Name: Generatie van de Mens CD40-geactiveerde B-cellen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-10-16T23:30:00.000+00:00
Duration: 13 min 27 s
Description: Leer de ex vivo generatie en expansie van menselijke CD40-geactiveerde B-cellen uit perifere bloedmononucleaire cellen. Deze methode onderzoekt antilichaamonafhankelijke functies van B-cellen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Het protocol voor de generatie van de menselijke CD40-geactiveerde B-cellen uit PBMC is verdeeld in twee delen: deel A toont de bereiding van de CD40-ligand uitdrukken NIH/3T3 cellen, die gebruikt zal worden als plate-gebonden feeder cellen. Deel B beschrijft de actuele CD40-B cultuur. A. Bereiding van feeder-cellen (tCD40L NIH/3T3) De tCD40L NIH/3T3 is een aanhanger muis fibroblast cellijn, die nooit zou moeten worden volledig confluent. De cellen zijn dan ook twee keer gesplitst per week. Het kweken van meer dan 6 weken wordt niet aanbevolen. <ol><li> Verwijder oude medium van de primaire cultuur met een steriele pipet en was cellen met 10 ml 1x PBS. Zuig het PBS na het wassen. </li><li> Voeg 4 ml trypsine / EDTA in een 75 cm 2 fles gedurende 5-10 minuten bij 37 ° C. Gebruik zachte tikken om de cellen los te maken. </li><li> Voeg 10 ml van de wild-type medium en draai voorzichtig. </li><li> Breng de celsuspensie in een 50 ml buis met een steriele pipet en de spin de cellen neer op 225 xg gedurende 5 minuten. </li><li> Verwijder het supernatant en resuspendeer de pellet in 10 ml van wild type medium. Tel het aantal cellen van een aliquot van de celsuspensie en voor te bereiden drie 50 ml buizen met het juiste aantal cellen: <ol><li> 1,5 x 10 6 cellen voor subcultuur </li><li> 0,2 x 10 6 cellen / goed voor bestraling gebruikt worden voor de CD40-B-cel cultuur </li><li> rest te bevriezen (indien nodig). </li></ol></li><li> Spin de cellen neer op 225 xg gedurende 5 minuten. </li><li> Verwijder het supernatant. <ol><li> Voor subcultuur: resuspendeer 1,5 x 10 6 cellen in 10 ml wild type medium in een 75 cm 2 celkweek kolf (celdichtheid 1,5 x 10 5 cellen / ml), voeg G-418 [0,7 mg / ml] en incubeer de cellen op 37 ° C met 5% CO 2. Splits de cellen twee keer per week. </li><li> Voor de CD40-B-cel cultuur: U moet 1,2 x 10 6 cellen voor een 6-wells plaat. Resuspendeer de cellen in wild-type medium bij een dichtheid van 0,1 x 10 6 cellen / ml en bestralen ze op 78 Gy. Plaat 2 mL van de celsuspensie in elk putje en incubeer ze op 37 ° C met 5% CO 2. Gebruik deze voorbereid platen voor B-cel stimulatie bij tCD40L NIH/3T3 cellen aanhanger (ten minste 4 uur: controleer hechting met de microscoop, wacht niet meer dan 24 uur tot B-cel stimulatie te starten). (Ga verder met B.) </li></ol></li></ol> B. CD 40-B-cel cultuur I. Voorbereiding van PBMC&#39;s voor de CD40-stimulatie (dag 0): Let op: voordat u verder gaat vergewissen dat feeder cellen aanhanger zijn. Voeg altijd nieuwe oplossingen van interleukine-4 en ciclosporine A aan het groeimedium onmiddellijk voor gebruik. <ol><li> Neem PBMC&#39;s, hetzij vers of de juiste ontdooid. Resuspendeer PBMC tweemaal in 50 ml 1x PBS om ze te wassen en naar beneden draaien eerste keer op 265 xg gedurende 7 minuten en een tweede keer op 190 xg gedurende 7 minuten naar andere cellen te