Name: قياس إيماس في الخلايا العصبية عن طريق وصفها وزير الخارجية (فيديو) | JoVE Journal
Uploaded: 2006-11-30T00:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 56 s
Description: اكتشف قياس إيماس الحويصلات في الخلايا العصبية الحصينية باستخدام صبغة FM 4-64 والتصوير الزمني الحقيقي. تساعد هذه الطريقة الباحثين على فهم آليات النقل العصبي وحركيات الإفراج الحويصلي.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

الخلايا : الجرذ (أو الماوس) الابتدائي الثقافات العصبية قرن آمون (14-28 يوما في المختبر). تنبيه : الكهربائية ، وتسليمها عبر أقطاب البلاتين اثنين ؛ 70-90 بالسيارات المجهري : 60x عدسة المجهر النفط على اتفاقية مكافحة التصحر مقلوب الفلورسنت. البرنامج : Slidebook (التصوير الذكي الابتكارات ، وسانتا مونيكا ، كاليفورنيا) انظر الصفحة أساليب تكميلية لمزيد من التفاصيل <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الحارة HEPES - مخزنة المالحة (HBS) إلى درجة حرارة الغرفة. إضافة الغلوتامات مضادات مستقبلات APV (50 ميكرومتر تركيز النهائي) وCNQX (10 ميكرومتر النهائي). كل تجربة FM يتطلب عادة 20-30 مل HBS. تركيز للعمل من 10 ميكرومتر FM 4-64 (المسابر الجزيئية) ، تمييع الحل في الأسهم 1:1000 HBS (مع الخصوم المضافة). 2 مل جعل FM soln لكل تجربة. الحل مع تغطية احباط لمنع التعرض للضوء. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحميل ساترة تحتوي على الخلايا العصبية على الغرفة الكهربائي. تأكد من أن وسائل الإعلام في الغرفة مع مستوى أعلى من غرفة ويغطي تماما الأقطاب. إزالة أي حل الزائدة من أسفل ساترة. إضافة إلى النفط العدسة (اذا كنت تستخدم عدسة النفط). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد جهاز نضح. شطف الأولى مع قليل من كل مل بعد بالترتيب معينة (يسمح لكل موضوعي ودقيق قبل إضافة المقبل) : الماء ، والإيثانول ، والمياه ، ثم HBS. إضافة المقبل HBS (حفظ مل قليلة لإضافة باليد في الخطوات المستقبلية) وإغلاق الارواء. إعداد منفذ نضح والشفط على طرفي نقيض في حواف ساترة. فمن الأفضل إذا كان منفذ نضح تصل الى غرفة ، حيث كما يجب أن يبني الشفط في أعلى جدا. في حين اضاف HBS (إما عن طريق رذاذ أو باليد) ، افتح الشفط وتعديل موقفها بحيث يحافظ على وسائل الإعلام على مستوى الحق فقط تغطي تماما الأقطاب. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ابحث عن منطقة تقع على ساترة كنت ترغب في صورة ومحاولة جمع ما يقرب من ذلك في التركيز. المناطق المثلى تحتوي المشابك كثيرة ، ولكن لا ينبغي أن يكون كثيفا جدا بحيث تصبح العمليات الفردية تمييزه. وينبغي أن يكون هناك أي إلى الحد الأدنى من أجسام الخلايا والأغشية غريبة (مثل كتل من الخلايا النجمية) ، أو مواد غير محددة أخرى (مثل الوبر). قد صبغ FM التقيد بهذه nonspecifically. