fiole jaugée avec de l’eau purifiée DI. La solution obtenue doit avoir un pH entre 2,8 à 3,2.
- Ajuster le pH à 4,2 en ajoutant 40 % d’hydroxyde de sodium, titration à l’aide d’un pH-mètre numérique calibré. Ajouter très lentement lorsque le pH atteint 4.0. Cela devrait prendre environ 50 gouttes d’accomplir.
- Filtrer la phase mobile à travers un filtre de membrane de Nylon 66 0,47 µm sous vide pour dégazer la solution et pour éliminer les solides qui pouvaient brancher la colonne chromatographique. Il est important de dégazer la phase mobile pour éviter d’avoir une bulle, ce qui pourrait provoquer un vide dans la phase stationnaire à l’entrée de la colonne ou faire son chemin dans la cellule du détecteur, causant l’instabilité avec l’absorbance UV.
2. créer les Solutions composant
Les trois composantes qui doivent être apportées sont la caféine (0,8 mg/mL), benzoate de potassium (1,4 mg/mL) et l’aspartame (ester méthylique de L-aspartyl-L-phénylalanine) (6,0 mg/mL). Ces concentrations, une fois diluées de la même façon, mettent les normes aux niveaux trouvés dans les échantillons de soude.
- Ajouter 0,40 g de caféine dans une fiole jaugée de 500 mL, puis diluer à la marque 500 mL avec de l’eau distillée.
- Ajoutez 0,70 g de benzoate dans une fiole jaugée de 500 mL, puis diluer à la marque 500 mL avec de l’eau distillée.
- Ajouter 0,60 g d’aspartame dans une fiole jaugée de 100 mL, puis diluer à la marque de 100 mL avec l’eau distillée. Place cette solution dans un réfrigérateur pour éviter la décomposition pendant l’entreposage.
3. rendre les Solutions Standard 7
Tous les trois composantes ont des coefficients de distribution différents, qui influe sur la manière dont chacun interagit avec tous les deux des phases. Plus le coefficient de distribution, le temps plus que le composant passe dans la phase stationnaire, ce qui entraîne une rétention plus longue fois pour atteindre le détecteur.
- Suivant le tableau dans le tableau 1, pipette une quantité suffisante de chaque composant dans une fiole jaugée de 50 mL.
- Diluer chaque solution stock à la marque 50 mL sur les fioles jaugées avec la phase mobile.
- Versez chaque solution étalon dans étiquetées petites fioles dans un rack d’échantillon.
- Rangez les grilles des échantillons dans un réfrigérateur, ainsi que les autres solutions dans les fioles jaugées de 50 mL.
4. vérifier les paramètres initiaux du système HPLC
- Confirmer que la conduite d’écoulement est dans un conteneur à déchets et n’est pas recyclage dans la phase mobile.
- Vérifiez que le débit de la phase mobile est défini sur 0,5 mL/min. C’est suffisamment élevé pour permettre tous les pics à éluer à moins de 5 min et ralentir suffisamment pour permettre une résolution agréable.
- Vérifier que la pression minimale et maximale et la vitesse d’écoulement sont définies pour les valeurs correctes sur le panneau avant du système solvant (la pompe).
- Réglage de la pression minimale : 250 lb/po2 (c’est à l’arrêt de la pompe, si une fuite se produit).
- Réglage de la pression maximale : 4 000 lb/po2 (c’est pour protéger la pompe contre la rupture, si une forme de sabot).
- Appuyez sur « zéro » sur la façade du détecteur afin de mettre à l’essai à blanc (le blanc est la phase mobile pure).
- Rincez une seringue de 100 µL d’eau déionisée, puis avec plusieurs volumes d’un étalons de travail pour être analysés et remplissez la seringue avec cette solution. Commencez avec les 3 échantillons mono-composant, qui permet d’identifier le pic de chaque composant d’intérêt.
5. manuellement par injection de l’échantillon et la collecte de données
- Avec le stylo injecteur dans la position de chargement, injecter lentement 100 µL de solution via le port de la cloison.
- Vérifiez que le programme de collecte de données est défini pour recueillir des données pour 300 s, ce qui permet de suffisamment de temps pour tous les 3 pics à éluer à travers le détecteur.