verwijderen. Gooi supernatant en resuspendeer de cellen in 20 ml PBS. Bepaal het aantal cellen in een hoeveelheid van de celsuspensie. </li><li> Spin down benodigde hoeveelheid cellen op 225 xg gedurende 5 minuten. Voor een 6-wells plaat 4 x 10 6 cellen / putje nodig zijn, dus 24 x 10 6 cellen per plaat. </li><li> Verwijder het supernatant en resuspendeer de PBMC op 1 x 10 6 cellen / ml in het CD40-B kweekmedium vers aangevuld met 50 U / mL van interleukine-4 als een groeifactor en 0,63 ug / ml cyclosporine A tot uitgroei van T-cellen te voorkomen (Gezien concentraties verwijzen naar een ml kweekmedium!). </li><li> Verwijder het supernatant van de 6-well plaat pre-geïncubeerd met tCD40L NIH/3T3 cellen. </li><li> Was de hechtende tCD40L NIH/3T3 cellen met 2 ml PBS per well eerste en in een tweede stap met 2 ml van CD40-B wassen medium. </li><li> Voorzichtig Voeg 4 ml van PBMC suspensie (1 x 10 6 cellen / ml) aan elk putje van de 6-wells plaat. </li><li> Incubeer de cellen bij 37 ° C met 5% CO 2. </li><li> Op dag 7, reculture de cellen (Ga verder met 3.2.). </li></ol> II. Hercultivering van CD40-B-cellen (dag 7 en vervolgens om de 3-4 dagen): <ol><li> Oogst clusters van CD40-B-cellen van de 6-well plaat door mengen met een 10 ml pipet en het zwembad ze in een 50 ml buis. </li><li> Spin neer op 225 xg gedurende 7 minuten en volledig de supernatant te vervangen door CD40-B wassen medium. Terwijl het tellen van de cel hoeveelheid van een hoeveelheid, draai de cellen neer op 225 xg gedurende 5 minuten. Resuspendeer CD40-B-cellen in CD40-B kweekmedium bij een concentratie van 1 x 10 6 cellen / ml. </li><li> Voeg nieuwe oplossingen van interleukine-4 in een concentratie van 50 U / ml en 0,63 ug / ml cyclosporine A aan het medium. </li><li> Verwijder de bovenstaande vloeistof uit een 6-wells plaat pre-geïncubeerd met tCD40L NIH/3T3 cellen. </li><li> Was de hechtende cellen met 2 ml PBS per well eerste en in een tweede stap met 2 ml van CD40-B wassen medium. </li><li&gt; voorzichtig Voeg 4 ml (1 x 10 6 cellen / ml) van CD40-B ophanging aan elk putje van de 6-wells plaat. </li><li> Incubeer de platen bij 37 ° C met 5% CO 2. </li><li> Subcultuur cellen weer om de 3-4 dagen om te eindigen met een zeer zuivere menselijke CD40-geactiveerde B-cellen na een totaal van 14 dagen. </li></ol> C. Trouble-shooting - Wat gebeurt er als CD40-B-cellen niet groeien? <ol><li> Heb je gecontroleerd of CD40 ligand expressie van feeder-cellen? </li><li> De plaat-gebonden feeder cellen die worden gebruikt voor het stimuleren mag niet ouder zijn dan 24 uur? </li><li> Is een besmetting met mycoplasma mogelijk? </li><li> Was de interleukine-4-oplossing voor de suppletie vers ontdooid en had het passende biologische activiteit? </li><li> Was cyclosporine A toegevoegd in de juiste concentratie? </li></ol><img src="/files/ftp_upload/1373/1373fig1tmb.jpg" border="0" alt="Figuur 1" /> Figuur 1. Alstublieft <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1373/1373fig1.jpg">Klik hier</a> voor een grotere versie van figuur 1. <img src="/files/ftp_upload/1373/1373fig2tmb.jpg" border="0" alt="Figuur 2" /> Figuur 2. Alstublieft <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1373/1373fig2.jpg">Klik hier</a> voor een grotere versie van figuur 2.

