Overview
Fonte: Perchet Thibaut1,2,3, Meunier Sylvain1,2,3, Sophie Novault4, Rachel Golub1,2,3
1 Unidade de Linfísia, Departamento de Imunologia, Instituto Pasteur, Paris, França
2 INSERM U1223, Paris, França
3 Université Paris Diderot, Sorbonne Paris Cité, Cellule Pasteur, Paris, França
4 Flow Cytometry Platfrom, Cytometry and Biomarkers UtechS, Center for Translational Science, Pasteur Institute, Paris, França
O ciclo celular é um processo universal de vida. Durante o ciclo celular, uma célula sofre várias modificações para se dividir em duas células filhas. Esse mecanismo ocorre ao longo da vida de um organismo em resposta às suas necessidades. Divisões celulares e desenvolvimento embrionário produzem um organismo completo a partir de um zigoto unicelular. Durante a idade adulta, o ciclo celular é central para muitos processos biológicos críticos, como reparos teciduais.
Mecanismos de divisão celular são eventos fortemente controlados onde a célula sofre modificações stepwise antes da divisão final. As células que ainda não estão no ciclo são descritas como estando na fase Gap 0 (G0). Durante esta fase, a célula é considerada quiescente. Quando a célula começa a pedalar, quatro fases distintas são reconhecidas: Gap 1 (G1),Síntese (S), Gap 2 (G2) e Mitosis (M). A fase G1 é um ponto de verificação para os recursos necessários pela célula para a síntese de DNA. Em seguida, ocorre a fase S, e a replicação do DNA começa, seguida pela interfase G2, outro ponto de verificação que controla todos os elementos necessários para que a célula se divida. Finalmente, a célula entra na mitose e se divide em duas células filhas.
A divisão celular é um parâmetro altamente informativo em muitos sistemas biológicos diferentes. No campo da imunologia, a análise da proliferação de leucócitos pode indicar o mecanismo da resposta imune. Outros domínios da investigação também se baseiam na análise do ciclo celular. Por exemplo, a análise do ciclo celular durante o desenvolvimento do tumor melhorou nossa compreensão do câncer.
Muitos corantes fluorescentes estão agora disponíveis para rastrear a proliferação celular. Estes corantes diferem em suas propriedades químicas e espectrais. Existem duas classes diferentes de corantes: corantes proteicos se combinam permanentemente com proteínas formando uma ligação covalente, e corantes de membrana intercalam-se dentro das membranas celulares através de fortes associações hidrofóbicas. Estudos in vitro e in vivo de proliferação de células imunes por citometria de fluxo estão entre as aplicações mais comuns de ambas as classes de corantes de rastreamento celular (1, 2).
CFSE (Carboxyfluorescein succinimidyl é um corante fluorescente que marca células divisórias. Inicialmente, todas as células recebem a mesma quantidade de corante; dividindo células uniformemente dividir o corante que receberam entre suas duas células filhas. Consequentemente, o ciclo celular pode ser seguido pela diminuição progressiva da intensidade do corante nas células. A coloração do CFSE é seguida pela citometria de fluxo multiparamétrico convencional, uma tecnologia baseada em fluorescência de alto rendimento que permite caracterização fenotípica e funcional das células com base no seu grau de coloração de CFSE (3).
No experimento a seguir, avaliamos a proliferação de células CD4+ e CD8+ T in vitro,seguindo a estimulação do CD3, utilizando coloração de CFSE e citometria de fluxo.
Procedure
1. Preparação
- Antes de começar, coloque luvas de laboratório e as roupas de proteção apropriadas.
- Esterilize todas as ferramentas de dissecção, primeiro com um detergente e depois com 70% de etanol e depois limpe-as completamente.
- Prepare 50 mL da solução de sal balanceada da Hank (HBSS) contendo 2% de soro fetal de bezerro (FCS).
2. Dissecção
- Usando um sistema de entrega de dióxido de carbono, eutanize o rato por hipóxia. Fixar o rato eutanizado em uma placa de dissecção na posição supina e realizar uma laparotomia longitudinal usando tesouras e fórceps.
