Name: Infection virus de la vaccine et lanalyse temporelle de lexpression des gènes de virus: Partie 2 (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-04-10T00:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 55 s
Description: Découvrez la synthèse d'ADNc à partir d'ARN isolé de cellules HeLa infectées par le virus vaccinia. Cette méthode permet d'amplifier l'ARN viral pour l'analyse microarray de l'expression génique.

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Partie 1: synthèse de l&#39;ADNc de l&#39;ARN <ol><li> Avant d&#39;utiliser le Ambion Amino Allyl MessageAmp II kit, ajouter la quantité recommandée d&#39;éthanol à 100% pour les tampons de lavage. </li><li> Dans le tube de réaction PCR, ajouter entre 100 ng d&#39;ARN total de 5 ug et 1 microlitre de T7 oligo (dT) primer. Porter le volume à 12μl avec une eau sans nucléase. </li><li> Incuber les échantillons à 70 ° C pendant 10 min dans un thermocycleur. </li><li> Retirer les échantillons d&#39;ARN à partir de 70 ° C et centrifuger brièvement. Placez-le sur la glace. </li><li> Préparer le 1 er volet de synthèse master mix et de conserver à température ambiante (avec excédent de 10% pour le pipetage d&#39;erreur). (Tableau 1) </li><li> Mélanger délicatement la pipette ou feuilleter Maître de mélanger, puis centrifuger brièvement. </li><li> Transfert de l&#39;8μl Master Mix pour chaque échantillon d&#39;ARN. Mélanger par aspiration et refoulement 3-4 fois. </li><li> Incuber à 42 ° C pendant 2 heures dans un thermocycleur. </li><li> Centrifuger les échantillons brièvement et placer sur la glace. Procéder immédiatement à l&#39;étape suivante de la synthèse des ADN double brin. </li><li> Préparer le 2 ème volet maîtrise de synthèse mélange sur la glace (avec excédent de 10% pour le pipetage d&#39;erreur). (Tableau 2) </li><li> Mélanger délicatement la pipette ou feuilleter Maître de mélanger, puis centrifuger brièvement. </li><li> Transfert 80μl à chaque échantillon et mélanger délicatement par aspiration et refoulement 3-4 fois. </li><li> Incuber à 16 ° C pendant 2 heures dans un thermocycleur. </li><li> Après l&#39;incubation de 2 heures, procéder à l&#39;ADNc de nettoyage étape ou congeler immédiatement à -20 ° C. </li></ol> Partie 2: l&#39;ADNc double brin de nettoyage <ol><li> Retirez la pure ADNc du réfrigérateur et le laisser se stabiliser à la température ambiante pendant 30 minutes avant utilisation. Agitez la bouteille pour bien remettre en suspension les perles magnétiques ADNc contraignante avant l&#39;utilisation. </li><li> Aliquoter eau sans nucléase dans un tube de 1,5 ml et incuber à 50-60 ° C pendant au moins 10 minutes pendant l&#39;incubation précédentes 2hr. </li><li> Ajouter 180μl de Pure ADNc de chaque échantillon, et bien mélanger par pipetage de haut en bas. Transférer les échantillons à un 96-même à fond rond assiette. </li><li> Continuer à mélanger les échantillons en agitant la plaque sur un agitateur orbital pendant au moins 2 minutes. </li><li> Déplacer la plaque à un support magnétique pour capturer les billes magnétiques. Laisser la plaque sur le stand pendant environ 6 minutes ou jusqu&#39;à ce que le mélange devient transparent et les perles à caractère contraignant ont granulés. </li><li> Aspirer délicatement le surnageant avec un aspirateur sans déranger les billes magnétiques. Sinon, retirez délicatement le surnageant avec une pipette et jeter le surnageant. </li><li> Retirer la plaque du socle