- Lorsque vous êtes prêt à commencer le procès, tourner la manivelle d’injecteur au poste inject (qui injecte l’échantillon dans la phase mobile) et cliquez sur « Commencer le procès » sur le programme de collecte de données ordinateur immédiatement. Pour les normes 1-3, seul les trois pics séquentielles apparaissent sur l’écran pendant la course (Figure 1).
- Une fois 300 s ont passé, la collecte de données envoie une invite à enregistrer le fichier de données. Enregistrer les données sous un nom de fichier approprié (par exemple, STD #1).
- Remarque la durée en secondes pour le sommet de chaque essai, qui est utilisé pour identifier ce composant.
- Retirer la seringue de la cloison et répétez le processus pour toutes les normes de travail restant, en utilisant le même temps par le chromatogramme comme déterminé à partir de la première manche.
Figure 1. Le chromatogramme des 3 composants. De gauche à droite, ils sont la caféine, l’aspartame et le benzoate.
6. les échantillons de boissons gazeuses diète
Diet Coke et Pepsi diète Coke Zero sont les « inconnues ». Ils ont été laissés dans des conteneurs ouverts toute la nuit pour se débarrasser de la carbonatation, comme les bulles ne sont pas bonnes pour le système de CLHP. Suffisamment, il se débarrasse de tout le gaz dans les échantillons.
- Attirer environ 2 mL de soda de la diète dans une seringue en plastique.
- Fixez l’extrémité du filtre à la seringue par l’intermédiaire de Luer-Lok en le tournant en place.
- Pousser le liquide dans la seringue à travers le filtre et dans un flacon de verre. Il se débarrasse des particules indésirables qui pourraient potentiellement bloquer la colonne de séparation.
- Diluer chaque échantillon avec une quantité égale de l’eau distillée, afin qu’ils soient à 50 % de pureté.
- Injecter 100 µL de l’échantillon dans la boucle d’échantillonnage et exécuter des essais avec les mêmes paramètres que pour les standards.
7. les calculs
- D’après les concentrations des solutions composant, calculer la concentration de tous les composants dans les normes, basés sur les dilutions qui ont été faites pour les 7 échantillons.
- Déterminer des pics sur les chromatogrammes pour chaque étalon et les échantillons inconnus par la méthode triangulaire, ce qui équivaut à périodes de hauteur, la largeur à ½ hauteur (Figure 2). Après avoir déterminé quel pic correspond à chaque composant basé sur le temps que nécessaire pour chaque composant montrer leur apogée respectif, entrer dans ces domaines de pointe dans un tableur informatique.
- Créer des courbes d’étalonnage de la surface du pic vs concentration (mg/L) dans les normes pour chacune des trois composantes.
- Définir les méthode des moindres carrés pour chaque courbe d’étalonnage.
- Calculer la concentration de chaque composante dans les boissons gazeuses diète de la montré dans les essais de la CLHP pour les échantillons de surface des pics. N’oubliez pas que le soda diète a été dilué par un facteur de 2 avant l’injection dans le système de CLHP.
- Calculer la quantité, en mg/L, de chaque composante dans les boissons gazeuses diète.
- Selon les résultats, calculer la milligrammes de chaque composant dans une canette de 12 onces de soude. Supposons que 12 oz = 354,9 mL.
La figure 2. Un exemple de base d’une courbe hauteur et largeur, qui doivent être multipliés (hauteur du pic fois largeur à ½ de la hauteur).
La chromatographie liquide à haute performance, ou HPLC, est une technique très polyvalente qui sépare les composants d’un mélange liquide en fonction de leurs différentes interactions avec une phase stationnaire.
L’HPLC est une adaptation de la chromatographie sur colonne. Dans la chromatographie sur colonne, une colonne est remplie de microbilles appelées phase stationnaire. Les billes de phase stationnaire sont fonctionnalisées avec des groupes chimiques qui induisent une interaction entre la bille et les composants d’un mélange situé dans la phase liquide, ou mobile. Au fur et à mesure que le mélange s’écoule à travers la colonne, les composants interagissent différemment avec la phase stationnaire.
En HPLC, la chromatographie sur colonne est réalisée à un débit plus élevé, et donc à une pression plus élevée, que la chromatographie sur colonne classique. Cela permet d’utiliser des billes de phase stationnaire plus petites avec un rapport surface/volume plus élevé, ce qui augmente considérablement l’interaction de la phase stationnaire et des composants dans la phase mobile.
