Overview
Source : Dr Paul Bower - Purdue University
Chromatographie en phase liquide à haute performance (HPLC) est une méthode d’analyse importante couramment utilisée pour séparer et quantifier les composants d’échantillons liquides. Dans cette technique, une solution (première phase) est pompée à travers une colonne contenant un emballage de petites particules poreuses avec une deuxième phase liée à la surface. Les solubilités différentes les composants de l’échantillon dans les deux phases causent les composants pour vous déplacer dans la colonne avec des vitesses moyennes différentes, créant ainsi une séparation de ces composants. La solution de pompage est appelée la phase mobile, tandis que la phase de la colonne est appelée la phase stationnaire.
Il existe plusieurs modes de chromatographie en phase liquide, selon le type de phase stationnaire ou mobile utilisée. Cette expérience utilise la chromatographie en phase inversée, où la phase stationnaire est non polaire et la phase mobile est polaire. La phase stationnaire devant être utilisés est C18 liés à des particules de silice de 3 µm, tandis que la phase mobile est un tampon aqueux avec un modificateur organique polaire (acétonitrile) ajouté à varier sa force d’élution des groupes hydrocarbonés. Sous cette forme, la silice peut être utilisée pour les échantillons qui sont solubles dans l’eau, fournissant un vaste éventail d’applications. Dans cette expérience, les mélanges de trois éléments fréquemment trouvés dans le régime alimentaire des boissons non alcoolisées (caféine, benzoate et l’aspartame) sont séparés. Sept solutions préparées contenant des quantités connues de ces trois espèces sont utilisées et leur chromatogramme est ensuite enregistrés.
Principles
Pendant une expérience HPLC, une pompe à haute pression prend la phase mobile provenant d’un réservoir à travers un injecteur. Il traverse ensuite une colonne en phase inverse C18-emballés pour la séparation des composants. Enfin, la phase mobile se déplace dans une cellule du détecteur, où l’absorbance est mesurée à 220 nm et se termine dans une bouteille pour eaux usées. La quantité de temps qu’il faut pour un composant de voyager depuis le port de l’injecteur au niveau du détecteur est appelée temps de rétention.
Un chromatographe en phase liquide est utilisé dans cette expérience, où la séparation est effectuée sur une colonne en phase inverse. Les dimensions de la colonne sont de 3 mm (d.i.) x 100 mm et la silice d’emballage (granulométrie de 3 µm) est fonctionnalisée avec C18 octadécylsilane (ODS). Une valve de 6 ports rotatif injection Rheodyne sert à stocker au départ l’échantillon dans une petite boucle et introduit l’échantillon à la phase mobile à la rotation de la soupape.
La détection est par spectroscopie d’absorption à une longueur d’onde de 220 nm. Cette expérience peut être exécutée à 254 nm, si un détecteur n’est pas variable. Les données du détecteur dispose d’une sortie analogique de tension, qui est mesurée à l’aide d’un multimètre numérique (DMM), et lu par un ordinateur doté d’un programme d’acquisition de données. Le chromatogramme obtenu a une crête pour chaque composant dans l’échantillon. Pour cette expérience, les trois composantes éluer à 5 min.
Cette expérience utilise une seule phase mobile et la pompe, qu’on appelle une phase mobile isocratique. Pour les échantillons qui sont difficiles à séparer, une phase mobile dégradée peut être utilisée. C’est lors de la phase initiale du mobile est principalement un aqueux, et au fil du temps, une phase mobile deuxième organique est progressivement ajoutée à la phase mobile dans l’ensemble. Cette méthode déclenche la polarité de cette phase au fil du temps, ce qui diminue les temps de rétention des éléments et fonctionne de manière similaire à un gradient de température sur un chromatographe en phase gazeuse. Il y a certains cas où la colonne est chauffée (habituellement à 40 ° C), qui enlève toute rétention d’erreurs associé à un changement de la température ambiante.
En HPLC en phase inversée, la phase stationnaire de colonne d’emballage est généralement un C4, C8 ou C18 d’emballage. Les colonnes de C4 sont principalement des protéines de grands poids moléculaire, tandis que les colonnes C18 sont des peptides et des échantillons élémentaires de bas poids moléculaire.
Détection par spectroscopie d’absorption est très majoritairement la méthode de détection de choix, comme les spectres d’absorption des composants sont tous facilement accessibles. Certains systèmes utilisent des mesures électrochimiques, telles que la conductivité ou ampérométrie, tant que leur méthode de détection.