magnétique. </li><li> Ajouter 150μl de tampon de lavage d&#39;ADNc dans chaque puits et agiter la plaque pendant 1 minute sur l&#39;agitateur orbital à vitesse modérée. Perles va se dispersent pas à cette étape, en raison de la faible tension de surface du tampon de lavage. </li><li> Déplacer la plaque à un support magnétique pour capturer les billes magnétiques. </li><li> Aspirer délicatement le surnageant avec un aspirateur sans déranger les billes magnétiques. Sinon, retirez délicatement le surnageant avec une pipette et jeter le surnageant. </li><li> Retirer la plaque du socle magnétique. </li><li> Répéter le lavage une 2 ème fois avec 150μl de tampon de lavage d&#39;ADNc. </li><li> Après le lavage 2 ème, sécher les perles en secouant la plaque pendant 2 minutes sur l&#39;agitateur orbital à la vitesse maximale. Ne pas trop sécher! </li><li> Éluer l&#39;ADNc à partir des billes en ajoutant 18μl de l&#39;préchauffé eau sans nucléase à chaque échantillon. </li><li> Secouez vigoureusement la plaque pendant 3 minutes sur l&#39;agitateur orbital, puis vérifiez que les billes magnétiques sont totalement dispersés. Sinon, continuez secouant. </li><li> Une fois que les billes magnétiques ont complètement dispersé, déplacer la plaque d&#39;un support magnétique pour capturer les billes magnétiques. </li><li> Soigneusement transfert de l&#39;ADNc élué (~ 16μl) d&#39;une nouvelle plaque PCR (ou tubes PCR). </li><li> Passez directement à l&#39;étape suivante, ou geler l&#39;ADNc à -20 ° C. </li></ol> Partie 3: transcription in vitro (IVT) <ol><li> Préparer le mélange maître IVT à température ambiante. (Tableau 3) </li><li> Délicatement la pipette du Master Mix ou à cran de se mélanger, et centrifuger brièvement. </li><li> Ajouter 24μl de chaque échantillon, et mélanger délicatement par aspiration et refoulement 3-4 fois. </li><li> Incuber à 37 ° C pendant 14 heures dans un thermocycleur, puis maintenez à 4 ° C jusqu&#39;au moment de l&#39;étape suivante. </li></ol> Partie 4: ARNa nettoyage après IVT <ol><li> Vortex les perles liaison à l&#39;ARN brièvement pour obtenir un mélange homogène avant utilisation. </li><li> Préparer le ARNa Mix reliure à température ambiante (tableau 4) Cela peut être fait à l&#39;avance -. Le mélange préparé contraignantes peuvent être stockés à température ambiante pendant jusqu&#39;à une semaine. </li><li> Mélangez bien au vortex. </li><li> Aliquoter le tampon d&#39;élution ARNa dans un tube de 1,5 ml et incuber à 50-60 ° C pendant au moins 10 minutes. </li><li> Ajouter 70μl de l&#39;ARNa mélange de liantà chaque échantillon et bien mélanger par pipetage haut et en bas de 3-4 fois. </li><li> Transférer les échantillons de la plaque PCR de 96 puits à fond rond assiette. </li><li> Ajouter 50 pl de 100% d&#39;isopropanol à chaque échantillon et bien mélanger par pipetage haut et en bas de 3-4 fois. </li><li> Secouez doucement la plaque sur un agitateur orbital pendant au moins 2 minutes pour bien mélanger les échantillons. </li><li> Déplacer la plaque à un support magnétique pour capturer les billes magnétiques. Laisser la plaque sur le stand jusqu&#39;à ce que le mélange devient transparent et les perles à caractère contraignant ont granulés. </li><li> Aspirer délicatement le surnageant avec un aspirateur sans déranger les billes magnétiques. Sinon, retirez délicatement le surnageant avec une pipette et jeter le surnageant. </li><li> Retirer la plaque du socle magnétique. </li><li> Ajouter 