Name: 공촛점 현미경으로 Zebrafish 배아 뇌 영상 라이브 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-04-01T00:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 11 s
Description: 배우세요 공촛점 현미경을 이용한 제브라피시 배아 뇌의 단일세포 해상도 라이브 영상 기법입니다. mRNA 주입과 마운팅 방법을 통해 척추동물 뇌 형태발생을 연구할 수 있습니다.

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처음 Sive 연구실에서이 기술을 개발 박사 제니퍼 구츠맨 많은 감사드립니다. 친절 플라스미드 인코딩 CAAX - GFP의 mRNA를 제공 데이나 파버 암 연구소 - 보스턴, MA에서도 JB 그린 감사합니다. 공촛점 이미지는 화이트 헤드의 WM 켁 재단 생물 이미징 시설에서 실시되었다. HS는 NIHMH70926에 의해 지원됩니다. EG는 NSF 미리 박사 친교에 의해 지원됩니다.

1. 사출에 대한 mRNA 준비 <ol><li> 이 절차에 사용되는 mRNA는 플라스미드 인코딩 CAAX - eGFP (memGFP) mRNA에서 베꼈는데 있습니다. 먼저 플라스미드는 구츠맨 외, 2008에 따라 linearize. </li><li> 다음 mMessage mMachine 키트를 사용 memGFP mRNA를 고쳐 쓰다. </li><li> -80에서 결과 1μg/μl으로 mRNA, 나누어지는 및 상점을 희석 ° C. </li><li> 한 세포 단계에서 배아 차선의 넓이와 1퍼센트 아가로 오스의 사출 금형을 준비합니다. </li><li> 주사 전날에, 여성에서 남성을 분리 교배 새장을 설정합니다. </li><li> 주사 당일, 주사를 준비하는 micropipette의 풀러를 사용하여 모세 바늘을 가져옵니다. </li></ol> 2. mRNA를 주입 <ol><li> 주사 당일, 얼음 1μg/μl의 memGFP의 mRNA의 나누어지는를 녹여. </li><li> 200ng/μl의 최종 농도로 물에 mRNA 1:5 희석, 얼음 계속. </li><li> 200ng/μl에서 준비 memGFP의 mRNA의 1μl와 모세관 바늘을로드합니다. </li><li> 장소는 가스 공급 microinjector에 연결된 micromanipulator에 바늘을로드. </li><li> 1nl로 사출 볼륨을 조정합니다. </li><li> 전날부터 짝짓기 새장에 설치된 야생 종류의 물고기에 디바이더를 당겨. </li><li> 즉시 그들이 낳은 그대로 배아를 수집합니다. 동양들을 멀리 micromanipulator의 측면에 하나의 세포로 배아 매체 (웨스 터, 1995)이 적용 아가로 오스의 사출 금형 인치 </li><li> chorion을 통해 삽입하여 mRNA가 하나의 세포에 직접 입금됩니다 그러한 노른자. 실험 당 약 50 배아를 주사. 세포가 나뉘어져있다면 삽입하지 마십시오. </li><li> 28 ° C 야간 배아 매체 품어 배아 </li></ol> 3. 마운트 및 이미징 태아 <ol><li> 배아를 마운트 및 이미지하려면, 관심있는 시점 전에 stereomicroscope 일시간 아래의 배아에서 집게로 chorion를 제거합니다. </li><li> 4 배아까지 장착을위한 슬라이드를 준비합니다. <ul><li> 직경이 약 1cm 구멍 특별히 고안된 2mm 두께의 플라스틱 슬라이드의 아래쪽에 coverslip을 봉인하기 위해 실리콘 진공 그리스를 사용합니다. </li><li> 0.7 % 아가로 오스와 슬라이드에 구멍을 채우기하고, 약 20 분 또는 강화된 때까지 대기하게 </li><li> 아가로 오스가 확정되면, 각각의 배아를 탑재하는 원통형 구멍을 형성 200μl 피펫 팁을 사용하여 작은 플러그를 제거합니다. </li></ul></li><li> 해부 현미경 아가로 오스 - 채워진 슬라이드에서 배아를 놓습니다. 배아를 마취하기 전에 tricaine의 50μl (웨스 터, 1995)를 추가합니다. </li><li> 기본 coverslip에 대한 뇌 또는 관심 영역으로 아가로 오스의 원통형 구멍에있는 배아를 위치 집게를 사용하십시오. </li><li> 실리콘 진공 그리스와 보안 다른 coverslip으로 아가로 오스의 배아를 커버. </li><li> 이미지를 사용하여 배아 거꾸로, 형광등, 레이저 - 스캔 또는 디스크 공촛점 현미경을 회전. 63x 또는 neuroepithelium 내에서 단일 세포의 고해상도 이미지를 수집하기 위해 높은에서 이미지. </li><li> 이미지는 LSM 소프트웨어에서 TIFF 파일 등 수출과 포토샵을 사용하여 분석하고 있습니다. </li></ol> 4. 대표 결과 / 결과 midbrain 및 hindbrain의 심실 사이에 24 HPF의 zebrafish의 neuroepithelium 대표 공촛점 이미지는 그림 1에 표시됩니다. 각 세포는 세포막 - 바운드 GFP와 함께 표시됩니다. <img src="/files/ftp_upload/1217/1217fig1.jpg" alt="" width="450" height="449"> 그림 1. memGFP - 주입 24 HPF의 zebrafish 배아의 공촛점 이미지를 살고 있습니다. GFP에 의해 명시된 각 셀에있는 24 HPF의 배아의 (A) Neuroepithelium. 지역 몇 군데는 midbrain - hindbrain 경계를 형성, midbrain 및 hindbrain의 심실 (M, H 각각)을 분리합니다.