Pour cette expérience, la phase mobile est principalement de 20 % d’acétonitrile et 80 % purifié l’eau désionisée (DI). Une petite quantité d’acide acétique est ajoutée pour baisser le pH de la phase mobile, ce qui maintient le silanol dans la phase stationnaire d’emballage dans un État non dissocié. Cela réduit le pic de l’adsorption de résidus, donnant des pics plus étroits. Ensuite, le pH est ajusté avec 40 % d’hydroxyde de sodium pour augmenter le pH et aider à diminuer les temps de rétention des éléments.
Chaque groupe utilise un jeu des 7 flacons contenant différentes concentrations des solutions étalons (tableau 1). Les 3 premiers sont utilisés pour identifier chaque pic, et les 4 derniers sont pour la création d’un graphique d’étalonnage pour chaque composant. Normes 1-3 sont également utilisés pour le tableau de calibrage.
| Nombre | Caféine (mL) | Benzoate de (mL) | Aspartame (mL) |
| 1 | 4 | 0 | 0 |
| 2 | 0 | 4 | 0 |
| 3 | 0 | 0 | 4 |
| 4 | 1 | 1 | 1 |
| 5 | 2 | 2 | 2 |
| 6 | 3 | 3 | 3 |
| 7 | 5 | 5 | 5 |
Le tableau 1. Volumes des étalons utilisés pour préparer les 7 étalons de travail fourni (volume total de chaque norme est de 50 mL).
Procedure
1. rendre la Phase Mobile
- Préparer la phase mobile en ajoutant 400 mL d’acétonitrile à environ 1,5 L d’eau purifiée de DI.
- Ajouter avec précaution 2,4 mL d’acide acétique glacial à cette solution.
- Diluer la solution d’un volume total de 2.0 L dans une fiole jaugée avec de l’eau purifiée DI. La solution obtenue doit avoir un pH entre 2,8 à 3,2.
- Ajuster le pH à 4,2 en ajoutant 40 % d’hydroxyde de sodium, titration à l’aide d’un pH-mètre numérique calibré. Ajouter très lentement lorsque le pH atteint 4.0. Cela devrait prendre environ 50 gouttes d’accomplir.
- Filtrer la phase mobile à travers un filtre de membrane de Nylon 66 0,47 µm sous vide pour dégazer la solution et pour éliminer les solides qui pouvaient brancher la colonne chromatographique. Il est important de dégazer la phase mobile pour éviter d’avoir une bulle, ce qui pourrait provoquer un vide dans la phase stationnaire à l’entrée de la colonne ou faire son chemin dans la cellule du détecteur, causant l’instabilité avec l’absorbance UV.
2. créer les Solutions composant
Les trois composantes qui doivent être apportées sont la caféine (0,8 mg/mL), benzoate de potassium (1,4 mg/mL) et l’aspartame (ester méthylique de L-aspartyl-L-phénylalanine) (6,0 mg/mL). Ces concentrations, une fois diluées de la même façon, mettent les normes aux niveaux trouvés dans les échantillons de soude.
- Ajouter 0,40 g de caféine dans une fiole jaugée de 500 mL, puis diluer à la marque 500 mL avec de l’eau distillée.
- Ajoutez 0,70 g de benzoate dans une fiole jaugée de 500 mL, puis diluer à la marque 500 mL avec de l’eau distillée.
- Ajouter 0,60 g d’aspartame dans une fiole jaugée de 100 mL, puis diluer à la marque de 100 mL avec l’eau distillée. Place cette solution dans un réfrigérateur pour éviter la décomposition pendant l’entreposage.
3. rendre les Solutions Standard 7
Tous les trois composantes ont des coefficients de distribution différents, qui influe sur la manière dont chacun interagit avec tous les deux des phases. Plus le coefficient de distribution, le temps plus que le composant passe dans la phase stationnaire, ce qui entraîne une rétention plus longue fois pour atteindre le détecteur.
- Suivant le tableau dans le tableau 1, pipette une quantité suffisante de chaque composant dans une fiole jaugée de 50 mL.
- Diluer chaque solution stock à la marque 50 mL sur les fioles jaugées avec la phase mobile.
- Versez chaque solution étalon dans étiquetées petites fioles dans un rack d’échantillon.