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام &quot;مجموعة العمل&quot; المكعب تصفية (الذي يثير مع ضوء أخضر وأحمر يجمع إلى أبعد من انبعاثات الحمراء). تعيين &quot;تفضيلات التقاط&quot; Slideview لتسليم 900 AP في 10Hz عند ظهور صورة (تستخدم عادة 300-900 نقاط وصول لهذا التحفيز التحميل) 0. في إطار الصورة ، وحدد &quot;fluo - VIS الحمراء&quot; ضبط الوقت وتغيير فلتر التعرض إلى 100 مللي ثانية. إيقاف أية إعدادات timelapse موجودة من قبل. لا تأخذ أي صور حتى تكون على استعداد لبدء التحفيز. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تأكد من الشفط على / فتح. إضافة بسرعة soln FM (2 مل) إلى غرفة في الطرف المقابل من الشفط. اضغط على الفور ما يرام في إطار الصورة لالتقاط صورة ويبدأ التشويق. انتظر 30-45 ثانية بعد التحفيز ثم يغسل بسرعة FM بإضافة ~ 2 مل من HBS (أفعل ذلك من خلال جنب مع ماصة ، ولكن يمكن أيضا أن يتم ذلك بواسطة التروية). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> غسل FM مع HBS عبر نضح لمدة 10 دقائق ~. وينبغي أن يكون معدل تدفق 1-1،5 مل / دقيقة. أثناء هذه الخطوة غسل تغيير تفضيلات التحفيز بحيث يبدأ ظهور التحفيز @ صورة 10 (تستخدم عادة 900-1200 نقاط وصول @ 10 هرتز لهذا التحفيز destaining). حوالي 7 دقائق في الغسيل ، وتحقق مضاعفة التفضيلات (بداية من الحوافز في صورة 10). تستخدم الآن في إطار التركيز الصغيرة اختيار وتركيز دون الإقليمية. تأكد بأنه قد تم تغيير إعدادات التنبيه قبل الشروع في الخطوة التالية. التقاط صورة واحدة لمعرفة ما اذا كانت تغسل كاملة (وينبغي أن نقاط الاشتباك العصبي punctated الفردية بشكل واضح). إن لم يكن ، وزيادة معدل تدفق an 0.5mL/min إضافية ، وانتظر دقيقة أخرى 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يغسل مرة واحدة كاملة ، وضبط الوقت والتعرض اللازمة لاستقبال ما زالت جيدة ، إشارة واضحة (وعادة ما بين 5-10 مرات. التعرض مللي ينبغي التقليل بسبب photobleaching السريع للFM). ثم تعيين تفضيلات timelapse على اتخاذ الصور 38 كل 5 ثوان. التحقق من نضح لجعل هناك ما يكفي من HBS لمدة 5 دقائق ، ومغادرة نضح المتدفقة. بدء timelapse لبدء destaining. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد يزيل اللون ، أو تغيير إعدادات التحفيز لتقديم AP 1200 @ 10Hz (1200-2000 عادة تستخدم نقاط وصول لهذه الخطوة النهائية) على صورة 0. إيقاف الإعدادات timelapse واتخاذ صورة واحدة لبدء التحفيز. يجب أن تكون لا تزال تتدفق نضح هذه الخطوة سوف تساعد على إزالة أي صبغة المتبقية FM الحويصلي ، من أجل تحديد خط الأساس / &quot;مجموع نشره&quot; مضان. بعد الانتهاء من التحفيز ، إيقاف الإعدادات التحفيز ، وجعل المنطقة في التركيز. إغلاق نضح والشفطوبعد ذلك يأخذ صورتين الأساس النهائي. يمكن اتخاذها سواء لوحات واحد أو Z - كومة صور (0.5 ميكرومتر الخطوات). Z - المداخن هي مفيدة في حال كان هناك تحول في الطائرة من التركيز أثناء التجربة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يتم تجربتك FM. إذا كان القيام على الفور المزيد من التجارب ، يجب تنظيف العدسة وبين كل غرفة المحاكمة ، ولكن جهاز نضح لا يلزم أن يكون تنظيفها حتى بعد التجربة النهائية. شطف الجهاز بالكامل مع الماء ، ثم الايثانول. </li></ol>