- Usando fórceps, mova os intestinos e o estômago do lado direito do abdômen para expor o estômago e o baço. O baço está preso ao estômago.
- Usando fórceps cuidadosamente desprender o baço do estômago e colocá-lo na placa de Petri contendo 5 mL de HBSS 2% FCS.
3. Isolamento de células imunes
- Coloque o baço em um coador de célula de 40 μm sobre a mesma placa de Petri. Esmague o baço com um êmbolo para dissociá-lo.
- Transfira o baço dissociado e o fluido em um tubo centrífuga de 15 mL.
- Centrifugar o tubo a 370 x g por 7 min a 10°C e descartar o supernatante evitando a pelota.
- Resuspenque a pelota em 2 mL de acetato de potássio para lise os eritrócitos. Aguarde 2 min e depois coma o volume de até 15 mL usando HBSS 2% FCS.
- Centrifugar o tubo novamente a 370 x g por 7 min a 10°C. Descarte o supernatante e resuspenque a pelota em 5 mL de HBSS 2% FCS.
- Conte as células usando um ensaio de coloração azul trypan e ajuste a concentração celular final para 107 células/mL usando um volume apropriado de HBSS 2% FCS.
4. Coloração de CFSE e Estimulação de células T
- Distribua 107 células de baço isolado/tubo em 4 tubos (tubos de 15 mL, rotulados de 1 a 4)
- Adicione 3 mL HBSS 2% FCS a cada tubo.
- Adicione 1 μL de CSFE em cada tubo (concentração final- 5 μM).
- Incubar os tubos a 37°C em uma incubadora de CO2 de 5% por 10 minutos.
- Nos tubos 3 e 4, adicione 12 mL de HBSS 2% de TRFC + anticorpo anti-CD3 em uma concentração final de 2,5 μg/mL. Os tubos 3 e 4 são estimulados usando anticorpo anti-CD3, para observar o efeito no ciclo celular.
- Nos tubos 1 e 2 adicione 12 mL de HBSS 2% FCS. As células nos tubos 1 e 2 não serão estimuladas.
- Centrifugar todos os tubos a 370 x g por 7 min a 10°C. Descarte os supernantes.
- Resuspense as pelotas em 2 mL de HBSS 2%FCS.
- Transfira as soluções resultantes para poços separados em uma placa de 6 poços.
- Incubar as células a 37°C, 5% de CO2 por 3 dias.
5. Mancha celular
- No dia 3, adicione 2 mL HBSS 2%FCS em bem 1 e 3.
- Pipeto vigorosamente e transfira as amostras em tubos FACS de 5 mL.
- Continue incubando as células restantes dos poços 2-4 a 37°C, 5% DE CO2. Eles serão analisados no dia 5 para investigar os efeitos a longo prazo da estimulação no ciclo celular.
- Centrifugar os tubos a 370 x g por 7 min a 10°C. Descarte os supernantes.
- Adicione 100 μL de mistura de anticorpos (ver Tabela 1) a cada tubo.
| Anticorpo | Fluorochrome | Diluição |
| CD3 | Azul do Pacífico | 1/100 |
| CD4 | BV786 | 1/1600 |
| CD8 | PE | 1/400 |
| Teu1.2 | BV605 | 1/400 |
Tabela 1: Composição de mistura de anticorpos. Quatro preparações de coquetéis de anticorpos utilizando conjugados concentrados de anticorpos fluorescentes e HBSS.
- Incubar os tubos por 20 minutos no gelo no escuro.
- Adicione 1 mL de HBSS 2%FCS e centrifugar os tubos a 370 x g por 7 min a 10°C.
- Descarte o supernatante e resuspenque as pelotas em 200 μL de HBSS 2% FCS.
- Transfira as pelotas resuspendadas para tubos FACS novos e rotulados.
- Avalie a proliferação de células T usando FACS.
- No dia 5, repita o processo de coloração celular com as células dos dois poços restantes da placa de 6 poços.
6. Análise de dados
- Abra o software "FlowJo" e arraste os arquivos para a janela "All sample".
- Clique duas vezes no arquivo para células não estimuladas coletadas no dia 3 para exibir um gráfico de pontos com dispersão para a frente no eixo Y e dispersão lateral no eixo X.