- Rangez les grilles des échantillons dans un réfrigérateur, ainsi que les autres solutions dans les fioles jaugées de 50 mL.
4. vérifier les paramètres initiaux du système HPLC
- Confirmer que la conduite d’écoulement est dans un conteneur à déchets et n’est pas recyclage dans la phase mobile.
- Vérifiez que le débit de la phase mobile est défini sur 0,5 mL/min. C’est suffisamment élevé pour permettre tous les pics à éluer à moins de 5 min et ralentir suffisamment pour permettre une résolution agréable.
- Vérifier que la pression minimale et maximale et la vitesse d’écoulement sont définies pour les valeurs correctes sur le panneau avant du système solvant (la pompe).
- Réglage de la pression minimale : 250 lb/po2 (c’est à l’arrêt de la pompe, si une fuite se produit).
- Réglage de la pression maximale : 4 000 lb/po2 (c’est pour protéger la pompe contre la rupture, si une forme de sabot).
- Appuyez sur « zéro » sur la façade du détecteur afin de mettre à l’essai à blanc (le blanc est la phase mobile pure).
- Rincez une seringue de 100 µL d’eau déionisée, puis avec plusieurs volumes d’un étalons de travail pour être analysés et remplissez la seringue avec cette solution. Commencez avec les 3 échantillons mono-composant, qui permet d’identifier le pic de chaque composant d’intérêt.
5. manuellement par injection de l’échantillon et la collecte de données
- Avec le stylo injecteur dans la position de chargement, injecter lentement 100 µL de solution via le port de la cloison.
- Vérifiez que le programme de collecte de données est défini pour recueillir des données pour 300 s, ce qui permet de suffisamment de temps pour tous les 3 pics à éluer à travers le détecteur.
- Lorsque vous êtes prêt à commencer le procès, tourner la manivelle d’injecteur au poste inject (qui injecte l’échantillon dans la phase mobile) et cliquez sur « Commencer le procès » sur le programme de collecte de données ordinateur immédiatement. Pour les normes 1-3, seul les trois pics séquentielles apparaissent sur l’écran pendant la course (Figure 1).
- Une fois 300 s ont passé, la collecte de données envoie une invite à enregistrer le fichier de données. Enregistrer les données sous un nom de fichier approprié (par exemple, STD #1).
- Remarque la durée en secondes pour le sommet de chaque essai, qui est utilisé pour identifier ce composant.
- Retirer la seringue de la cloison et répétez le processus pour toutes les normes de travail restant, en utilisant le même temps par le chromatogramme comme déterminé à partir de la première manche.
Figure 1. Le chromatogramme des 3 composants. De gauche à droite, ils sont la caféine, l’aspartame et le benzoate.
6. les échantillons de boissons gazeuses diète
Diet Coke et Pepsi diète Coke Zero sont les « inconnues ». Ils ont été laissés dans des conteneurs ouverts toute la nuit pour se débarrasser de la carbonatation, comme les bulles ne sont pas bonnes pour le système de CLHP. Suffisamment, il se débarrasse de tout le gaz dans les échantillons.
- Attirer environ 2 mL de soda de la diète dans une seringue en plastique.
- Fixez l’extrémité du filtre à la seringue par l’intermédiaire de Luer-Lok en le tournant en place.
- Pousser le liquide dans la seringue à travers le filtre et dans un flacon de verre. Il se débarrasse des particules indésirables qui pourraient potentiellement bloquer la colonne de séparation.
- Diluer chaque échantillon avec une quantité égale de l’eau distillée, afin qu’ils soient à 50 % de pureté.
- Injecter 100 µL de l’échantillon dans la boucle d’échantillonnage et exécuter des essais avec les mêmes paramètres que pour les standards.
7. les calculs
- D’après les concentrations des solutions composant, calculer la concentration de tous les composants dans les normes, basés sur les dilutions qui ont été faites pour les 7 échantillons.
- Déterminer des pics sur les chromatogrammes pour chaque étalon et les échantillons inconnus par la méthode triangulaire, ce qui équivaut à périodes de hauteur, la largeur à ½ hauteur (Figure 2). Après avoir déterminé quel pic correspond à chaque composant basé sur le temps que nécessaire pour chaque composant montrer leur apogée respectif, entrer dans ces domaines de pointe dans un tableur informatique.