100 ul Solution Laver ARNa dans chaque puits et agiter la plaque pendant 1 minute sur l&#39;agitateur orbital à vitesse modérée. Perles peut pas entièrement se dispersent à cette étape. </li><li> Déplacer la plaque à un support magnétique pour capturer les billes magnétiques. </li><li> Aspirer délicatement le surnageant avec un aspirateur sans déranger les billes magnétiques. Sinon, retirez délicatement le surnageant avec une pipette et jeter le surnageant. </li><li> Retirer la plaque du socle magnétique. </li><li> Répétez le laver une fois 2 ème avec 100 ul Solution Laver ARNa. </li><li> Après le lavage 2 ème, sécher les perles en secouant la plaque pendant 1 minute sur l&#39;agitateur orbital à la vitesse maximale. Ne pas trop sécher les échantillons! </li><li> Eluer la ARNa des billes en ajoutant 40μl de tampon d&#39;élution préchauffé ARNa à chaque échantillon. </li><li> Secouez vigoureusement la plaque sur l&#39;agitateur orbital pendant 3 minutes, puis vérifiez que les billes magnétiques sont totalement dispersés. Sinon, continuez secouant. </li><li> Une fois que les billes magnétiques ont complètement dispersé, déplacer la plaque d&#39;un support magnétique pour capturer les billes magnétiques. Le surnageant contient les ARNa nettoyé aminés allyle incorporé. </li><li> Soigneusement transférer le ARNa élué à une nouvelle plaque PCR (ou tubes PCR). </li><li> (Étape facultative) Vérifiez la concentration en ARN des échantillons en mesurant 1.5μl sur un spectrophotomètre NanoDrop. </li><li> Immédiatement continuer sur la prochaine étape, ou de stocker l&#39;ARNa à -80 ° C. </li></ol> Tableau 1: Volet 1 er ADNc Synthèse Mix Master <table border="1" cellpadding="8"><tbody><tr><td> Réactifs </td><td> Montant pour une réaction </td></tr><tr><td> Tampon 10X First Strand </td><td> 2 pl </td></tr><tr><td> dNTP Mix </td><td> 4 pl </td></tr><tr><td> Inhibiteur de la ribonucléase </td><td> 1 pl </td></tr><tr><td> Script tableau </td><td> 1 pl </td></tr></tbody></table> Tableau 2: ADNc 2 ème volet Maître Synthèse Mix <table border="1" cellpadding="8"><tbody><tr><td> Réactifs </td><td> Montant pour une réaction </td></tr><tr><td> Eau sans nucléase </td><td> 63 ul </td></tr><tr><td> Tampon 10X deuxième brin </td><td> 10 ul </td></tr><tr><td> dNTP Mix </td><td> 4 pl </td></tr><tr><td> ADN polymérase </td><td> 2 pl </td></tr><tr><td> RNase H </td><td> 1 pl </td></tr></tbody></table> Tableau 3: IVT Mix Master <table border="1" cellpadding="8"><tbody><tr><td> Réactifs </td><td> Montant pour une réaction </td></tr><tr><td> aaUTP solution (75 mM) </td><td> 2 pl </td></tr><tr><td> ATP, CTP, GTP mélange (25 mM) </td><td> 12 ul </td></tr><tr><td> T7 UTP solution (75 mM) </td><td> 2 pl </td></tr><tr><td> Tampon de réaction 10X T7 </td><td> 4 pl </td></tr><tr><td> T7 Enzyme Mix </td><td> 4 pl </td></tr></tbody></table> Tableau 4: Mélanger ARNa reliure <table border="1" cellpadding="8"><tbody><tr><td> Réactifs </td><td> Montant pour une réaction </td></tr><tr><td> Perles liaison à l&#39;ARN * </td><td> 10 ul </td></tr><tr><td> * Remise en suspension de billes Solution </td><td> 4 pl </td></tr><tr><td> 100% d&#39;isopropanol ** </td><td> 6 pl </td></tr><tr><td> Concentré ARNa Binding Buffer </td><td> 50 ul </td></tr></tbody></table> * Mélanger les perles liaison à l&#39;ARN avec la solution resuspension premier talon. ** Ajouter l&#39;isopropanol et bien mélanger avant d&#39;ajouter le concentré de tampon de liaison ARNa.