<ol><li>Schultze, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD40-activated+human+B+cells%3A+an+alternative+source+of+highly+efficient+antigen+presenting+cells+to+generate+autologous+antigen-specific+T+cells+for+adoptive+immunotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">CD40-activated human B cells: an alternative source of highly efficient antigen presenting cells to generate autologous antigen-specific T cells for adoptive immunotherapy.</a> J Clin Invest. 100, 2757-2765 (1997).</li>
<li>Schultze, J. L., Grabbe, S., vonBergwelt-Baildon, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DCs+and+CD40-activated+B+cells%3A+current+and+future+avenues+to+cellular+cancer+immunotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Immunol%22%5BJournal%5D)">DCs and CD40-activated B cells: current and future avenues to cellular cancer immunotherapy.</a> Trends Immunol. 25, 659-664 (2004).</li>
<li>Bergwelt-Baildon, M. von <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD40-activated+B+cells+express+full+lymph+node+homing+triad+and+induce+T-cell+chemotaxis%3A+potential+as+cellular+adjuvants%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">CD40-activated B cells express full lymph node homing triad and induce T-cell chemotaxis: potential as cellular adjuvants.</a> Blood. 107, 2786-2789 (2006).</li>
<li>Wiesner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conditional+immortalization+of+human+B+cells+by+CD40+ligation%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Conditional immortalization of human B cells by CD40 ligation.</a> PLoS ONE. 3, 1464-14 (2008).</li>
<li>Urashima, M., Chauhan, D., Uchiyama, H., Freeman, G. J., Anderson, K. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD40+ligand+triggered+interleukin-6+secretion+in+multiple+myeloma%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">CD40 ligand triggered interleukin-6 secretion in multiple myeloma.</a> Blood. 85, 1903-1912 (1995).</li>
<li>Lapointe, R., Bellemare-Pelletier, A., Housseau, F., Thibodeau, J., Hwu, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD40-stimulated+B+lymphocytes+pulsed+with+tumor+antigens+are+effective+antigen-presenting+cells+that+can+generate+specific+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">CD40-stimulated B lymphocytes pulsed with tumor antigens are effective antigen-presenting cells that can generate specific T cells.</a> Cancer Res. 63, 2836-2843 (2003).</li>
<li>von Bergwelt-Baildon, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+primary+and+memory+cytotoxic+T+lymphocyte+responses+are+efficiently+induced+by+means+of+CD40-activated+B+cells+as+antigen-presenting+cells%3A+potential+for+clinical+application%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Human primary and memory cytotoxic T lymphocyte responses are efficiently induced by means of CD40-activated B cells as antigen-presenting cells: potential for clinical application.</a> Blood. 99, 3319-3325 (2002).</li>
<li>Kondo, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD40-activated+B+cells+can+be+generated+in+high+number+and+purity+in+cancer+patients%3A+analysis+of+immunogenicity+and+homing+potential%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Exp+Immunol%22%5BJournal%5D)">CD40-activated B cells can be generated in high number and purity in cancer patients: analysis of immunogenicity and homing potential.</a> Clin Exp Immunol. 155, 249-256 (2009).</li>
<li>Mason, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA-loaded+CD40-activated+B+cells+stimulate+antigen-specific+T-cell+responses+in+dogs+with+spontaneous+lymphoma%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">RNA-loaded CD40-activated B cells stimulate antigen-specific T-cell responses in dogs with spontaneous lymphoma.</a> Gene Ther. 15, 955-965 (2008).</li>
</ol>