- Créer des courbes d’étalonnage de la surface du pic vs concentration (mg/L) dans les normes pour chacune des trois composantes.
- Définir les méthode des moindres carrés pour chaque courbe d’étalonnage.
- Calculer la concentration de chaque composante dans les boissons gazeuses diète de la montré dans les essais de la CLHP pour les échantillons de surface des pics. N’oubliez pas que le soda diète a été dilué par un facteur de 2 avant l’injection dans le système de CLHP.
- Calculer la quantité, en mg/L, de chaque composante dans les boissons gazeuses diète.
- Selon les résultats, calculer la milligrammes de chaque composant dans une canette de 12 onces de soude. Supposons que 12 oz = 354,9 mL.
La figure 2. Un exemple de base d’une courbe hauteur et largeur, qui doivent être multipliés (hauteur du pic fois largeur à ½ de la hauteur).
Chromatographie liquide à haute performance, ou HPLC, est une technique très polyvalente qui sépare les composants d’un mélange liquid basés sur leurs différentes interactions avec une phase stationnaire.
HPLC est une adaptation de la chromatographie sur colonne. En chromatographie sur colonne, une colonne est remplie de perles de micro-échelle appelés la phase stationnaire. Les perles de la phase stationnaire sont fonctionnalisés avec des groupes chimiques qui induisent une interaction entre le talon et les composants d’un mélange situé dans la phase liquide, ou mobile. Que le mélange s’écoule à travers la colonne, les composants interagissent différemment avec la phase stationnaire.
En HPLC, chromatographie sur colonne est effectué à un débit plus élevé taux et donc plus élevée pression, que la chromatographie sur colonne classique. Cela permet d’utiliser de petites perles de phase stationnaire avec une plus grande surface au rapport de volume, ce qui augmente considérablement l’interaction de la phase stationnaire et les composants dans la phase mobile.
Cette vidéo mettra en place les bases du fonctionnement du HPLC en démontrant la séparation d’éléments de différentes de boissons gazeuses diète.
Il existe deux types de HPLC utilisé en laboratoire : analytique et préparative. En HPLC analytique, l’instrument est utilisé pour identifier les composants d’un petit volume, et l’échantillon analysé est ensuite jeté comme un déchet. HPLC préparative, l’instrument est utilisé pour purifier un mélange et une quantité désirée de chaque composant est recueillie dans les fractions.
L’instrumentation HPLC consiste en une série de composants simples. Tout d’abord, la phase mobile, qui s’est tenue dans les réservoirs de solvants, est pompée à travers le système par une ou plusieurs pompes à débit constant. L’échantillon est injecté dans le courant de phase mobile par l’injecteur de l’échantillon. L’échantillon dilué par la phase mobile, est ensuite transmis à la colonne HPLC, où les composants de l’échantillon sont séparés. Les composants sont ensuite analysées par le détecteur et soit sauvé dans les fractions pour une utilisation ultérieure, soit transféré dans une bouteille pour eaux usées.
La colonne HPLC est le composant clé du système. Il est composé d’un cylindre en métal ou en plastique, rempli de perles de micro-échelle de phase stationnaire, ou chromatographie sur résine. Le mélange de l’échantillon s’écoule à travers le lit de particules emballés à un débit constant et chaque composant interagit avec la phase stationnaire, telle qu’elle circule par.
Les composés interagissent avec la phase stationnaire différemment et par conséquent voyages sur toute la longueur de la colonne dans le détecteur à un rythme différent. Le temps requis pour un composant quitter la colonne ou éluer, s’appelle le temps de rétention. Le résultat est une parcelle de temps de rétention vs intensité ou un chromatogramme. Le temps de rétention est utilisé pour identifier le composant. La taille de pointe, en particulier la région sous le pic, est utilisée pour quantifier la quantité du composé dans la solution initiale.
Le choix de la phase stationnaire dépend des propriétés des composants dans le mélange de l’échantillon. La phase stationnaire plus couramment utilisée est perles de silice, car ils sont un matériau inerte et non polaire qui se forme à micro-échelle perles et permet d’obtenir une densité suffisante d’emballage. Le type le plus commun de HPLC est la chromatographie en phase inversée, qui utilise une phase stationnaire hydrophobe, généralement des perles de silice avec des chaînes de C18 collés sur surface des perles. Les composants sont éluées par ordre décroissant de polarité.