<ol><li>Rubins, K. H., Hensley, L. E., Bell, G. W., Wang, C., Lefkowitz, E. J., Brown, P. O., Relman, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+analysis+of+viral+gene+expression+programs+during+poxvirus+infection%3A+a+transcriptional+map+of+the+vaccinia+and+monkeypox+genomes%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Comparative analysis of viral gene expression programs during poxvirus infection: a transcriptional map of the vaccinia and monkeypox genomes.</a> PLoS ONE. 3 (7), e2628-e2628 (2008).</li>
<li>Assarsson, E., Greenbaum, J. A., Sundström, M., Schaffer, L., Hammond, J. A., Pasquetto, V., Oseroff, C., Hendrickson, R. C., Lefkowitz, E. J., Tscharke, D. C., Sidney, J., Grey, H. M., Head, S. R., Peters, B., Sette, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kinetic+analysis+of+a+complete+poxvirus+transcriptome+reveals+an+immediate-early+class+of+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci%22%5BJournal%5D)">Kinetic analysis of a complete poxvirus transcriptome reveals an immediate-early class of genes.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. 105 (6), 2140-2145 (2008).</li>
<li>Satheshkumar, P. S., Moss, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Poxvirus+transcriptome+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Poxvirus transcriptome analysis.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, E62-E62 (2008).</li>
<li>Assarsson, E., Greenbaum, J. A., Sundström, M., Schaffer, L., Hammond, J. A., Pasquetto, V., Oseroff, C., Hendrickson, R. C., Lefkowitz, E. J., Tscharke, D. C., Sidney, J., Grey, H. M., Head, S. R., Peters, B., Sette, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A.+Reply+to+Satheshkumar+and+Moss%3A+Poxvirus+transcriptome+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">A. Reply to Satheshkumar and Moss: Poxvirus transcriptome analysis.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, E63-E64 (2008).</li>
<li>Guerra, S., López-Fernández, L. A., Pascual-Montano, A., Muñoz, M., Harshman, K., Esteban, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+gene+expression+survey+of+vaccinia+virus+infection+of+human+HeLa+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Cellular gene expression survey of vaccinia virus infection of human HeLa cells.</a> J Virol. 77 (11), 6493-6506 (2003).</li>
<li>Guerra, S., López-Fernández, L. A., Conde, R., Pascual-Montano, A., Harshman, K., Esteban, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microarray+analysis+reveals+characteristic+changes+of+host+cell+gene+expression+in+response+to+attenuated+modified+vaccinia+virus+Ankara+infection+of+human+HeLa+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Microarray analysis reveals characteristic changes of host cell gene expression in response to attenuated modified vaccinia virus Ankara infection of human HeLa cells.</a> J Virol. 78 (11), 5820-5824 (2004).</li>
<li>Guerra, S., López-Fernández, L. A., Pascual-Montano, A., Nájera, J. L., Zaballos, A., Esteban, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Host+response+to+the+attenuated+poxvirus+vector+NYVAC%3A+upregulation+of+apoptotic+genes+and+NF-kappaB-responsive+genes+in+infected+HeLa+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Host response to the attenuated poxvirus vector NYVAC: upregulation of apoptotic genes and NF-kappaB-responsive genes in infected HeLa cells.</a> J Virol. 80 (2), 985-998 (2006).</li>
<li>Guerra, S., Nájera, J. L., González, J. M., López-Fernández, L. A., Climent, N., Gatell, J. M., Gallart, T., Esteban, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+gene+expression+profiling+after+infection+of+immature+human+monocyte-derived+dendritic+cells+by+the+attenuated+poxvirus+vectors+MVA+and+NYVAC%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Distinct gene expression profiling after infection of immature human monocyte-derived dendritic cells by the attenuated poxvirus vectors MVA and NYVAC.</a> 81 (16), 8707-8721 (2007).</li>
</ol>

