Overview
Fonte: Laboratório de Jeff Salacup - Universidade de Massachusetts Amherst
O produto de uma extração de solvente orgânico, um extrato lipídeca total (TLE), é muitas vezes uma mistura complexa de centenas, se não milhares, de diferentes compostos. O pesquisador muitas vezes só está interessado em um punhado de compostos ou, se estiver interessado em muitos, pode precisar remover constituintes indesejados que estão "no caminho" ou co-eluindo. Por exemplo, as concentrações de compostos individuais em uma amostra são frequentemente determinadas em um cromatógrafo gasoso acoplado a um detector de 500 chama (GC-FID), porque a relação entre a resposta fid (em pA) e a quantidade de composto em uma amostra (por exemplo,ng/μL) é linear e sensível. A porção GC do instrumento separa diferentes compostos em uma amostra baseada em seu ponto de ebulição, estrutura química e afinidade com uma fase sólida que pode mudar de acordo com a aplicação. O resultado é um cromatógrafo (Figure 1), mostrando a separação de diferentes componentes químicos no tempo, bem como sua concentração relativa (calculada como a área sob a curva). No entanto, às vezes mais de um composto elutes fora do GC de cada vez (Figure 1). Neste caso, a purificação da amostra é necessária antes que os compostos possam ser quantificados com confiança.
Figura 1. Um cromatógrafo mostrando a separação de diferentes componentes químicos ao longo do tempo e sua concentração relativa (área sob a curva). Picos de eluição e separação são mostrados.
Principles
Os FAMEs (esters de metila ácido graxo) são importantes constituintes de micróbios terrestres e marinhos e são frequentemente usados, em conjunto com técnicas genéticas, para descrever a diversidade microbiana do ecossistema em sistemas modernos e antigos. No entanto, a presença de FAMEs em uma amostra nem sempre é útil. Devido ao seu tamanho e química semelhantes, os FAMEs chamados alkenonatos apenas co-elute com cetonas de alquila de cadeia longa, chamados alkenones(Figura 2). A distribuição de alkenonas em uma amostra relaciona informações sobre a temperatura da superfície do mar no momento e/ou no local onde a amostra foi colhida, e por isso sua caracterização precisa e precisa é importante.
A saponificação é uma técnica comum de purificação usada para converter FAMEs em ácidos graxos, alterando assim suas características químicas o suficiente para removê-las da co-eluição com alkenonas(Figura 3). Saponificação é uma forma de hidrólise. Na hidrólise, a água é usada para dividir moléculas. A saponificação é uma hidrólise acelerada na presença de uma base, como hidróxido de potássio (KOH). KOH dissolve-se em K+ e OH- na água. O antion de hidróxido (OH-, íon carregado negativamente) adiciona ao átomo de carbono terciário ligeiramente carregado positivamente no coração da FAME (Figura 3, topo). No entanto, esta configuração química é instável, (o carbono se uniu a muitos outros átomos) e o alkoxida (ROH-) é expelido. Mas o H da base conjugada esta expulsão forma-se rapidamente para o alcóxido para formar o teor alcoólico metanol e o sal de potássio ácido graxo(Figura 3, meio). Neste ponto, o OFENDING FAME (alquenato) foi convertido em um produto químico que não se co-elutes com ele. No entanto, se desejar também analisar a química FAME, eles podem ser recuperados pela adição de ácido (HCl) à solução, até que o pH atinja ~2. Neste pH, o sal de potássio ácido graxo é dividido para formar um ácido carboxílico e sal iônico (KCl; Figura 3, inferior).
Figura 2. As estruturas químicas de uma alquena com 37 átomos de carbono e 2 ligações duplas (topo) e sua alquenato associado FAME (inferior).
Figura 3. Um esquema da saponificação do ácido palmítico usando hidróxido de potássio (KOH) para aumentar a taxa de hidrólise (http://www.mpbio.com/).
Saponificação é uma técnica comumente usada para remover ésteres de metila ácido graxo de uma mistura orgânica complexa.