- Clique em "Polygon" e crie uma estratégia de gating para selecionar células linfoides, células Thy1.2+ CD3+ e distinguir células CD4+ e CD8+ (ver Figura 1).
Figura 1: Estratégia gating. As células são primeiro fechadas com base em sua morfologia (esquerda: FSC-A, SSC-A). As células T são então fechadas (meio: CD3, Thy1.2) e ainda divididas em células CD4+ T (laranja) e células CD8+ T (azul) (à direita: CD4, CD8). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
- Repita os passos com outros arquivos.
- Para determinar as frequências de células divisórias e não-divisórias, visualize primeiro as populações celulares clicando em "Editor de layout".
- Arraste as células CD4 T e cd8 T de cada um dos quatro tubos para a "janela de amostra"
- Gráficos representando cada população aparecerão.
- Use histograma para visualizar os resultados e selecione "CFSE" como parâmetro para comparação dos diferentes tubos e das diferentes populações.
- Células não divisórias mantêm níveis mais elevados de CFSE, enquanto células proliferantes dividem o conteúdo de CFSE para células divisórias
- Crie um portão em células não-divisórias e aplique-o em todos os tubos.
- Crie um portão sobre células divisórias e aplique-o em todos os tubos.
- Para examinar a frequência de células CD3+ divididas, clique em "Table editor".
- Arraste as populações de interesse - dividindo células T CD8 e dividindo células T CD4 - em "Tabela".
- No menu "Estatística", selecione "frequência de células T", em seguida, clique em "Criar tabela" para revelar a frequência em uma nova tabela.
- Clique em "Criar tabela". Para revelar os valores de frequência, apareça em uma nova tabela.
Para a maioria dos estudos de imunologia, medir a proliferação de células imunes é um passo fundamental e o método baseado em corante fluorescente CFSE é comumente usado. A divisão celular adequada é importante para as células imunes, uma vez que regula os níveis e a especificidade de uma resposta imune. Por exemplo, as células T proliferam para identificar e matar células cancerígenas e as células B sofrem divisão celular para produzir anticorpos específicos. A premissa geral do ensaio CSFE envolve a coloração das células com o corante fluorescente verde CFSE, que entra em células vivas e se liga às proteínas internas, resultando em rotulagem permanente. Como resultado, quando a célula pai contendo corante se divide, cada célula filha recebe metade da fluorescência da célula-mãe.
Este processo continua nas divisões subsequentes com a intensidade de corante diminuindo progressivamente a cada divisão. No ponto final desejado, a intensidade de fluorescência de cada célula é medida pela citometria de fluxo. Esses dados são então usados para quantificar o número e o padrão de divisões pelas qual as células passaram. Como mostrado aqui, a população celular com maior fluorescência é da geração dos pais. A segunda maior parte pertence à segunda geração e assim por diante. O número de picos determina o número de divisões celulares.
Além disso, se forem utilizadas células imunes primárias, populações celulares específicas, como as células T, por exemplo, podem ser rotuladas com um corante de fluorescência colorida diferente junto com a CFSE, e simultaneamente identificadas usando citometria de fluxo multicolorido. Os novos dados podem ser plotados no mesmo gráfico, mostrando agora a sub-população de células T com diferentes intensidades de coloração de CFSE, pelas quais a taxa de proliferação das células T pode ser especificamente analisada. Este vídeo demonstra o protocolo para a coloração CFSE de esplenócitos de camundongos, que são estimulados com um anticorpo anti-CD3. Isso é seguido pela coloração para rotular células T e citometria de fluxo para rastrear sua proliferação celular.
Para começar, coloque roupas de proteção adequadas e luvas de laboratório. Em seguida, lave um par de fórceps e dissecando uma tesoura primeiro com um detergente e depois com 70% de etanol e depois limpe-os com uma toalha de papel limpa. Prepare 50 mililitros da Solução de Sal Balanceado da Hank, ou HBSS, com uma concentração de 2% de soro de bezerro fetal, ou FCS, combinando um mililitro de FCS com 49 mililitros de HBSS em um tubo de 50 mililitros. Misture suavemente a solução para cima e para baixo aproximadamente 10 vezes. Em seguida, isole as células do baço do rato, como demonstrado no protocolo de vídeo para o isolamento FACS de linfócitos B esplênicos.