Les auteurs n'ont rien à divulguer.

Étapes critiques Un second tour de l&#39;amplification n&#39;est pas conseillé que des biais dans les données array ont été observées. Mélanger soigneusement à chaque étape enzymatique (1 er et 2 ème synthèse brin d&#39;ADNc, IVT) est essentielle à l&#39;obtention de rendements d&#39;amplification bon, tout comme l&#39;incubation de chaque étape enzymatique à la température appropriée. Un cycleur PCR avec couvercle chauffant réglable est préféré - les écarts, même aussi p...

<table><tbody><tr><td>Kit d'amplification d'ARNm Amino Allyl MessageAmp II</td><td>Réactif</td><td>Applied Biosystems</td><td>AM1753</td><td>Pour 20 réactions</td></tr><tr><td>Kit d'amplification d'ARNm Amino Allyl MessageAmp II</td><td>Réactif</td><td>Applied Biosystems</td><td>AM1821</td><td>Pour 100 réactions, au format 96 puits</td></tr><tr><td>Spectrophotomètre UV-VIS NanoDrop ND-1000</td><td>Autre</td><td>NanoDrop</td><td>ND-1000</td><td>Ou spectrophotomètre équivalent</td></tr></tbody></table>

infection virus de la vaccine et l&#39;analyse temporelle de l&#39;expression des gènes de virus: partie 2

Vaccinia Virus Infection &amp; Temporal Analysis of Virus Gene Expression: Part 2

La famille<em&gt; Poxviridae</em&gt; Se compose de grandes double-brin d&#39;ADN contenant des virus qui se répliquent exclusivement dans le cytoplasme des cellules infectées. Les membres de la<em&gt; Orthopoxvirus</em&gt; Genre comprennent la variole, l&#39;agent causal de la variole humaine, simienne, et la vaccine (ACC), le membre prototypique de la famille des virus. Dans le génome relativement importante (~ 200 ko) de la vaccine, trois classes de gènes sont encodés: précoce, intermédiaire et tardive. Alors que tous les trois classes sont transcrits par les ARN polymérases virale codée, chaque classe a une fonction différente dans le cycle de vie du virus. Les poxvirus utilisent de multiples stratégies pour la modulation de l&#39;environnement cellulaire de l&#39;hôte pendant l&#39;infection. Afin de comprendre la régulation de l&#39;hôte et l&#39;expression des gènes du virus, nous avons utilisé l&#39;échelle du génome des approches pour analyser l&#39;abondance transcription de deux virus et les cellules hôtes. Ici, nous démontrons infections cours du temps des cellules HeLa par le virus de la vaccine et de l&#39;ARN d&#39;échantillonnage à différents moments après l&#39;infection. Les deux hôtes et virales ARN total est isolé et amplifié pour que l&#39;hybridation des puces pour l&#39;analyse de l&#39;expression génique.

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La famille des Poxviridae se compose de virus à ADN double brin de grande taille qui se répliquent exclusivement dans le cytoplasme des cellules infectées. Les membres de...

Bonjour, je suis Judy Yen du laboratoire de Kate Rubins à l'Institut Whitehead pour la recherche biomédicale. Après avoir infecté des cellules HeLa avec le virus de la vaccine et isolé l'ARN total, comme indiqué dans un protocole vidéo JoVE précédent, l'ARN viral peut être isolé et amplifié par transcription inverse et transcription in vitro. L'ARN amplifié sera ensuite utilisé dans une analyse par puces à ADN de l'expression des gènes viraux et de l'hôte. Commençons donc.Pour commencer cette synthèse d'ADNc à partir de l'ARN, ajoutez le volume recommandé d'éthanol à cent pour cent aux tampons de lavage avant d'utiliser le kit ambient amino allele message AMP deux dans un tube de réaction PCR. Ajoutez entre 100 nanogrammes et cinq microgrammes d'ARN total et un microlitre d'amorce oligo T sept. Ajustez le volume à 12 microlitres avec de l'eau sans nucléase. Incubez les échantillons à 70 degrés Celsius pendant 10 minutes dans un thermocycleur.Ensuite, retirez les échantillons d'ARN du centrifugeuse à 70 degrés Celsius. Brièvement, après la centrifugation, placez les échantillons sur de la glace. Préparez le mélange maître de synthèse du brin complémentaire avec un excès de volume de

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