Amostras orgânicas complexas são frequentemente analisadas por cromatografia gasosa, que é usada para determinar as concentrações relativas de componentes individuais.
No entanto, compostos semelhantes em tamanho e estrutura não podem ser distinguidos pelo instrumento, distorcendo os resultados. Portanto, compostos indesejados que produzem sinais sobrepostos devem ser removidos para obter resultados precisos.
Este vídeo abrange o uso da saponificação para purificar alkenones para paleoclimatologia. É o primeiro de uma série detalhando a purificação de amostras complexas de biomarcadores. Ele cobrirá o procedimento, bem como alguns outros usos da técnica.
Cetonas de alquila de cadeia longa poli-insaturadas, chamadas alkenonas, têm sido demonstradas para fornecer informações úteis sobre a temperatura da superfície do mar.
No entanto, os organismos que produzem alkenonas muitas vezes criam esteres de metila ácidos graxos que são semelhantes em tamanho e estrutura química, chamados alquenatos. Devido a essas semelhanças, os alquenatos devem ser removidos antes que uma análise precisa possa ser obtida.
A saponificação é uma técnica comum usada para evitar a co-eluição dessas moléculas. A saponificação utiliza água para dividir a ligação molecular de um éster. Uma base se prende ao carbono no coração do alquenato. Esta reação de adição cria um intermediário instável, e o alkoxida é expulso.
O hidrogênio do ácido recém-formado move-se para o alkoxida expelido, e o ânion carboxilato resultante forma uma ligação iônica com a cáção da base. O resultado é um álcool e um sal de ácido graxo. Adicionar um ácido forte irá re-gerar o ácido carboxílico. Neste ponto, o alquenato ofensivo foi convertido em uma forma que não mais se co-elutes com a alkenone de interesse.
Agora que você entende como a saponificação pode ser usada para purificar uma mistura orgânica, você está pronto para começar o procedimento.
Primeiro, adquira um extrato lipídado total seco - ou TLE - que foi obtido utilizando um método de extração de solvente. Em seguida, prepare as soluções de saponificação conforme descrito no protocolo de texto. Certifique-se de que todos os componentes estão puros e livres de hidrocarbonetos. Uma vez que as soluções sejam preparadas, adicione o TLE seco a um frasco de vidro borossilicato de 60 mL. Adicione 2 mL de 2 hidróxido de potássio normal e sele o frasco. Em seguida, aqueça o frasco a 60 °C por 2,5 h para apertar o laço éster. Quando estiver completo, deixe a amostra esfriar até a temperatura ambiente. Uma vez que a amostra tenha esfriado, adicione 2 mL de solução de cloreto de sódio de 5% ao frasco. Tampe o frasco, e agite brevemente. Adicione 6 N de ácido clorídrico em gota até que um pH de 2 seja atingido - usando papel pH para testar. A adição deste ácido protonatorá o ânion carboxilato para formar o produto final - o ácido carboxílico estável.
Agora que a solução acidificada é livre de éster, adicione 5 mL de hexano. Cap e shake vigorosamente por 5 segundos para extrair os compostos orgânicos da água. Deixe a solução descansar até que as fases orgânicas e aquosas se separem completamente. Sais, íons e ácido clorídrico não redigido permanecerão na fase aquosa, enquanto os compostos orgânicos se separarão no hexano. Uma vez que as fases tenham se separado completamente, remova aproximadamente 75% do hexano usando uma pipeta e dispense em outro frasco de 40 mL. Repita este processo de extração duas vezes adicionais, adicionando 5 mL de hexano cada vez. Uma vez que isso esteja concluído, descarte a solução aquosa restante em um recipiente de resíduos adequado. Rotule o frasco contendo a fase orgânica recém-saponizada. Os ácidos carboxílicos produzidos não podem ser injetados nos instrumentos comumente utilizados para análise de alkenone sem maior purificação. Ácidos carboxílicos injetados em um cromatógrafo a gás rapidamente se acumulam e arruinam entradas, forros de entrada e a parte frontal das colunas. Para remover esses ácidos, a amostra primeiro precisa passar por outra técnica de purificação: separação via cromatografia de coluna.