A. Bereiding van Media: <table border="1"cellspacing="0"><tbody><tr><td colspan="2"> Feeder cel wild-type medium </td><td colspan="2"> Feeder celselectie medium </td></tr><tr><td> Reagens </td><td> Concentratie </td><td> Reagens </td><td> Concentratie </td></tr><tr><td> DMEM-Ham&#39;s / F12 </td><td></td><td> DMEM-Ham&#39;s / F12 </td><td></td></tr><tr><td> L-Glutamine </td><td> 365 ug / ml </td><td> L-Glutamine </td><td> 365 ug / ml </td></tr><tr><td> FBS </td><td> 10% </td><td> FBS </td><td> 10% </td></tr><tr><td> HEPES </td><td> 10 mM </td><td> HEPES </td><td> 10 mM </td></tr><tr><td> Gentamycine </td><td> 15 ug / ml </td><td> Gentamycine </td><td> 15 ug / ml </td></tr><tr><td></td><td></td><td> G-418 </td><td> 0,7 mg / ml </td></tr></table><table cellspacing="0" border="1"><tbody><tr><td colspan="2"> CD40-B wassen medium </td><td colspan="2"> CD40-B kweekmedium </td></tr><tr><td> Reagens </td><td> Concentratie </td><td> Reagens </td><td> Concentratie </td></tr><tr></tr></tbody><tbody><tr><td> IMDM </td><td> </td><td> IMDM </td><td> </td></tr></tbody><tbody><tr><td> L-Glutamine </td><td> 584 ug / ml </td><td> L-Glutamine </td><td> 584 ug / ml </td></tr></tbody><tbody><tr><td> HEPES </td><td> 25 mM </td><td> HEPES </td><td> 25 mM </td></tr></tbody><tbody><tr><td> Gentamycine </td><td> 15 ug / ml </td><td> Gentamycine </td><td> 15 ug / ml </td></tr></tbody><tbody><tr><td> </td><td> </td><td> rh Transferrine </td><td> 50 ug / ml </td></tr></tbody><tbody><tr><td> </td><td> </td><td> rh Insuline </td><td> 5 ug / ml </td></tr></tbody><tbody><tr><td> </td><td> </td><td> AB-Humanserum </td><td> 10% </td></tr></tbody></table> B. Diverse Reagentia: <table cellspacing="0" border="1"><tbody><tr><td> Reagens </td><td> Vennootschap </td><td> Volgnummer </td></tr><tr></tr><tr><td> DMEM / Ham&#39;s F12 </td><td> PAA </td><td> Cat No: E15-813 </td></tr><tr><td> IMDM </td><td> Invitrogen Gibco ® </td><td> REF 21980-032 </td></tr><tr><td> Dulbecco&#39;s PBS (10x) </td><td> PAA </td><td> Geen kat H15-011 </td></tr><tr><td> AB-Human Serum </td><td> Invitrogen </td><td> Geen kat 34005100 </td></tr><tr><td> holo-Transferrine menselijke </td><td> Sigma </td><td> Geen kat T0665 </td></tr><tr><td> Humane insuline </td><td> Sigma </td><td> Geen kat I2643 </td></tr><tr><td> Gencin ® </td><td> Delta Select </td><td> Art No 7395800 </td></tr><tr><td> Recombinant humaan interleukine-4 </td><td> Immunotools </td><td> Geen kat 11130045 </td></tr><tr><td> Cyclosporine A </td><td> Novartis </td><td> Geen kat NDC 0078-0109-01 </td></tr><tr><td> FBS </td><td> Lonza </td><td> Geen kat DE14-802C </td></tr><tr><td> HEPES Buffer </td><td> PAA </td><td> Geen kat S11-001 </td></tr><tr><td> G-418 sulfaat </td><td> PAA </td><td> Geen kat P02-012 </td></tr><tr><td> Trypsine / EDTA (10x) </td><td> Invitrogen Gibco ® </td><td> REF 15400-054 </td></tr></tbody></table> C. diverse benodigdheden: <table cellspacing="0" border="1"><tbody><tr><td> Reagens </td><td> Vennootschap </td><td> Volgnummer </td></tr><tr></tr><tr><td> Steriele pipet tips </td><td> Sarstedt </td><td></td></tr><tr><td> 6-well plaat </td><td> NUNC </td><td> Geen kat 140675 </td></tr><tr><td> 50ml conische buis </td><td> BD Falcon ™ </td><td> Geen kat 352070 </td></tr><tr><td> Weefselkweek fles </td><td> Sarstedt </td><td> Geen kat 83.1813.002 </td></tr></tbody></table>