<ol><li>Gutzman, J. H., Graeden, E., Sive, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Formation+of+the+zebrafish+midbrain-hindbrain+boundary+constriction+requires+laminin-dependent+basal+constriction%5BTitle%5D)+AND+%22Mech+Dev%22%5BJournal%5D)">Formation of the zebrafish midbrain-hindbrain boundary constriction requires laminin-dependent basal constriction.</a> Mech Dev. 125 (974), 11-12 (2008).</li>
<li>Westerfield, M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWesterfield%2C+M+%22The+Zebrafish+Book%3A+a+Guide+for+the+Laboratory+Use+of+Zebrafish%22">The Zebrafish Book: a Guide for the Laboratory Use of Zebrafish</a>. , University of Oregon Press. Eugene, Oregon. (1995).</li>
</ol>

이 비디오에서는, 우리는 단세포 zebrafish의 배아에 mRNA 분사하는 방법을 보여줍니다. 여기서는 각 셀에 레이블을 막 타겟 GFP를 인코딩 mRNA를 사용합니다. 그러면 단일 셀 해상도에서 개발 두뇌를 마운트 및 이미지하는 방법을 보여줍니다. 이 기술은 우리가 midbrain - hindbrain 경계의 형성 (구츠맨 외, 2008)에 필요한 세포 모양의 변화의 소설 유형, 기초 수축을 공부하고있었습니다. 다른 현상과 마찬가지로 분석을 크게 척추 morphogenesis 및 기본 세포 생물학에 대한 우리의 이해를 확장 가능성이있다.

<table><tbody><tr><td>SeaKem GTG agarose</td><td> 시약</td><td>Lonza Inc.</td><td>50027</td><td></td></tr><tr><td>3-아미노벤조산 에틸 에스테르 (Tricaine)</td><td>시약</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A-5040</td><td></td></tr><tr><td>모세관 튜브</td><td>도구</td><td>Frederick Haer and Co.</td><td>30-30-1</td><td>Borosil 외경 1.0mm x 내경 0.5mm/섬유 100mm</td></tr><tr><td>실리콘 진공 그리스</td><td>시약</td><td>VWR international</td><td>W0S717</td><td></td></tr><tr><td>포셉</td><td>도구</td><td>Fine Science Tools</td><td>11232-20</td><td>Dumont #5 Bio Inox</td></tr><tr><td>1-200 &amp;mu;피펫 팁</td><td>도구</td><td>USA Scientific, Inc.</td><td>111-0806</td><td>이 크기는 수정 후 24시간(24 hpf) 된 배아에 적합한 크기입니다. </td></tr><tr><td>mMessage mMachine 전사 키트</td><td>시약</td><td>Ambion</td><td>AM1340</td><td>SP6 RNA 중합효소</td></tr><tr><td>Zeiss LSM 510 스캐닝 공초점 현미경 </td><td>현미경</td><td>Carl Zeiss, Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>마이크로매니퓰레이터</td><td>도구</td><td>Narishige International</td><td></td><td></td></tr><tr><td>마이크로인젝터</td><td>도구</td><td>Harvard Apparatus</td><td>PLI-100</td><td></td></tr><tr><td>마이크로피펫 풀러</td><td>도구</td><td>Sutter Instrument Co.</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