A saponificação tem várias aplicações na extração e purificação de moléculas orgânicas.
A saponificação pode ser usada não apenas para separar biomarcadores, mas também para extrair componentes individuais para uso em produtos comerciais. Neste exemplo, compostos da tabacaria - Nicotiana glauca - foram isolados e analisados para investigar seu potencial como matéria-prima para uma grande variedade de produtos de base biológica, como combustível, calor e uma variedade de compostos químicos.
As folhas foram primeiro homogeneizadas, depois centrifadas, para concentrar as moléculas de interesse. O material concentrado da planta foi então saponizado. O material extraído foi analisado com espectrometria de massa cromatografia líquida, para determinar a concentração de tocopherol - uma família de compostos de vitamina E tipicamente encontrados em plantas.
O material extraído também pode ser reconstituído in vitro à sua composição original. Neste exemplo, a saponificação foi usada para extrair carotenoides de plantas de espinafre, para serem posteriormente reconstituídos in vitro. O espinafre foi primeiro homogeneizado, depois centrifutado, para colher as moléculas de pigmento. Essas moléculas foram então suspensas em uma solução de hidróxido de potássio em um funil separador, iniciando a saponificação. Os carotenoides saponificados separados em uma camada de éter, que foi coletada e seca. Usando uma série de tampões de solução, os carotenoides - e outras moléculas de pigmentação - foram posteriormente reconstituídos in vitro. Esta purificação permitiu a análise desses pigmentos sem a interferência de compostos orgânicos estruturados da mesma forma.
Devido à sua capacidade de hidrolisar ésteres, a saponificação pode ser usada para "libertar" compostos que de outra forma estão ligados a macromoléculas. Neste exemplo, um passo de saponificação anidro é usado para converter etil 4-fluorobenzoato ao sal ácido carboxílico de potássio4-fluorobenzoato. Essa desproteção através da saponificação permite a produção de SFB bruto - uma reação que não seria possível se a molécula permanecesse "presa".
Você acabou de assistir a introdução de JoVE à purificação de Uk'37 amostras através da saponificação. Agora você deve entender como a saponificação funciona, e como usá-la para purificar alkenones em um extrato lipídudo total. Outros processos de purificação serão demonstrados em vídeos subsequentes.
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Procedure
1. Instalação e Preparação de Materiais
- Obtenha um extrato lipídeco total (TLE) usando um método de extração de solvente (Sonication, Soxhlet ou Accelerated Solvent Extraction (ASE).
- Prepare uma solução de 2 N KOH em 5% H2O em metanol.
- KOH e metanol podem ser comprados em varejistas químicos. Esses produtos químicos devem ser puros e livres de hidrocarbonetos.
- A massa molar de KOH é ~56 amu rendendo 1 mol de OH- para cada mol de KOH. Assim, para alcançar uma concentração de 2 N, dissolva 112 g de KOH em 0,95 L de água pura e 0,05 L de metanol.
- Note que a dissolução de KOH na água é exotérmica e cria uma grande quantidade de calor. Tome cuidado para adicionar as pelotas KOH à água lentamente para evitar uma reação violenta.
- Dissolva 112 g de pelotas KOH em 0,95 L de água pura em uma placa de agitação automática.
- Adicione 0,05 L de metanol uma vez que todo o KOH é dissolvido para ajudar na dissolução dos biomarcadores orgânicos na solução aquosa.
- KOH e metanol podem ser comprados em varejistas químicos. Esses produtos químicos devem ser puros e livres de hidrocarbonetos.
- Prepare uma solução de ácido clorídrico de 6 N (HCl) em H2O.
- HCl pode ser comprado de varejistas químicos. Este produto químico deve ser puro e livre de hidrocarbonetos.