La phase mobile utilisée en chromatographie en phase inversée est généralement un mélange d’eau et d’un solvant organique, l’acétonitrile. Selon l’échantillon, la phase mobile peut rester un ratio constant de l’eau et de solvant organique, appelée mode isocratique. Toutefois, cela peut conduire à des pics larges, dans le cas de haute teneur, en eau ou des pics qui se chevauchent — dans le cas de la haute teneur en matières organiques.
Le rapport de la phase mobile peut également être modifié linéairement ou progressivement au cours de la séparation, pour créer un gradient de phase mobile. Une élution gradient peut empêcher pic élargissement des composants moins polaires, améliorant ainsi la séparation et raccourcir le temps d’élution.
Maintenant que les bases de l’HPLC ont été décrites, la technique HPLC sera démontrée en laboratoire. Dans cette expérience, HPLC servira à séparer et à quantifier les trois composants communs de gazeuses diètes.
Tout d’abord, pour préparer la phase mobile, ajouter 400 mL d’acétonitrile à 1,5 L d’eau déionisée purifiée. Puis ajouter avec précaution 2,4 mL d’acide acétique glacial. Diluer la solution d’un volume total de 2 L. La solution obtenue doit avoir un pH entre 2.8 et 3.2.
Ajuster le pH à 4,2 en ajoutant 40 % NaOH, goutte-à-goutte pour la solution en remuant, à l’aide d’un pH-mètre calibré.
Filtrer la phase mobile à travers un filtre à membrane 0,47 μm sous vide pour dégazer la solution et retirer les solides qui pouvaient brancher la colonne. Il est important de dégazer la solution, comme les bulles peuvent causer des vides dans la phase stationnaire, ou faire leur chemin à la cellule du détecteur et provoquer une instabilité dans les mesures.
Préparer trois solutions composant de caféine, benzoate et l’aspartame, qui comporte trois volets typiques des boissons gazeuses diète. Ces solutions de composant sont ensuite utilisées pour préparer les solutions qui seront utilisées pour déterminer les inconnues. Préparer 500 mL des caféine et du benzoate de solutions.
Préparation de 100 mL de la solution de composant de l’aspartame. Conserver la solution dans le réfrigérateur lorsque vous ne l’usage afin d’éviter la décomposition.
Ensuite, préparer 7 solutions étalons, chacun avec différentes concentrations de caféine, benzoate et l’aspartame. Ajouter la quantité appropriée de chaque composant dans une fiole jaugée et diluer à la marque 50 mL avec la phase mobile.
Les 3 premières solutions chaque contiennent un seul composant, afin de permettre l’identification des pics. Les 4 autres solutions contiennent une gamme de concentrations de tous les 3 composants, afin de corréler la hauteur du pic de concentration.
Versez chaque solution étalon dans un flacon étiqueté dans un rack d’échantillon. Magasin le panier de l’échantillon avec les échantillons et les solutions restantes dans le réfrigérateur.
Tout d’abord, mettre en place la phase mobile et les conteneurs à déchets. S’assurer que les canalisations sont introduites dans un conteneur à déchets et recyclent pas dans la phase mobile. Veiller à ce que la conduite d’aspiration de la phase mobile est alimentée dans le récipient de la phase mobile.
Vérifiez que le débit de la phase mobile est défini sur 0,5 mL/min. Ce débit permettra à tous les composants éluer à moins de 5 min, mais il est assez lent pour assurer la résolution des sommets individuels.
Ensuite, vérifiez les pressions minimales et maximales sur le système de livraison solvant. Ces paramètres arrête la pompe en cas de fuite ou de colmatage, respectivement.
Appuyez sur « zéro » sur le panneau avant de détecteurs, de mettre à l’essai à blanc. Rincer à l’eau désionisée, puis avec plusieurs volumes de 1 7 étalons de travail, une seringue de 100 μL. Puis remplissez la seringue avec cette solution. Commencer avec les 3 échantillons de composant unique afin d’identifier le pic de chaque composant.
Ensuite, manuellement, injecter la solution, en plaçant l’injecteur poignée en position de charge. Injecter lentement le 100 μL de solution via le port de la cloison.