공촛점 현미경으로 zebrafish 배아 뇌 영상 라이브

Live Imaging of the Zebrafish Embryonic Brain by Confocal Microscopy

이 비디오에서는, 우리는 우리의 실험실은 개발 zebrafish의 두뇌 (구츠맨 외, 2008)를 구부, 접이식하는 데 필요한 세포 모양 변경 및 rearrangements을 분석하기 위해 개발한 방법을 보여줍니다. 이러한 분석은 척추 두뇌의 3D 구조의 개발에 필요한 기본 세포 생물학의 새로운 이해를 내실수하고, 크게 신경 튜브 morphogenesis를 공부하는 능력을 증가시킵니다. 배아 zebrafish 두뇌는 neuroepithelium가 급증 내에 심실로 18시간 포스트 수정 (HPF)에서 시작 모양이다. 24 HPF으로 신경 튜브 morphogenesis의 초기 단계를 완료합니다. 방법을 사용하면 여기에 설명 한 세포 단계에서 배아는 mRNA 인코딩 막 타겟 녹색 형광 단백질 (memGFP)로 주입됩니다. 주입과 부화, 배아, 18 사이의 24 HPF 후, 아가로 오스에 거꾸로, 장착하고 공촛점 현미경으로 몇 군데. 특히, zebrafish 배아는 형광 이미징을위한 이상적인 시스템을 만들어 투명합니다. 우리의 분석은 midbrain - hindbrain 경계와 hindbrain에 초점을 가지고 있지만,이 방법은 80-100 μm의 깊이에 zebrafish에서 지역의 분석을 위해 연장 수 있습니다.

이 비디오에서는, 우리는 공촛점 현미경으로 단세포 해상도 라이브 zebrafish의 배아에서 개발 척추 두뇌를 분석하는 방법을 보여줍니다. 이것은 우리가 단일 셀 zebrafish 배아를 주입하고 이후 개발 두뇌를 마운트와 이미지하는 방법을 포함합니다.

공촛점 현미경으로 Zebrafish 배아 뇌 영상 라이브

본 영상에서는 ...를 구부리고 접는 데 필요한 세포 형태 변화 및 재배열을 분석하기 위해 저희 실험실에서 개발한 방법을 시연합니다.