- HCl geralmente vem concentrado como 13 N. Assim, uma mistura de 1:1 de HCl e água pura produz uma mistura de 6,5 N de HCl, que é perto o suficiente de 6 N para os propósitos deste experimento.
- Certifique-se de adicionar o HCL à água e não o contrário, pois adicionar água ao HCl concentrado é exotermímico e gera calor. Isso pode fazer com que o HCL espirre.
- Despeje suavemente e lentamente 100 mL HCl em um béquer contendo 100 mL de água pura, girando a mistura entre adições de HCl.
- Prepare uma solução de 5% NaCl (sal de mesa) em H2O.
- NaCl pode ser comprado de varejistas químicos. Este produto químico deve ser puro e livre de hidrocarbonetos.
- Calcular e pesar a massa de sal necessária para fazer ~1 L de solução de 5% (w/w). 1 L de água pesa ~1 kg ou 1.000 g. Assim, 50 g de NaCl dissolvido em 950 mL dá uma solução de 5% (50 g+ 950 g = 1.000 g; 50 g / 1.000 g = 0,05 ou 5%).
- Adicione suavemente 50 g de NaCl à água pura em uma placa de agitação automática e espere que ela se dissolva.
- Obtenha os seguintes materiais: 2 frascos de vidro limpos e queimados (550 °C por 6 h) 40 mL borossilicados com tampa forrada com PTFE; um forno aquecido ou blocos de aquecimento; combustíveis (550 °C por 6 h) pipetas e lâmpadas de vidro borossilicato; fita pH (alcance ácido); Hexano (hexano pode ser comprado em varejistas químicos. Este produto químico deve ser Grau Optima ou equivalente).
2. Métodos
- Comece com o TLE seco (contendo ésteres) em um dos frascos de vidro borossilicato de 40 mL.
- Adicione aproximadamente 10 mL de 2 N KOH ao TLE e cap.
- Aqueça no forno ou em um bloco de aquecimento a 60 °C por 2,5 h para apertar a ligação éster(Figura 3).
- Remova a amostra do fogo e deixe esfriar até a temperatura ambiente.
- Adicione aproximadamente 10 mL da solução NaCl de 5% à TLE (Figura 3). Isso ajuda a manter a interface entre a fase aquosa e orgânica (a ser adicionada) da espuma. Cap e shake brevemente.
- Adicione 6 N HCl ao TLE salgado dropwise até que o pH 2 seja alcançado para protonar o O- e formar o produto final, um ácido carboxílico estável(Figura 3; use papel pH para testar). Se o TLE foi colorido, pode haver uma mudança de cor coincidindo com pH 2.
- Adicione aproximadamente 20 mL de hexano à solução acidificada, que agora está livre de éster. Cap e shake vigorosamente para 5 s para extrair compostos orgânicos da água.
- Deixe definir até que as fases aquosas e orgânicas separem completamente. Sais, íons, água e HCl não redigido permanecem na fase aquosa. Compostos orgânicos estão agora no hexano.
- Remova aproximadamente 75% do hexano supernante usando uma pipeta e dispense no outro frasco de vidro borossilicato de 40 mL.
- Repita 2,7 - 2,9 duas vezes, adicionando aproximadamente 10 mL de hexano cada vez.
- Descarte a mistura aquosa restante em um recipiente de resíduos adequado.
- Rotule o frasco contendo hexano e orgânicos sem éster "TLE - saponificado.
Saponificação é uma técnica comumente usada para remover ésteres de metila ácido graxo de uma mistura orgânica complexa.
Amostras orgânicas complexas são frequentemente analisadas por cromatografia gasosa, que é usada para determinar as concentrações relativas de componentes individuais.
No entanto, compostos semelhantes em tamanho e estrutura não podem ser distinguidos pelo instrumento, distorcendo os resultados. Portanto, compostos indesejados que produzem sinais sobrepostos devem ser removidos para obter resultados precisos.
Este vídeo abrange o uso da saponificação para purificar alkenones para paleoclimatologia. É o primeiro de uma série detalhando a purificação de amostras complexas de biomarcadores. Ele cobrirá o procedimento, bem como alguns outros usos da técnica.