Vérifiez que le programme de collecte de données est défini pour recueillir des données pour 300 s, ce qui permet de suffisamment de temps pour tous les 3 pics à éluer à travers le détecteur. Lorsque vous êtes prêt à commencer le procès, tourner la manivelle de l’injecteur à la position d’insertion, afin d’injecter l’échantillon dans la phase mobile. Immédiatement, cliquez sur « Commencer le procès » sur le programme de collecte de données. Lorsque l’analyse est terminée, répétez le processus pour chacune des solutions étalons 7. Pour chacune des 3 premières normes, seulement un des 3 sommets apparaît. Notez l’emplacement du pic, qui est utilisé pour identifier le composant.
Choisissez 3 régime échantillons de soude et leur permettre de s’asseoir dans des conteneurs ouverts toute la nuit pour enlever la carbonatation.
Après une nuit de dégazage, attirer environ 3 mL de chaque régime de soude dans une seringue en plastique. Ensuite, attachez une extrémité du filtre à la seringue et pousser la soude à travers le filtre dans un flacon en verre, afin d’éliminer les particules solides.
Diluer 2 mL de chaque échantillon avec 2 mL de la phase mobile pour diminuer la concentration de soude par moitié.
Attirer 100 μL de l’un des échantillons de soude dans une seringue et l’injectent dans la boucle d’échantillonnage. Exécuter l’essai avec des paramètres identiques aux solutions standards. Répétez pour chaque échantillon de soude.
Tout d’abord, établir une corrélation entre la surface des pics des échantillons standards à des concentrations connues. Pour ce faire, déterminer la surface des pics sur les chromatographes pour chaque échantillon standard à l’aide de la méthode triangulaire. Calculer les heures de pointe hauteur avec la largeur à la moitié de la hauteur et utiliser cette valeur comme la surface du pic.
À l’aide de l’aire des pics et des concentrations connues créer une courbe d’étalonnage pour chaque composant et définir les méthode des moindres carrés pour chaque courbe d’étalonnage.
Calculer la concentration de chaque composante dans les boissons gazeuses diète de la surface des pics. N’oubliez pas que le sodas ont été dilué par un facteur de 2 avant injection dans la CLHP. Selon ces résultats, calculer le mg de chaque composant dans une canette de 12 onces de soude.
Sans surprise, tous les 3 sodas testés contenaient à peu près la même quantité du conservateur benzoate. Toutefois, les produits Coke contient plus de caféine. Les valeurs calculées pour tous les composants en corrélation bien aux valeurs rapportées par les fabricants.
HPLC est un instrument très polyvalent, qui est utilisé dans une large gamme d’analyses.
HPLC est souvent utilisé pour purifier les molécules peptidiques. Dans cet exemple, peptide transmembranaire complexes ont été préparés et puis stabilisé par réticulation oxydante des protéines avec des ponts disulfures.
Les protéines sont ensuite dissous dans l’acide formique et purifiée en utilisant renversée phase HPLC. L’échantillon est ensuite éluée utilisant un gradient linéaire de deux solvants et la pureté confirmé avec la spectrométrie de masse.
HPLC permet également d’identifier des composés organiques synthétisés dans le laboratoire. Dans l’expérience de Miller-Urey, a étudié la synthèse abiotique des composés organiques sur la terre primordiale. Gaz primordiales, comme le méthane et d’ammoniac, ont été introduits dans une fiole contenant de l’eau, simulant des Océans au début. Décharge électrique a ensuite été appliqué, imitant la foudre sur la terre primordiale.
L’eau a été analysée puis à l’aide de HPLC couplée à la spectrométrie de masse et par rapport aux normes connues des acides aminés. 23 acides aminés ont été synthétisés et identifiés dans cette expérience.
Vous avez juste regardé introduction de Jupiter à l’HPLC. Vous devez maintenant comprendre les rudiments de l’instrument en cours d’exécution et d’analyser les données résultantes.
Merci de regarder !
Results
Les chromatogrammes HPLC sont en mesure de quantifier chacune des 3 composantes de tous les échantillons basés sur les courbes d’étalonnage des normes (Figure 3).
Cette série d’expériences, on a déterminé qu’une canette de 12 onces de ces boissons gazeuses diète contenait les quantités suivantes de chaque composant :
Diet Coke : 50,5 mg de caféine ; aspartame 217,6 mg ; benzoate de 83,6 mg.
Coke Zero : 43,1 mg de caféine ; aspartame de 124,9 mg ; benzoate de 85,3 mg.