이 절차는 단일 세포 단계의 제브라피쉬 배아를 세포가 주입 장치 반대 방향을 향하도록 주입 몰드에 배치하고 주입하는 것으로 시작합니다. 그런 다음 바늘을 난황을 통해 세포 내부로 이동시켜 mRNA를 주입합니다. 다음 날.플라스틱 마운팅 슬라이드에 aros를 채웁니다. 그 다음 마취된 배아를 aros의 구멍에 거꾸로 배치하여 공초점 현미경으로 이미징합니다. 안녕하세요, 저는 Whitehead Institute for Biomedical Research의 Hazel Sieve 박사 연구실과 MIT 생물학과 소속의 Grabham입니다.오늘은 제브라피쉬 배아의 단세포 단계 주입 절차와 이후 공초점 현미경을 이용한 뇌의 생체 이미징 방법을 보여드리겠습니다. 저희 실험실에서는 이 절차를 통해 단세포 해상도로 척추동물의 뇌 형태 형성 과정을 연구하고 있습니다. 그럼 시작하겠습니다.본 절차에 사용되는 mRNA는 C-A-X-E-G-F-P-R-N-A-A 막 결합 GFP를 인코딩하는 플라스미드로부터 전사됩니다. 먼저 NotI로 플라스미드를 소화시켜 선형화한 후, M message mkit를 사용하여 선형화된 플라스미드로부터 막 결합 GFP mRNA를 전사합니다. mRNA 전사가 완료되면, 결과물인 mRNA를 정량하여 물로 희석해 1 µg/µL 농도로 맞춘 후, 필요할 때까지 -80 °C에서 보관합니다. 주입 전날에 교배 케이지를 준비하여 수컷과 암컷을 분리합니다. 주입을 위한 모세관 니들을 제작할 때는 setter 기구 마이크로피펫 풀러를 사용하십시오.주입 당일 1세포기 배아의 너비와 동일한 레인을 가진 1% AGA rose 주입 몰드를 준비하고, 1 µg/µL 농도의 membrane GFP mRNA 분주액을 얼음 위에서 해동합니다. mRNA를 물로 1:5 비율로 희석하여 최종 농도를 200 ng/µL로 맞춘 후 얼음 위에 보관합니다. 준비된 200 ng/µL 농도의 membrane GFP mRNA 1 µL를 모세관 바늘에 채웁니다.여기서는 주입 시 가시성을 확보하기 위해 mRNA에 0.05% phenol red를 첨가합니다. 충전된 바늘을 가스 구동식 마이크로 인젝터에 연결된 마이크로 매니퓰레이터에 장착합니다. 주입 부피를 1 nL로 조절합니다.다음으로, 전날 교배 케이지에 설정한 야생형 물고기의 구분막을 제거합니다. 배아가 산란되는 즉시 수집하십시오. AGA 장미형 주입 몰드에 배아 배지를 채우고, 배아의 단세포 면이 마이크로 매니퓰레이터 반대편을 향하도록 몰드 내에 배치합니다.mRNA가 단일 세포에 직접 주입될 수 있도록 코리온과 난황을 통해 주입하십시오. 실험당 약 50개의 배아를 주입하십시오. 단, 세포가 이미 분열한 경우에는 주입하지 마십시오. 배아 주입 후, 배아 배지에서 28°C로 하룻밤 동안 배양하십시오.하룻밤 동안 배양한 후, 주입된 배아는 마운팅 및 이미징 준비가 완료됩니다. 이 절차를 시작하려면, 관심 시점 1시간 전에 입체 현미경 하에서 핀셋을 사용하여 배아의 난막(corion)을 제거하고, 최대 4개의 배아를 마운팅할 수 있도록 슬라이드를 준비하십시오. 그런 다음 슬라이드 상단까지 0.7% aros를 채우고 약 20분 동안 또는 aros가 굳을 때까지 기다립니다.aeros가 굳으면, 200 µL 피펫 팁을 사용하여 각 배아를 고정할 원통형 구멍을 뚫습니다. 고정하기 전에 핀셋으로 aeros 플러그를 제거합니다. aeros가 채워진 슬라이드 위에 배아를 올려놓고 해부 현미경으로 관찰합니다.마취를 위해 trica 50 µL를 첨가합니다. 포셉을 사용하여 배아의 뇌 또는 관심 영역이 하단의 커버슬립 쪽을 향하도록 배아를 뒤집어 aros의 원통형 구멍에 배치합니다.AGA 내의 배아를 다른 커버슬립으로 덮고 실리콘 진공 그리스로 고정합니다. 이제 배아를 이미징할 준비가 되었습니다. 여기에서 보여주는 것처럼 도립 형광 레이저 스캐닝 공초점 현미경을 사용하여 배아를 이미징하거나, 회전 디스크 공초점 현미경을 사용하여 63배율 이상으로 이미징함으로써 신경 상피 내의 단일 세포에 대한 고해상도 이미지를 수집합니다.이미지는 LSM 소프트웨어에서 TIF 파일로 내보낸 후 Photoshop을 사용하여 분석합니다. 이것은 24시간 된 제브라피시 배아의 중뇌와 후뇌 뇌실 사이의 신경 상피를 촬영한 대표적인 공초점 이미지입니다. M은 중뇌 뇌실을 나타내며, H는 후뇌 뇌실을 나타냅니다.각 세포는 막 결합 GFPE로 표지되어 있습니다. 우리는 단일 세포 해상도로 발달 중인 제브라피시 뇌를 분석할 수 있는 기술을 방금 시연했습니다. 이 기술을 통해 우리는 기저 수축(basal constriction)이라고 불리는 새로운 유형의 세포 형태 변화를 연구할 수 있었습니다.또한 이를 통해 다른 유형의 현상을 분석하고 척추 기관 형성 및 그 기저에 있는 세포 생물학에 대한 이해를 크게 확장할 수 있을 것입니다. 이것으로 모든 설명을 마치겠습니다. 시청해 주셔서 감사하며, 여러분의 실험에 좋은 결과가 있기를 바랍니다.