Cetonas de alquila de cadeia longa poli-insaturadas, chamadas alkenonas, têm sido demonstradas para fornecer informações úteis sobre a temperatura da superfície do mar.
No entanto, os organismos que produzem alkenonas muitas vezes criam esteres de metila ácidos graxos que são semelhantes em tamanho e estrutura química, chamados alquenatos. Devido a essas semelhanças, os alquenatos devem ser removidos antes que uma análise precisa possa ser obtida.
A saponificação é uma técnica comum usada para evitar a co-eluição dessas moléculas. A saponificação utiliza água para dividir a ligação molecular de um éster. Uma base se prende ao carbono no coração do alquenato. Esta reação de adição cria um intermediário instável, e o alkoxida é expulso.
O hidrogênio do ácido recém-formado move-se para o alkoxida expelido, e o ânion carboxilato resultante forma uma ligação iônica com a cáção da base. O resultado é um álcool e um sal de ácido graxo. Adicionar um ácido forte irá re-gerar o ácido carboxílico. Neste ponto, o alquenato ofensivo foi convertido em uma forma que não mais se co-elutes com a alkenone de interesse.
Agora que você entende como a saponificação pode ser usada para purificar uma mistura orgânica, você está pronto para começar o procedimento.
Primeiro, adquira um extrato lipídado total seco - ou TLE - que foi obtido utilizando um método de extração de solvente. Em seguida, prepare as soluções de saponificação conforme descrito no protocolo de texto. Certifique-se de que todos os componentes estão puros e livres de hidrocarbonetos. Uma vez que as soluções sejam preparadas, adicione o TLE seco a um frasco de vidro borossilicato de 60 mL. Adicione 2 mL de 2 hidróxido de potássio normal e sele o frasco. Em seguida, aqueça o frasco a 60 °C por 2,5 h para apertar o laço éster. Quando estiver completo, deixe a amostra esfriar até a temperatura ambiente. Uma vez que a amostra tenha esfriado, adicione 2 mL de solução de cloreto de sódio de 5% ao frasco. Tampe o frasco, e agite brevemente. Adicione 6 N de ácido clorídrico em gota até que um pH de 2 seja atingido - usando papel pH para testar. A adição deste ácido protonatorá o ânion carboxilato para formar o produto final - o ácido carboxílico estável.
Agora que a solução acidificada é livre de éster, adicione 5 mL de hexano. Cap e shake vigorosamente por 5 segundos para extrair os compostos orgânicos da água. Deixe a solução descansar até que as fases orgânicas e aquosas se separem completamente. Sais, íons e ácido clorídrico não redigido permanecerão na fase aquosa, enquanto os compostos orgânicos se separarão no hexano. Uma vez que as fases tenham se separado completamente, remova aproximadamente 75% do hexano usando uma pipeta e dispense em outro frasco de 40 mL. Repita este processo de extração duas vezes adicionais, adicionando 5 mL de hexano cada vez. Uma vez que isso esteja concluído, descarte a solução aquosa restante em um recipiente de resíduos adequado. Rotule o frasco contendo a fase orgânica recém-saponizada. Os ácidos carboxílicos produzidos não podem ser injetados nos instrumentos comumente utilizados para análise de alkenone sem maior purificação. Ácidos carboxílicos injetados em um cromatógrafo a gás rapidamente se acumulam e arruinam entradas, forros de entrada e a parte frontal das colunas. Para remover esses ácidos, a amostra primeiro precisa passar por outra técnica de purificação: separação via cromatografia de coluna.
A saponificação tem várias aplicações na extração e purificação de moléculas orgânicas.
A saponificação pode ser usada não apenas para separar biomarcadores, mas também para extrair componentes individuais para uso em produtos comerciais. Neste exemplo, compostos da tabacaria - Nicotiana glauca - foram isolados e analisados para investigar seu potencial como matéria-prima para uma grande variedade de produtos de base biológica, como combustível, calor e uma variedade de compostos químicos.