Cette vidéo présentera les bases du fonctionnement de la HPLC en démontrant la séparation des composants de divers sodas light.
Il existe deux types de HPLC utilisés en laboratoire : analytique et préparative. Dans la HPLC analytique, l’instrument est utilisé pour identifier les composants d’un petit volume, et l’échantillon analysé est ensuite jeté comme déchet. Dans la HPLC préparative, l’instrument est utilisé pour purifier un mélange et une quantité souhaitée de chaque composant est collectée en fractions.
L’instrumentation HPLC se compose d’une série de composants simples. Tout d’abord, la phase mobile, maintenue dans des réservoirs de solvants, est pompée à travers le système par une ou plusieurs pompes à un débit constant. L’échantillon est injecté dans le flux de phase mobile par l’injecteur d’échantillons. L’échantillon, dilué par la phase mobile, est ensuite livré à la colonne HPLC, où les composants de l’échantillon sont séparés. Les composants sont ensuite analysés par le détecteur, puis conservés en fractions pour une utilisation ultérieure, ou transférés dans une bouteille de déchets.
La colonne HPLC est le composant clé du système. Il est composé d’un cylindre en métal ou en plastique, rempli de microbilles de phase stationnaire, ou de résine de chromatographie. Le mélange d’échantillons s’écoule à travers le lit de particules garnies à un débit constant et chaque composant interagit avec la phase stationnaire au fur et à mesure qu’il s’écoule.
Les composés interagissent différemment avec la phase stationnaire et se déplacent donc sur toute la longueur de la colonne jusqu’au détecteur à une vitesse différente. Le temps nécessaire à un composant pour sortir de la colonne, ou éluer, est appelé temps de rétention. Le résultat est un graphique du temps de rétention en fonction de l’intensité, ou un chromatogramme. Le temps de rétention est utilisé pour identifier le composant. La taille du pic, en particulier la zone sous le pic, est utilisée pour quantifier la quantité de composé dans la solution initiale.
Le choix de la phase stationnaire dépend des propriétés des composants du mélange d’échantillons. La phase stationnaire la plus couramment utilisée est celle des billes de silice, car il s’agit d’un matériau non polaire inerte qui forme des billes à l’échelle microscopique et atteint une densité de tassement suffisante. Le type le plus courant de HPLC est la chromatographie en phase inverse, qui utilise une phase stationnaire hydrophobe, généralement des billes de silice avec des chaînes C18 collées à la surface des billes. Les composants sont élués par ordre de polarité décroissante.
La phase mobile utilisée dans la chromatographie en phase inverse est généralement un mélange d’eau et d’un solvant organique, tel que l’acétonitrile. Selon l’échantillon, la phase mobile peut rester un rapport constant d’eau et de solvant organique, connu sous le nom de mode isocratique. Cependant, cela peut conduire à de larges pics, dans le cas d’une teneur élevée en eau, ou à des pics superposés, dans le cas d’une teneur élevée en matières organiques.
Le rapport de phase mobile peut également être modifié linéairement ou par étapes pendant la séparation, pour créer un gradient de phase mobile. Une élution en gradient peut empêcher l’élargissement des pics des composants les moins polaires, améliorant ainsi la séparation et raccourcissant le temps d’élution.
Maintenant que les bases de la HPLC ont été esquissées, la technique HPLC sera démontrée en laboratoire. Dans cette expérience, la HPLC sera utilisée pour séparer et quantifier trois composants courants du soda light.
Tout d’abord, pour préparer la phase mobile, ajoutez 400 mL d’acétonitrile à 1,5 L d’eau désionisée purifiée. Ajoutez ensuite soigneusement 2,4 ml d’acide acétique glacial. Diluer la solution à un volume total de 2 L. La solution résultante doit avoir un pH compris entre 2,8 et 3,2.
Ajustez le pH à 4,2 en ajoutant 40 % de NaOH, goutte à goutte à la solution d’agitation, à l’aide d’un pH-mètre calibré.
Filtrer la phase mobile à travers un filtre à membrane de 0,47 à μm sous vide pour dégazer la solution et éliminer les solides qui pourraient obstruer la colonne. Il est important de dégazer la solution, car les bulles peuvent provoquer des vides dans la phase stationnaire, ou se frayer un chemin jusqu’à la cellule du détecteur et provoquer une instabilité dans les mesures.