<ol><li>Betz, W. J., Bewick, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+analysis+of+synaptic+vesicle+recycling+at+the+frog+neuromuscular+junction%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Optical analysis of synaptic vesicle recycling at the frog neuromuscular junction.</a> Science. 255, 200-203 (1992).</li>
</ol>

ليس لدى المؤلفين أي تضاربات مصالح للإفصاح عنها.

وإمكانات العمل 300 (APS) كافية لإحداث ما لا يقل عن جولة واحدة من إعادة تدوير الحويصلة ، حافزا التحميل من 300 نقاط وصول ، أو تعطى غالبا ما تكون أكثر لتسمية تجمع تدوير الحويصلات. على الرغم من المحفزات تحميل أكثر كثافة ، مثل 900 كالة الأنباء الجزائرية ، قد تسمح لعدد رمزي من الحويصلات إضافية ليكون المسمى ، وهذا يزيد أيضا من مقدار الوقت الصبغة يمكن تضمينها في الأغشية خارج الخلية ، مما يؤدي إلى مزيد من تلطيخ غير محددة. لقد وجدت هذه الخطوة ستكون حاسمة لغسل لضمان destaining المناسبة. من المهم أن يروي مع معدل ...

<table><tbody><tr><td>بروتين مصفوفة الـ APV</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A5282</td><td></td></tr><tr><td>FM 4-64</td><td>المجسات الجزيئية، Life Technologies</td><td>T-3166</td><td></td></tr><tr><td>ملح ثنائي صوديوم CNQX</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C-239</td><td></td></tr></tbody></table>

قياس إيماس في الخلايا العصبية عن طريق وصفها وزير الخارجية

Measuring Exocytosis in Neurons Using FM Labeling

يمكن أن القدرة على قياس حركية الافراج حويصلة تساعد على توفير نظرة ثاقبة بعض أساسيات العصبي. المستخدمة هنا فإننا في الوقت الحقيقي التصوير من الحويصلات المسمى مع صبغة FM لرصد معدل الافراج قبل المشبكي حويصلة. FM4 - 64 هو صبغ أحمر فلوري amphiphilic styryl أن يضمن في أغشية الحويصلات متشابك كما هو حفز الإلتقام. التفاعلات محبة للدهون يؤدي إلى زيادة صبغ كثيرا في مضان مما يؤدي إلى انبعاث إشارة ساطعة عندما يرتبط مع حويصلات واحد عندما الاسمية في السائل خارج الخلية. يستخدم بعد خطوة للمساعدة على إزالة غسل الصبغة الخارجية داخل غشاء البلازما ، ويتركز وزير الخارجية المتبقية داخل الحويصلات وطرد بعد ذلك عندما يتم بفعل إيماس جولة أخرى من التحفيز الكهربائي. يقاس معدل الإفراج الحويصلات الناتجة عن انخفاض في مضان. منذ يمكن تطبيقها FM الصبغة الخارجية وعابر ، بل هو أداة مفيدة لتحديد معدلات إيماس الثقافات في الخلايا العصبية ، وخصوصا عندما تقارن بين معدلات ونقاط الاشتباك العصبي transfected حبات السيطرة المجاورة.

يمكن أن القدرة على قياس حركية الافراج حويصلة تساعد على توفير نظرة ثاقبة بعض أساسيات العصبي. المستخدمة هنا فإننا في الوقت الحقيقي التصوير من الحويصلات المسمى مع وزير الخارجية صبغ أحمر فلوري 4-64 لقياس معدل الافراج قبل المشبكي حويصلة في الثقافات العصبية الحصين.

يمكن أن تساعد القدرة على قياس حركية تحرر الحويصلات في توفير رؤى حول بعض أساسيات النقل العصبي. لقد استخدمنا هنا...