As folhas foram primeiro homogeneizadas, depois centrifadas, para concentrar as moléculas de interesse. O material concentrado da planta foi então saponizado. O material extraído foi analisado com espectrometria de massa cromatografia líquida, para determinar a concentração de tocopherol - uma família de compostos de vitamina E tipicamente encontrados em plantas.
O material extraído também pode ser reconstituído in vitro à sua composição original. Neste exemplo, a saponificação foi usada para extrair carotenoides de plantas de espinafre, para serem posteriormente reconstituídos in vitro. O espinafre foi primeiro homogeneizado, depois centrifutado, para colher as moléculas de pigmento. Essas moléculas foram então suspensas em uma solução de hidróxido de potássio em um funil separador, iniciando a saponificação. Os carotenoides saponificados separados em uma camada de éter, que foi coletada e seca. Usando uma série de tampões de solução, os carotenoides - e outras moléculas de pigmentação - foram posteriormente reconstituídos in vitro. Esta purificação permitiu a análise desses pigmentos sem a interferência de compostos orgânicos estruturados da mesma forma.
Devido à sua capacidade de hidrolisar ésteres, a saponificação pode ser usada para "libertar" compostos que de outra forma estão ligados a macromoléculas. Neste exemplo, um passo de saponificação anidro é usado para converter etil 4-fluorobenzoato ao sal ácido carboxílico de potássio4-fluorobenzoato. Essa desproteção através da saponificação permite a produção de SFB bruto - uma reação que não seria possível se a molécula permanecesse "presa".
Você acabou de assistir a introdução de JoVE à purificação de Uk'37 amostras através da saponificação. Agora você deve entender como a saponificação funciona, e como usá-la para purificar alkenones em um extrato lipídudo total. Outros processos de purificação serão demonstrados em vídeos subsequentes.
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Results
Esta purificação produz um TLE livre de ésteres que podem estar co-eluting com os alkenones. No entanto, a purificação produziu ácidos carboxílicos, que não podem ser injetados em instrumentos comumente usados para analisar amostras para concentrações de alkenona devido à sua baixa volatilidade. Por exemplo, o ponto de ebulição do hexano, um hidrocarboneto de 6 carbonos, é de 68 °C, mas o ponto de ebulição de seu ácido (ácido hexanoico) é de 205 °C. A maioria dos biomarcadores gc tem de 20 a 35 átomos de carbono (o ponto de ebulição geralmente aumenta com um número crescente de átomos), e a maioria dos programas de temperatura GC param em torno de 300 °C. Ácidos carboxílicos injetados em um GC rapidamente se acumulam e arruinam entradas, forros de entrada e a parte frontal das colunas. Para remover esses ácidos, a amostra primeiro precisa passar por outra técnica de purificação por meio da cromatografia da coluna.
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Applications and Summary
Como mencionado anteriormente, a saponificação é comumente usada em laboratórios de geoquímica orgânica para remover ésteres de metila ácidos graxos (FAMEs) de alkenones, chamados alkenoatos, que co-elute com alkenonas em cromatógrafos a gás(Figure 1). A saponificação também é usada para "libertar" ácidos graxos "ligados" a sedimentos ou macromoléculas. A degradação e preservação da matéria orgânica e dos biomarcadores em sedimentos envolve a remoção de grupos funcionais (N, O e S) e a eventual polimerização de biomarcadores individuais em macromoléculas e/ou a adsorção de biomarcadores e macromoléculas em superfícies minerais. Nem todos os biomarcadores em um cenário tornam-se vinculados, e a proporção de biomarcadores vinculados à liberdade pode mudar por definição e idade dos sedimentos por razões ainda não totalmente explicadas. A saponificação, às vezes a temperaturas mais altas do que as aqui discutidas (>200 °C), é usada para libertar esses biomarcadores vinculados no esforço de descrevê-los, sua fonte e os mecanismos responsáveis por sua natureza vinculada.
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