纯培养与划线分离：从混合样品中分离单个细菌菌落

1. 设置

1. 所有微生物都应被视为具有潜在危险。操作时务必穿戴实验服和手套，将长发束起，并确保任何伤口都得到充分保护。
2. 使用70%乙醇对工作区域进行消毒，准备好操作空间。
3. 确保培养皿、样品溶液以及一盒预灭菌的塑料接种环或金属接种环加本生灯火焰均在手边。一次性塑料接种环通常已预灭菌。金属接种环应先浸入70%乙醇中，然后置于本生灯火焰的蓝色区域加热至红热。待冷却时，可轻轻掀开培养皿盖（仅微微开启以防止污染），将接种环轻触凝固的培养基表面进行冷却。
4. 每次操作结束后，需再次对工作区域进行消毒，并彻底清洗或消毒双手及手腕。

2. 实验方案

1. 培养基的制备
   1. 确定并配制一种能够支持所用细菌种类/菌株生长的固体培养基（通常含有1.5% (w/v) 琼脂）。将培养基置于可容纳最终体积两倍的瓶中，以防止高压灭菌时溢出。
   2. 将瓶盖稍拧紧后，放入高压灭菌锅中，在121°C下灭菌20分钟，以对培养基进行灭菌。
   3. 从高压灭菌锅中取出瓶子后，立即正确拧紧瓶盖。若培养基即将使用，可将其置于45°C水浴中以保持液态。琼脂在低于32–40°C时会凝固，之后可通过加热（通常使用微波炉）至85°C使其重新熔化。
2. 培养皿的制备
   1. 在无菌培养皿（通常为100 × 15 mm）底部侧面或底部标记实验者姓名、日期和培养基类型。
   2. 将20–25 mL 45°C的琼脂培养基（先前已制备）倒入每个已标记的培养皿中。若边缘出现泡沫，应使用普通移液器和无菌吸头迅速去除。
   3. 立即盖上所有培养皿的盖子，以防污染。
   4. 在室温下静置约2小时，或在4°C过夜，使琼脂完全凝固。凝固后，应将细菌培养皿倒置存放于4°C环境中，以减少培养基表面的冷凝水形成。
3. 划线接种
   1. 将无菌接种环浸入所需接种物中，立即以“之”字形方式在培养皿的第一象限区域均匀涂布所获取的样品（图1, I）。
   2. 盖上皿盖，重新对接种环进行灭菌，或更换新的无菌一次性接种环。
   3. 从第一象限（含有相对密集的细菌群体）向第二象限方向划3–4条直线（图1, II）。
   4. 盖上皿盖，重新灭菌接种环，或丢弃一次性接种环并更换新的无菌接种环。
   5. 每次使用无菌接种环，依次从第二象限向第三象限、再从第三象限向第四象限重复进行3–4条直线划线操作（图1, III - IV）。
   6. 使用无菌接种环，从第四象限向培养皿中心区域进行最后一次“之”字形划线（图1, V）。该区域细菌密度较低，理想情况下可使单个有活力的母细胞形成独立菌落。
   7. 盖上皿盖，若所用细菌种类有要求，可用封口膜密封以防止空气流动。
   8. 根据细菌种类/菌株的不同，将培养皿倒置放置于适宜环境中培养，直至可见细菌菌落出现（由于初始浓度可能不同，分离的菌落可能出现在培养皿的任意区域）。
   9. 为获得克隆性细菌群体，可另取一培养皿进行划线接种，将原始培养皿中单个菌落分离出的细胞作为新的接种物。