أنا جيمي لين، طالب دراسات عليا في برنامج البيولوجيا الجزيئية والخلوية في جامعة هارفارد. أعمل حالياً في مختبر ميرفي، حيث نقوم بدراسة الخلايا العصبية في الحصين في المختبر.سأقوم الآن بموافاتكم بكيفية إجراء تجارب FM-d. والآن سنشرع في تثبيت غطاء الشريحة الذي يحتوي على العصبونات في هذه الحجرة المصنعة خصيصاً. مجهرنا هو مجهر مقلوب مزود بـ CCD، وتأكد من تجفيف الجزء السفلي تماماً.لا تقم بتوصيل الأقطاب الكهربائية الآن. لقد تم إعداد نظام التروية. سأضعه عند أحد طرفي الغرفة.نستخدم الصلصال من أجل التثبيت. سيقوم القائمون على تجارب HBS بإضافة كل ذلك، ومن ثم يتم إعداد عملية الاندماج.يمكنك استخدام الصلصال لتثبيت هذا في مكانه، وأعتقد أن يكون بهذا الشكل الذي يحتوي على أجسام خلوية لأن أغشية الأجسام الخلوية ستمتص الكثير من الصبغة وتكون واضحة جداً في المشابك العصبية. ربما في منطقة مجاورة مثل هنا حيث كانت هذه المنطقة هي التي بدأت منها مباشرة ونحن مستمرون. ومن ثم، يتم التبييض الضوئي الأولي من الصور العشر الأولى.وهنا نبدأ، أنا جميل نيوتن، طالب دراسات عليا في برنامج البيولوجيا الجزيئية هنا في جامعة هارفارد. وأعمل حالياً في مختبر لعلوم الأعصاب تحت إشراف الدكتورة فينكي ميرفي بصفتها الباحث الرئيسي.وموضوع حديثي معكم اليوم هو إجراء تجارب FM. وما هو الهدف من تجربتكم؟ والميزة في FM هي أنه صبغة فلورية تتيح لنا تتبع حركية الإخراج الخلوي.لذا، نتحقق أولاً من أن الصبغة قد تم امتصاصها داخل التشابك العصبي عن طريق تقديم محفز تحميل. وبعد فترة غسيل، نقدم محفز إزالة التحميل الذي يتم من خلاله تحرير الصبغة من الحويصلات. هل تعمل على نوع محدد من الخلايا العصبية؟وبناءً على ذلك، نستخدم هذه الطريقة في مختبرنا مع العصبونات الحصينية، ونطبقها على العصبونات المستزرعة بدلاً من استخدام تحليل الخلايا. ما هي المشكلات المحتملة في هذه التجربة؟ ومن بين المشكلات الشائعة، نستخدم المحاكاة الكهربائية.في بعض الأحيان سابقاً، ولأسباب مختلفة، واجهنا مشكلات في تشغيل المحاكاة الكهربائية. وأعلم أن مختبرات أخرى تستخدم أيضاً محلول البوتاسيوم عالي التركيز. لذا، يمكن أن يكون محلول البوتاسيوم عالي التركيز بديلاً جيداً لاستخدام التحفيز الكهربائي في حال وجود مشكلات في ذلك.كذلك، وبشكل عام، لأي سبب كان خلال خطوة الغسيل، يبدو أنك لا تحصل على تحرر كافٍ من الصبغ غير النوعي. وقد وجدت غالباً أن مجرد زيادة معدل التدفق، وبدلاً من استخدام 0.5 ml، يتم استخدام 1.5 ml في الدقيقة، وعن طريق زيادة مدة الغسيل من خمس دقائق إلى 10 دقائق، تتحسن النتائج بشكل كبير. ما هي التطبيقات الممكنة لهذه التجربة؟ما الذي ترغب في دراسته فعلياً؟ حسناً، يمكنك استخدام هذه الطريقة لاختبار الخلايا الضابطة مقابل خلايا تم تعديلها بطريقة ما. فعلى سبيل المثال، يمكنك استخدام سلالات مختلفة من الفئران لمعرفة ما إذا كانت حركية الإطلاق مختلفة، أو يمكنك معرفة ما إذا كان إضافة عقار معين يؤثر فعلياً على عملية الإفراز الخلوي.شكراً لك.

measuring-exocytosis-in-neurons-using-fm-labeling

Research

JoVE Journal

Biology

علم الأحياء

وسائل جديدة لقياس العصبي الدوبامين بصريا باستخدام النظير الفلورسنت.

متصور النسخة الدوبامين في محطات قبل المشبكي فردية مع FFNs

ووصفت العيش تقنية التصوير مضان لقياس التجديد وتعبئة حويصلة متشابك محددة (SV) مجمعات في المحطات العصبية المركزية. ويتم رصد جولتين من إعادة التدوير في محطات SV العصب نفسه توفير الرقابة الداخلية.

تحليل كمي متشابك الحويصلة التجديد حمام سباحة في الخلايا العصبية مثقف الحبيبية للدماغ باستخدام الأصباغ FM

النقل إلى الوراء من صبغة الفلورسنت تسميات فرعية السكان من الخلايا العصبية على أساس إسقاط التشريحية. المحاور صفت يمكن استهداف...