generatie van de mens cd40-geactiveerde b-cellen

Generation of Human CD40-activated B cells

CD40-geactiveerde B-cellen (CD40-B-cellen) zijn geïdentificeerd als een alternatieve bron van immuno-stimulerende antigen-presenterende cellen (APC) voor de immunotherapie van kanker 1-3. In vergelijking met Dendritische cellen (DC&#39;s), de beste gekarakteriseerd APC, CD40-B cellen hebben een aantal verschillende biologische en technische eigenschappen. Net als bij DC&#39;s, B-cellen een verhoogde expressie van MHC en co-stimulerende moleculen (Fig.1b) show, vertonen een sterke migratie capaciteit en presenteren antigeen presentatie efficiënt T-cellen, na stimulatie met interleukine-4 en CD40 ligand (CD40L). Echter, in tegenstelling tot onrijpe of rijpe DCs, CD40-B-cellen drukken de volledige lymfeklier homing triade bestaande uit CD62L, CCR7/CXCR4 en leukocyten functie antigen-1 (LFA1, CD11a/CD18), die nodig zijn voor de homing naar secundair lymfoïde organen (Fig.1a) 3. CD40-B-cellen kan worden gegenereerd zonder de moeilijkheden van zeer kleine hoeveelheden van perifeer bloed, dat verder kan worden uitgebreid naar in vitro zeer grote hoeveelheden van zeer zuivere CD40-B-cellen (&gt; 10 9 cellen per patiënt) van gezonde donoren en kanker patiënten (Fig.1c, d) 1,4. In dit protocol hebben we laten zien hoe je volledig geactiveerd CD40-B-cellen van menselijke PBMC te verkrijgen. De belangrijkste moleculen voor de cel cultuur CD40-ligand, interleukine-4 (IL-4) en ciclosporine A (CsA), die aangevuld in een 3-4 dagen cultuur cyclus. Voor laboratorium doeleinden CD40-stimulatie wordt verzorgd door NIH/3T3 cellen die recombinant humaan CD40 ligand (tCD40L NIH/3T3) 5. Om te voorkomen dat besmetting met niet-getransfecteerde cellen, expressie van de menselijke CD40-ligand op de transfectanten moet regelmatig gecontroleerd worden (fig. 2). Na 14 dagen CD40-B-cel culturen bestaan ​​uit meer dan 95% zuiver B-cellen en een uitbreiding van CD40-B-cellen over 65 dagen is het vaak mogelijk zonder enig verlies van functie 1, 4. CD40-B-cellen efficiënt te nemen, verwerken en presenteren antigenen aan T-cellen 6. Zij niet alleen premier naϊve, maar ook uit te breiden geheugen T-cellen 7,8. CD40-geactiveerde B-cellen kunnen worden gebruikt voor het B-cel activatie, differentiatie en functie te bestuderen. Bovendien, zij vertegenwoordigen een veelbelovend instrument voor therapeutische of preventieve vaccinatie tegen tumoren 9.

In deze video presenteren we de<em&gt; Ex vivo</em&gt; Generatie en de uitbreiding van de menselijke CD40-geactiveerde B-cellen (CD40-B) uit perifeer bloed mononucleaire cellen (PBMC) door stimulatie met CD40 ligand en interleukine-4.

Generatie van de Mens CD40-geactiveerde B-cellen

CD40-geactiveerde B-cellen (CD40-B-cellen) zijn geïdentificeerd als een alternatieve bron van immuunstimulerende antigeenpresenterende cellen (APC) voor kanker ...