Pepsi diète : 34,1 mg caféine ; aspartame de 184,7 mg ; benzoate de 79,5 mg.
Sans surprise, tous les 3 n’avait à peu près la même quantité de benzoate, tel qu’il est juste un préservatif. Les produits de Coke avaient un peu plus de caféine, et le Coke Zero avait beaucoup moins l’aspartame que les deux autres sodas, puisqu’elle comprend également l’acide citrique pour certains arômes.
Les numéros suivants sont les montants réels de caféine et de l’aspartame dans une canette de 12 onces du sodas de 3 régime (la teneur en caféine a été obtenue sur les sites Web de Coca-Cola et Pepsi. Le contenu de l’aspartame a été obtenu à la fois LiveStrong.com et DiabetesSelfManagement.com.) :
Diet Coke : 46 mg de caféine ; aspartame 187,5 mg
Coke Zero : 34 mg de caféine ; aspartame 87,0 mg
Pepsi diète : 35 mg caféine ; aspartame 177,0 mg
Exemples de calcul (tableau 2) :
Concentration de caféine dans STD #1 : la solution de composant pour la caféine avait 0,400 g de caféine jusqu'à 500 mL = 0,500 L → 0,800 g / L = 0,800 mg / mL.
STD #1 a 1 mL de cette solution diluée à 50,0 mL
0,800 mg/mL * (1,0 mL/50,0 mL) = 0,016 mg / mL = 16,0 mg / L.
STD #2 a 2 mL de cette solution diluée à 50,0 mL
0,800 mg/mL * (2,0 mL/50,0 mL) = 0,032 mg / mL = 32,0 mg / L.
Les résultats de la trois d’abaques (Figure 4) a donné les équations suivantes :
Aire du pic de caféine = 0.1583* [mg/L de caféine] - 0.574
Aire du pic de l’aspartame = 0.02696* [Aspartame mg/L] - 0,405
Aire du pic de benzoate = 0.1363* [Benzoate mg/L] - 1,192
Diet Coke : Aire du pic de caféine = 10.68 = 0.1583* [mg/L de caféine] - 0.574
[Mg/L de caféine] = (10,68 + 0.574) / (0.1583) = 71,1 mg/L dans l’échantillon injecté.
Étant donné que l’échantillon a été dilué par un facteur de 2, le Diet Coke avait caféine 141,2 mg/L.
Le montant par 12 onces peut = (141,2 mg/L) (can de 0.3549 mL/12 oz) = 50,5 mg de caféine / can.
La figure 3. Les chromatogrammes HPLC des 5 normes et les 3 échantillons.
La figure 4. Les courbes d’étalonnage pour chacun des 3 composants.
Le tableau 2. Les tableaux de données pour les essais de HPLC utilisés pour générer les courbes d’étalonnage.
Applications and Summary
HPLC est une technique largement utilisée dans la séparation et la détection pour de nombreuses applications. Il est idéal pour les composés non volatils, comme la chromatographie en phase gazeuse (GC) exige que les échantillons sont dans leur phase gazeuse. Composés non volatils comprennent des sucres, des vitamines, des médicaments et des métabolites. En outre, il est non destructive, qui permet à chaque composant à être prélevés pour une analyse ultérieure (par exemple la spectrométrie de masse). Les phases mobiles sont pratiquement illimitées, qui permet de modifier la polarité du pH pour atteindre la meilleure résolution. L’utilisation de phases mobiles gradients permet pour ces changements au cours des essais réels.
Il y a eu des inquiétudes sur les problèmes de santé possibles qui peuvent être associés à l’édulcorant artificiel aspartame. Étiquetage des produits actuel ne montre pas le montant de ces composants à l’intérieur les boissons de régime alimentaire. Cette méthode permet de quantifier ces montants, ainsi que de la caféine et le benzoate.
D’autres applications comprennent le calcul des montants des pesticides dans l’eau ; détermination du montant de l’acétaminophène ou l’ibuprofène en comprimés de soulageur de douleur ; déterminer s’il y a des produits dopants présents dans le sang des athlètes ; ou tout simplement déterminer la présence de drogues dans un laboratoire du crime. Alors que les concentrations de ces échantillons et souvent l’identité des composants, peuvent être facilement déterminés, l’une des limites sont que plusieurs échantillons pourraient avoir à proximité de rétention identique fois, résultant en co à élution.