الفلورسنت وصفها الوراء يسمح لخارج الخلية المستهدفة واحدة وحدة التسجيل من الخلايا العصبية التي تم تحديدها<em&gt; في الجسم الحي</em

&lt; p class = "jove_content"&gt; في هذا الفيديو ، ذبابة الفاكهة تغمر الألياف العصبية في صبغة FM ، التي ترتبط بدهون غشاء الخلية. يحفز قطب الشفط الدقيق والنبضات الكهربائية عملية الالتقام الخلوي ، ويدمج صبغة FM في حويصلات داخلية مشكلة حديثا. هذه الطريقة ، التي تصور مراحل ما قبل المشبكي للنقل العصبي ، مفيدة لدراسة الوظيفة المشبكية وإطلاق الناقل العصبي.

تحميل وتفريغ صبغة FM بوساطة القطب الكهربائي الدقيق في ذبابة الفاكهة الخلايا العصبية

وصفنا استخدام الأصباغ styryl FM لإعادة تدوير الصورة حويصلة متشابك في النهايات العصبية الوظيفية. هذا البروتوكول يمكن تطبيقها ليس فقط إلى أثار، ولكن أيضا عفوية والأنشطة متشابك مصغرة. بروتوكول يوسع متنوعة من الأحداث متشابك التي يمكن تقييمها على نحو فعال.

فحص متشابك الحويصلة عن طريق إعادة تدوير الأصباغ FM خلال مستدعى، العفوي، والأنشطة متشابك مصغرة

توفر هذه الورقة طريقة للتحقيق في ديناميكيات حويصلات الناقل العصبي في خلايا الورم الأرومي العصبي ، باستخدام بناء synaptobrevin2-pHluorin والفحص المجهري الفلوري للانعكاس الداخلي الكلي. كما يتم الإبلاغ عن الاستراتيجية التي تم تطويرها لمعالجة الصور وتحليل البيانات.

TIRFM والحساسة للدرجة الحموضة GFP-تحقيقات في تقييم ناقل عصبي الحويصلة حيوية في خلايا SH-SY5Y العصبية: التصوير خلية وتحليل البيانات

هنا نصف إعدادا جديدا لتصوير المحطات الحسية الرمحية الحية لنهايات الحاجز التي تغذي بصيلات شعر جلد الأذن الفأر أثناء التلوين وإزالة البقع بأصباغ الستايريل بيريدينيوم.

رصد بصري الأعصاب الطرفية المعيشة وصفها في الشعر المسام سناني الشكل النهايات لل<em&gt; فيفو السابقين</em&gt; ماوس الأذن الجلد

تم الكشف عن الالتقام حويصلة متشابك الخفيفة الميكروسكوب من فلورين تنصهر مع البروتين حويصلة متشابك والمجهر الإلكتروني لامتصاص حويصلة.

قياس الالتقام حويصلة متشابك في الخلايا العصبية هيبوكامبال مثقف

وحدة التخزين معلمة هامة فيما يتعلق بالخصائص الفسيولوجية والمرضية للخلايا. يصف لنا طريقة استبعاد فلورسنت السماح الكامل-ميدان قياس حجم الخلايا العصبية في المختبر مع القرار المحوري مكرمترك الفرعية المطلوبة لتحليل نيوريتيس والهياكل الحيوية ضمناً في نمو الخلايا العصبية.

عالية الدقة حجم التصوير من الخلايا العصبية باستبعاد استخدام Fluorescence الأسلوب وكرست أجهزة موائع جزيئية

حويصلة متشابك (SV) ركوب الدراجات هو الآلية الأساسية للاتصالات بين الخلايا في نهايات الخلايا العصبية. امتصاص صبغ FM وإطلاق سراح هي الوسيلة الأساسية للمعايرة الكمية SV إندو-والرقابة. هنا، نحن نقارن جميع أساليب التحفيز محرك FM1-43 ركوب الدراجات في المشبك نموذج الوصلات العصبية العضلية (NMJ) المورفولوجية .

صبغ FM ركوب الدراجات في المشبك: مقارنة Depolarization البوتاسيوم عالية، الكهربائية وتحفيز تشانيلرهودوبسين

اكتشف قياس إيماس الحويصلات في الخلايا العصبية الحصينية باستخدام صبغة FM 4-64 والتصوير الزمني الحقيقي. تساعد هذه الطريقة الباحثين على فهم آليات النقل العصبي وحركيات الإفراج الحويصلي.

قياس إيماس في الخلايا العصبية عن طريق وصفها وزير الخارجية

استكشف المزيد من الفيديوهات