Hallo, mijn naam is Alexander Shiku Van Hagen. Ik ben lid van het Laboratorium voor twee Immunologie en Transportimmunologie aan het Universiteitsziekenhuis van Keulen. In deze video gaan we laten zien hoe we menselijke CD 40-geactiveerde B-cellen kunnen genereren uit mononucleaire cellen uit perifeer bloed.Een van de belangrijkste interesses van ons laboratorium is de studie naar de antilichaam-onafhankelijke functies van B-cellen. Naast hun rol als producenten van antilichamen vervullen B-cellen een belangrijke rol als antigeenpresenterende cellen, zowel onder fysiologische omstandigheden als bij auto-immuunziekten. Na activatie kunnen B-cellen krachtige antigeenpresenterende en immunostimulerende capaciteiten verwerven, vooral wanneer ze worden geactiveerd via CD 40.CD 40. Geactiveerde B-cellen bieden verschillende voordelen in vergelijking met dendritische cellen. Ze kunnen eenvoudig en tegen relatief lage kosten worden uitgebreid uit kleine hoeveelheden perifeer bloed, zelfs bij kankerpatiënten.Nu zullen onze PhD-student, Tanya Leic en onze technicus LER, u een stapsgewijze introductie geven over hoe u menselijke CD 40-geactiveerde B-cellen uit perifeer bloed kunt genereren. Hallo, mijn naam is Tanya Livi. Ik ben een PhD-student en ik wil u demonstreren hoe u menselijke CD 40-geactiveerde B-cellen kunt genereren.Deze procedure is in ons laboratorium geoptimaliseerd. De belangrijkste stappen zijn 首先 de voorbereiding van de feeder-cellen. Hiervoor gebruiken we menselijke CD 40-ligand getransfecteerde N IH 33-cellen, die bestraald worden met 78 gray en uitgeplaat op zes-wells platen.Ten tweede starten we de kweek van menselijke CD 40-geactiveerde B-cellen vanuit gezuiverde PBMC, die worden behandeld met menselijk interleukine 4 en cyclosporine A; deze cellen worden vervolgens geplaatst op feta-cellen in zeswells platen. Deze procedure wordt herhaald op dag 7 en daarna elke drie tot vier dagen tot dag 14 van de celkweek. Om zeer zuivere menselijke CD 40-geactiveerde B-cellen te verkrijgen, starten we de generatie van CD 40-geactiveerde B-cellen met vers gezuiverde of op passende wijze ontdooide menselijke PBMC.Ten eerste wassen we de pbmc tweemaal door de cellen opnieuw te suspenderen in 50 milliliter PBS. Centrifugeer de PBMC zeven minuten bij 1300 RPM, wat overeenkomt met 260 5G. Verwijder vervolgens het supernatant en suspendeer de cellen opnieuw in 50 milliliter PBS; centrifugeer ze opnieuw zeven minuten bij 1100 RPM, wat overeenkomt met 190 G. Verwijder opnieuw het supernatant voor de bepaling van het aantal cellen.Suspendeer de PBMC in 20 milliliter PBS, meng de cellen grondig door te vortexen en bepaal het celgetal. Centrifugeer de benodigde hoeveelheid PBMC voor de CD40 B-cultuur gedurende vijf minuten bij 1200 RPM, overeenkomend met 220 5G. Voor een six-well plate zijn 4 × 10⁶ cellen per well nodig, wat neerkomt op 24 × 10⁶ cellen per plate.Resuspendeer vervolgens de PBMC in CD 40 B-kweekmedium op een concentratie van 1 × 10⁶ cellen per milliliter. Vul de celsuspensie aan met verse humane IL-4 in een concentratie van 50 units per milliliter voor stimulatie en cyclosporine A in een concentratie van 0,63 µg per milliliter om de uitgroei van T-cellen te remmen. De PBMC-suspensie is nu klaar voor stimulatie met CD 40-ligand.Voor zover wij weten is er momenteel geen functioneel CD 40-ligand van GMP-kwaliteit beschikbaar. Daarom gebruiken wij met humaan CD 40-ligand getransfecteerde NIH 3T3-cellen om celoverleving, differentiatie en proliferatie te stimuleren, aangezien de NIH 3T3-cellijn gedurende enkele maanden in kweek kan overleven. Verlies van CD 40-ligandexpressie moet regelmatig via controles worden uitgesloten.CD 40 ligand getransfecteerde NIH 3T3 is een adherente cellijn en wordt gekweekt bij 37 °C met 5% CO2 in selectiemedium, dat is aangevuld met G 418 in een concentratie van 0,7 mg/mL. Deze adherente fibroblastcellijn mag nooit volledig confluent worden en moet twee keer per week gesplitst worden. Om de adherente cellen te splitsen, wordt het medium geaspireerd en wordt er eenmaal gewassen met 10 mL PBS door voorzichtig te zwenken. Aspireer het medium opnieuw en voeg 4 mL trypsine-EDTA toe in een fles van 75 cm².Incubeer de kolf gedurende vijf tot 10 minuten bij 37 °C in de incubator. Haal de kolf vervolgens weer uit de incubator. Tik voorzichtig tegen de kolf om de cellen van het plastic los te maken.Voeg vervolgens 10 milliliter wild-type medium toe, draai voorzichtig heen en weer en breng de cellen over naar een 50 milliliter buis. Centrifugeer de NA eight three T three cellen vijf minuten bij 1200 RPM, wat overeenkomt met hundred and 20 5G. Resuspendeer de