Préparez des solutions à trois composants de la caféine, du benzoate et de l’aspartame, qui sont trois composants typiques des sodas light. Ces solutions de composants sont ensuite utilisées pour préparer les solutions standard qui seront utilisées pour déterminer les inconnues. Préparez 500 ml de solutions de caféine et de benzoate.
Préparez 100 ml de la solution d’aspartame. Conservez la solution au réfrigérateur lorsqu’elle n’est pas utilisée pour éviter la décomposition.
Ensuite, préparez 7 solutions étalons, chacune avec des concentrations différentes de caféine, de benzoate et d’aspartame. Pipeter la quantité appropriée de chaque composant dans une fiole jaugée et diluer jusqu’à 50 mL avec la phase mobile.
Les 3 premières solutions contiennent chacune un composant, pour permettre l’identification des pics. Les 4 autres solutions contiennent une gamme de concentrations des 3 composants, afin de corréler la hauteur du pic à la concentration.
Versez chaque solution étalon dans un flacon étiqueté dans un support d’échantillons. Conservez le support d’échantillons avec les échantillons et les solutions restantes au réfrigérateur.
Tout d’abord, mettez en place la phase mobile et les conteneurs à déchets. Assurez-vous que les conduites de déchets sont introduites dans un conteneur à déchets et qu’elles ne sont pas recyclées dans la phase mobile. Assurez-vous que la conduite de phase mobile d’entrée est introduite dans le conteneur de phase mobile.
Vérifiez que le débit de la phase mobile est réglé à 0,5 mL/min. Ce débit permettra à tous les composants d’éluer en 5 minutes, mais il est suffisamment lent pour assurer la résolution des pics individuels.
Ensuite, vérifiez les pressions minimale et maximale sur le système d’administration du solvant. Ces paramètres arrêtent la pompe en cas de fuite ou d’obstruction, respectivement.
Appuyez sur « zéro » sur le panneau avant du détecteur, pour régler le blanc. Rincer un 100- ? Seringue en L avec de l’eau déminéralisée, puis avec plusieurs volumes de 1 des 7 étalons de travail. Remplissez ensuite la seringue avec cette solution. Commencez par les 3 échantillons monocomposants afin d’identifier le pic de chaque composant.
Ensuite, injectez manuellement la solution, en plaçant la poignée de l’injecteur en position de charge. Injectez lentement le 100 ? L de solution par l’orifice du septum.
Vérifiez que le programme de collecte de données est configuré pour collecter des données pendant 300 s, ce qui laisse suffisamment de temps pour que les 3 pics s’échappent à travers le détecteur. Lorsque vous êtes prêt à commencer l’essai, tournez la poignée de l’injecteur en position d’injection, afin d’injecter l’échantillon dans la phase mobile. Cliquez immédiatement sur « Démarrer l’essai » sur le programme de collecte de données. Une fois l’analyse terminée, répétez le processus pour chacune des 7 solutions standard. Pour chacun des 3 premiers standards, un seul des 3 pics apparaît. Notez l’emplacement du pic, qui est utilisé pour identifier le composant.
Sélectionnez 3 échantillons de soda light et laissez-les reposer dans des récipients ouverts pendant la nuit pour éliminer la carbonatation.
Après un dégazage pendant la nuit, aspirez environ 3 ml de chaque soda light dans une seringue en plastique. Ensuite, fixez un embout de filtre à la seringue et poussez le soda à travers le filtre dans un flacon en verre, afin d’éliminer toutes les particules solides.
Diluez 2 ml de chaque échantillon avec 2 ml de phase mobile pour diminuer de moitié la concentration de soude.
Match nul 100 ? L de l’un des échantillons de soude dans une seringue et injectez-le dans la boucle d’échantillon. Exécutez l’essai avec des paramètres identiques à ceux des solutions standard. Répétez l’opération pour chaque échantillon de soda.
Tout d’abord, corrélez les zones de pic des échantillons étalons aux concentrations connues. Pour ce faire, déterminez les zones de pics sur les chromatographes pour chaque échantillon standard à l’aide de la méthode triangulaire. Calculez les temps de hauteur de crête avec la largeur à la moitié de la hauteur et utilisez cette valeur comme surface de pointe.
À l’aide de l’aire du pic et des concentrations connues, créez une courbe d’étalonnage pour chaque composant et déterminez l’ajustement des moindres carrés pour chaque courbe d’étalonnage.