Rotule quatro tubos de 15 mililitros de um a quatro e adicione uma vez 10 às sétimas células isoladas do baço. Em seguida, adicione três mililitros de HBSS 2% FCS a cada tubo. Em seguida, pipeta um microliter de cinco micromolar carboxyfluorescein succinimidyl éster, ou CFSE, em cada tubo. Incubar os tubos a 37 graus Celsius em uma incubadora de dióxido de carbono de 5% por 10 minutos. As células nos tubos um e dois não serão estimuladas. Eles serão usados para revelar o nível basal de proliferação de células T de CD4 e CD8.
Pipeta 10 mililitros de HBSS 2% FCS nestes tubos. Os tubos três e quatro serão estimulados por anticorpos anti-CD3, a fim de observar os efeitos no ciclo celular. Adicione 10 mililitros de HBSS 2% FCS e anticorpo anti-CD3 em uma concentração final de 2,5 microgramas por mililitro aos tubos três e quatro. Em seguida, centrifugar todos os tubos a 370 x g por sete minutos a 10 graus Celsius. Descarte os supernantes. Resuspenque as pelotas em dois mililitros de HBSS 2% FCS e pipeta as soluções resultantes em poços separados em uma placa de seis poços. Rotule cuidadosamente a placa de um a quatro para acompanhar as identidades das amostras. Incubar as células a 37 graus Celsius e 5% de CO2 por três dias.
No terceiro dia, adicione dois mililitros de HBSS 2% FCS aos poços um e três, que devem conter as células dos tubos um e três. Pipeta para cima e para baixo vigorosamente e, em seguida, transfira as amostras para tubos FACS rotulados de cinco mililitros. Coloque a placa de seis poços de volta na incubadora. Essas células remanescentes dos poços dois e quatro serão analisadas no quinto dia para investigar efeitos de longo prazo da estimulação no ciclo celular. Centrifugar os tubos a 370 x g por sete minutos a 10 graus Celsius e, em seguida, descartar os supernantes. Agora, adicione 100 microliters de mistura de anticorpos a cada tubo. Incubar os tubos por 20 minutos no gelo no escuro. Em seguida, adicione um mililitro de HBSS 2% DE FCS a cada tubo e centrifugar os tubos a 370 x g por sete minutos a 10 graus Celsius. Descarte os supernantes. Suspenda as pelotas em 200 mililitros de HBSS 2% FCS e misture bem. Transfira as pelotas resuspended para novos tubos FACS rotulados.
Em seguida, avalie a proliferação de células T usando a citometria de fluxo, como mostrado no protocolo FACS. Protea as células para selecionar células linfoides CD3-positivas e distinguir células CD4 positivos e CD8 positivos, e registrar os dados para tubos um e três. No quinto dia, repita o processo de coloração celular com as células dos dois poços restantes da placa de seis poços.
Analisaremos os efeitos da estimulação do CD3 no ciclo celular das células CD4 e CD8 positivos em três dias e cinco dias após a estimulação. Para começar, clique no ícone FlowJo e arraste seus arquivos para a janela Todas as amostras. Clique duas vezes no arquivo para as células não estimuladas coletadas no terceiro dia para exibir um gráfico de pontos com dispersão para a frente no eixo y e dispersão lateral no eixo x. Clique no polígono para circular as populações de linfócitos com base em sua morfologia. Na janela de identificação sub-populacional, nomeie os linfócitos populacionais e clique em OK. Em seguida, clique duas vezes na população circulada e na nova janela, selecione Thy1.2 no eixo y e CD3 no eixo x. Em seguida, clique no polígono para circular as células CD3 e Thy1.2 dupla positiva. Na nova janela de identificação sub-populacional, nomeie a população T-Cells e clique em OK. Em seguida, clique duas vezes na população circulada. Na nova janela, selecione CD4 no eixo y e CD8 no eixo x. Em seguida, clique no polígono para circular a população CD4 positiva. Na nova janela de identificação sub-populacional, nomeie a população CD4 T-Cells e clique em OK. Agora, clique no polígono para circular a população CD8 positiva. Na nova janela de identificação sub-populacional, nomeie a população CD8 T-Cells e clique em OK. Repita essas etapas com os outros arquivos.