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Research

연구

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Biology

생물학

이 프로토콜은 zebrafish 배아를 생활에서 개별 뉴런 또는 신경 능선 세포의 이미징을 설명합니다. 이 방법은 형광 공촛점 시간 경과 현미경을 사용하여 셀룰러 행동과 굴지의 현지화을 검사하는 데 사용됩니다.

세포 운동성 및 Zebrafish 태아의 개별 뉴런과 신경 크레스트 세포의 굴지의 Cytoskeleton의 라이브 영상

초기 배아를 형성 morphogenetic 프로세스를 이해하는 데 핵심 고해상도로 이미지 세포 수있는 능력입니다. 우리는 여기서 세포막 타겟 그린 형광 단백질로 전체 zebrafish의 배아에서 세포의 단일 세포 또는 작은 클러스터를 라벨에 대한 기술을 설명합니다.

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개발 Zebrafish Forebrain에 Clonally 관련 신경 전구 세포의 시간 경과 라이브 영상

애벌레 제브라 피쉬의 뇌 발달의 영상이 설명되어 있습니다. 3D 영상을 촉진하고 화학적 처리를 사용하여 뇌 혈관 발달을 수정하는 기술도 제공됩니다.

이미징 및 배아 제브라 피쉬의 뇌 혈관 구조의 3 차원 재구성

생체 내에서 세포 기관 및 기타 세포 내 구조의 동적 거동을 이미징하면 생리학적 및 질병 조건에서 그 기능을 밝힐 수 있습니다. 여기에서는 중심체와 미토콘드리아의 두 소기관을 유전적으로 태그하고 광시야 및 컨포칼 현미경을 사용하여 살아있는 제브라피시 배아에서 이들의 역학을 이미징하는 방법을 제시합니다.

살아있는 Zebrafish의 배아에서 세포 이하 구조를 이미징

여기에서는 정상적인 발달을 방해하지 않고 살아있는 제브라피시 배아의 후체 발달을 장기간 타임 랩스 이미징할 수 있는 다목적 장착 방법을 제시합니다.

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생체 내 이미징은 신경계 발달의 근본적인 세포 메커니즘을 조사하는 데 사용할 수있는 강력한 도구입니다. 여기에서 우리는 개발 제브라피시 신경계 내의 다중 색깔 Brainbow 표지세포의 다수를 구상하기 위하여 시간 경과 공초점 현미경 검사법을 이용하기 위한 기술을 기술합니다.

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이 프로토콜은 제브라피시의 토토 라벨링 및 다차원 이미징의 접근 방식을 초기 눈 발달에 설명합니다. 당사는 레이저 스캐닝 공초점 현미경을 이용한 라벨링, 임베딩 및 4차원(4D) 이미징을 설명하고, 광학컵 형태발생의 해부 메커니즘을 위한 데이터 집합의 획득을 최적화하기 위한 고려 사항을 설명합니다.

제브라피쉬 광학컵 모르포발생4차원 이미징

여기에 제시된 것은 3차원 형광 현미경을 사용한 유충 제브라피쉬의 생체 내 전뇌 이미징을 위한 프로토콜입니다. 실험 절차에는 샘플 준비, 이미지 획득 및 시각화가 포함됩니다.

생체 내 3차원 형광 현미경을 사용한 제브라피쉬 유충의 전뇌 이미징

우리는 빠른 스캐닝 컨포칼 현미경을 활용하여 개발 중인 제브라피시 시신경 구조에서 미세아교세포의 실시간 이미징을 수행하는 방법을 시연하여 생체 내에서 이러한 세포의 역학을 분석할 수 있습니다.

Zebrafish 배아에서 Microglia Dynamics의 실시간 이미징 및 특성 분석

여기에서는 컨포칼 현미경을 사용하여 GCaMP 칼슘 지표를 발현하는 형질전환 제브라피쉬의 뇌 영역에서 신경 활동을 조사하기 위한 자세한 프로토콜을 제시합니다.

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배우세요 공촛점 현미경을 이용한 제브라피시 배아 뇌의 단일세포 해상도 라이브 영상 기법입니다. mRNA 주입과 마운팅 방법을 통해 척추동물 뇌 형태발생을 연구할 수 있습니다.

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