Calculez la concentration de chaque composant dans les sodas light à partir des zones de pointe. Rappelez-vous que les sodas ont tous été dilués par un facteur 2 avant d’être injectés dans la HPLC. Sur la base de ces résultats, calculez le mg de chaque composant dans une canette de soda de 12 oz.
Sans surprise, les 3 sodas testés contenaient à peu près la même quantité de benzoate, un conservateur. Cependant, les produits Coca-Cola contenaient plus de caféine. Les valeurs calculées pour tous les composants étaient bien corrélées avec les valeurs rapportées par les fabricants.
La HPLC est un instrument très polyvalent, qui est utilisé dans un large éventail d’analyses.
La HPLC est souvent utilisée pour purifier les molécules peptidiques. Dans cet exemple, des complexes peptidiques transmembranaires ont été préparés, puis stabilisés par réticulation oxydative des protéines avec des liaisons disulfure.
Les protéines ont ensuite été dissoutes dans de l’acide formique et purifiées à l’aide d’une HPLC en phase inversée. L’échantillon a ensuite été élué à l’aide d’un gradient linéaire de deux solvants, et la pureté a été confirmée par spectrométrie de masse.
L’HPLC peut également être utilisée pour identifier les composés organiques synthétisés en laboratoire. Dans l’expérience Miller-Urey, la synthèse abiotique de composés organiques sur la terre primordiale a été étudiée. Des gaz primordiaux, tels que le méthane et l’ammoniac, ont été introduits dans un flacon contenant de l’eau, simulant les premiers océans. Une décharge électrique a ensuite été appliquée, imitant la foudre sur la terre primordiale.
L’eau a ensuite été analysée à l’aide d’une HPLC couplée à une spectrométrie de masse, et comparée à des étalons d’acides aminés connus. 23 acides aminés ont été synthétisés et identifiés dans cette expérience.
Vous venez de regarder l’introduction de JoVE à la HPLC. Vous devez maintenant comprendre les bases de l’utilisation de l’instrument et de l’analyse des données résultantes.
Merci d’avoir regardé !
Q1: How does HPLC separate components in a liquid mixture?
HPLC separates components based on their different interactions with a stationary phase. A liquid mobile phase is pumped through a column packed with small beads of stationary phase. Components interact differently with these beads and travel through the column at different rates, causing separation. The time each component takes to exit the column, called retention time, identifies the component.
Q2: What is the difference between analytical and preparative HPLC?
Analytical HPLC identifies components in a small sample volume, which is then discarded as waste. Preparative HPLC purifies a mixture and collects a desired amount of each component in fractions for later use. Both use the same separation principle but differ in their purpose and sample handling after analysis.
Q3: Why is degassing the mobile phase important in HPLC?
Degassing removes dissolved gases from the mobile phase before it enters the column. Bubbles in the mobile phase can create voids in the stationary phase or travel to the detector cell, causing measurement instability. Filtering the mobile phase through a membrane filter under vacuum effectively removes gases and solid particulates that could clog the column.
Q4: What does the chromatogram tell you about separated components?
A chromatogram plots retention time versus signal intensity. The retention time identifies each component, while the peak area quantifies the amount of compound in the original solution. By correlating peak areas to known concentrations using calibration curves principles and applications, you can determine unknown sample concentrations.
Q5: What is reversed-phase chromatography and when is it used?
Reversed-phase chromatography uses a hydrophobic stationary phase, typically silica beads with C18 chains bonded to the surface, paired with a polar mobile phase of water and organic solvent like acetonitrile. Components elute in order of decreasing polarity. This is the most common HPLC mode and works well for water-soluble samples.
Q6: How does gradient elution improve HPLC separation?
Gradient elution changes the mobile phase ratio linearly or stepwise during separation, increasing the organic solvent concentration over time. This prevents peak broadening of less polar components that occurs with constant isocratic conditions, thereby improving separation quality and shortening elution time for complex mixtures.
Q7: Why are smaller stationary phase beads used in HPLC compared to column chromatography?
HPLC operates at higher flow rates and pressures than classical column chromatography, enabling the use of smaller stationary phase beads. These micro-scale beads have a greater surface area to volume ratio, which greatly increases interaction between the stationary phase and sample components, improving separation efficiency and resolution.