Para determinar as frequências de células divisórias e não-divisórias, primeiro, visualize as populações celulares clicando no Editor de Layout. Em seguida, arraste as células T CD4 e cd8 t-cells de cada um dos quatro tubos para a janela All Sample. Gráficos representando suas populações aparecerão. Para cada tubo, clique duas vezes no gráfico de pontos para células T CD8 e selecione Histograma em Definição de Gráfico para visualizar os resultados. Selecione CFSE como parâmetro para comparar as populações celulares estimuladas versus não estimuladas em cada ponto de tempo. As células não-divisórias mantêm níveis mais elevados de CFSE, enquanto as células proliferadoras dividem o conteúdo do CFSE para células divisórias.
Agora, enquanto pressiona a tecla Shift, clique duas vezes no histograma. Na nova janela, clique no intervalo e selecione a faixa de CFSE correspondente ao pico mais alto. Na janela de identificação sub-populacional, nomeie a população não dividindo cd8 t-cells e rotule a população dividindo células CD8. Agora, repita para selecionar as células T CD4 que dividem e não dividem em cada tubo. Para examinar a frequência de células cd3 positivas, clique em Table Editor. Em seguida, arraste as populações de interesse, dividindo cd8 t-cells e dividindo cd4 t-cells, para a mesa. No menu Estatística, selecione Frequência de células T. Em seguida, clique em Criar tabela para revelar a frequência em uma nova tabela.
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Results
Neste experimento, acompanhamos a proliferação de células BAçosa CD4+ e CD8+ T na cultura in vitro. Após 3 dias, não vimos forte proliferação em células CD4+ e CD8+ T com ou sem estimulação. Isso pode ser visto no painel superior da Figura 2 onde os picos de CSFE não estão diminuindo. No entanto, após 5 dias, começamos a ver proliferação em ambas as populações, o que é evidente a partir da diminuição dos picos de CSFE (painéis inferiores, Figura 2). A coloração do CFSE demonstra claramente que tanto as células CD4+ quanto CD8+ T estavam se dividindo mais após a estimulação. Além disso, as células CD8+ T pareciam ser um pouco mais proliferativas do que as células CD4+ T após 5 dias de estimulação.
Figura 2: Proliferação de células CD4 versus CD8 T. Proliferação de células T nos dias 3 (painel superior) e dia 5 (painel inferior). O ciclo celular é comparado entre células CD4 e CD8 T com ou sem estimulação em dois dias diferentes. As células CD4 e CD8 T proliferam mais quando estimuladas. As células T estimuladas pelo CD8 proliferam mais do que as células T estimuladas pelo CD4 no dia 5. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Applications and Summary
Ensaios de proliferação são frequentemente usados em diferentes campos, como a imunologia, para determinar o grau de ativação das células. Também é realizado no diagnóstico oncológico para determinar a agressividade tumoral em pacientes. A coloração de CFSE é uma técnica útil para acompanhar a proliferação das populações de células imunes ao longo do tempo. Outros métodos permitem a caracterização do ciclo celular. BrdU, um equivalente de CFSE é incorporado apenas em células divisórias. O modelo recente do mouse Fucci ainda permite a detecção de fases de ciclo celular, sem coloração adicional.
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References
- Lyons, A. B. and Parish, C. R. Determination of lymphocyte division by flow cytometry. Journal of Immunological Methods. 171 (1): 131-37, (1994).
- Lyons, A. B. Analyzing cell division in vivo and in vitro using flow cytometric measurement of CFSE dye dilution. Journal of Immunological Methods. 243 (1-2), 147-154, (2000).
- Quah, B. J., Warren H. S., and Parish, C. R. Monitoring lymphocyte proliferation in vitro and in vivo with the intracellular fluorescent dye carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester. Nature Protocols. 2 (9): 2049-56, (2007).