pelletcellen voorzichtig in 10 millimeter wild-type medium.Bepaal het celgetal voor N IH 33 subcultuur en resuspendeer 1,5 × 10⁶ feeder-cellen in 10 milliliter wildtype medium. Transfer deze naar een fles van 75 cm² en voeg G 4 1 8 toe in een concentratie van 0,7 mg/mL om te selecteren op de getransfecteerde cellen die neomycine-resistentiegenen dragen. Incubeer de feeder-cellen tot slot bij 37 °C in 5% CO₂ voor CD 40 B-stimulatie.Neem de resterende NI 8 3 3 cellen en bestraal deze letaal met 78 Gy om proliferatie te stoppen. Verdun de bestraalde feeder-cellen in wire type medium tot een celdichtheid van 0,1 × 10⁶ cellen per milliliter en plaat twee milliliter per well op een six-wellplaat. Laat de cellen op de six-wellplaten opnieuw adhereren voordat ze als feeder-cellen worden gebruikt door ze 24 uur lang te incuberen bij 37 °C en 5% CO2 voor stimulatie van B-lymfocyten met CD 40 ligand.Controleer onder de microscoop of de feeder-cellen die een dag eerder zijn geplaatst, adherent zijn. Als de feeder-cellen adherent zijn, verwijder dan het SUP natin uit elke put en was deze snel twee keer. Was elke put eerst met twee milliliter PBS en daarna nogmaals met twee milliliter.CD 40 B wasmedium voor stimulatie van de PBMC-suspensie. Kort van tevoren bereid met een celdichtheid van 1 × 10⁶ cellen per milliliter voor de feeder-cellen. Hiervoor wordt voorzichtig 4 mL van de celsuspensie naar elk overgebracht.Incubeer de plaat op dag zeven bij 37 °C in 5% CO2. CD 40 B-cellen kunnen voor de eerste subcultuur van CD 40 geactiveerde B-cellen op dag zeven worden gesubcultiveerd, gevolgd door verdere subculturen elke drie tot vier dagen.Oogst de geclusterde cellen voorzichtig uit de zes 12-wells plaat door middel van resuspensie met een 10 milliliter pipet. Breng de CD 40 B-cellen over in een 50 milliliter buis. Centrifugeer de CD 40 B-cellen gedurende zeven minuten bij 1200 RPM, overeenkomend met 220 5G volledig.Vervang het medium door CD 40 B-wasmedium en bepaal het celgetal van de CD 40-geactiveerde B-cellen. Resuspendeer de CD 40 B-cellen op 1 × 10⁶ cellen per milliliter in CD 40 B-kweekmedium.Voeg vervolgens vers menselijk IL-4 in een concentratie van 50 units per milliliter en cyclosporine A in een concentratie van 0,63 µg per milliliter toe aan de celsuspensie voor stimulatie. Gebruik hiervoor bestraalde feeder-cellen die één dag eerder zijn voorbereid. De bestraalde feeder-cellen moeten uiteraard direct voor gebruik opnieuw onder de microscoop op adhesie worden gecontroleerd.Indien adherent, was de feeder-cellen snel twee keer zoals voorheen, één keer met PBS en de tweede keer met CD 40 B-wasmedium, en breng vervolgens voorzichtig vier milliliter van de CD 40 B-suspensie, aangepast naar 1×10⁶ cellen per milliliter, aan in elke put van de zes-putsplaat. De subcultuur wordt op identieke wijze herhaald na drie tot vier dagen, tweemaal per week, om op dag 14 van de cultuur te eindigen met celclusters van zeer zuivere menselijke CD 40-geactiveerde B-cellen.Op dit moment brengen CD 40 B-cellen co-stimulerende moleculen tot expressie, zoals CD 80, CD 86, CD 83 MHC-moleculen en de zogenaamde lymfeknoophoming-triade van CD 62 ligand, CCR7 en LFA-1, wat via flowcytometrie tijdens de generatie gecontroleerd kan worden. Raadpleeg voor probleemoplossing de tekstversie van dit protocol. We hopen dat CD 40-geactiveerde B-cellen in de toekomst als een belangrijk instrument voor kankerimmunotherapie zullen dienen.Veel succes met uw experimenten.

generation-of-human-cd40-activated-b-cells

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

In deze video, tonen we de procedure van de CD40-activatie en expansie van B-cellen van muizen splenocyten van C57BL / 6 muizen, die gebruikt kan worden als een model antigeen-presenterende cel (APC), de inductie van immuniteit bestuderen.

Muizenmodel van CD40-activatie van B-cellen

Een efficiënt systeem van de structuur en functie analyse van een gen in...

Recombinante retrovirale Productie en Infectie van B-cellen

This video demonstrates an in vitro assay to generate plasmacytoid dendritic cells (pDCs) from common lymphoid progenitor cells (CLPs). Upon co-culturing purified CLPs with γ-irradiated feeder cells in the presence of Fms-like tyrosine kinase-3 ligand (FL), the CLPs differentiate into non-adherent pDCs, the presence of which is confirmed using flow cytometry.

In Vitro Generation of Plasmacytoid Dendritic Cells from Common Lymphoid Progenitors

This video demonstrates an assay to generate tumor antigen-specific induced pluripotent stem cell (iPSC)-derived CD8αβ+ T Cells. Tumor antigen-specific iPSCs are grown on a stromal cell monolayer and differentiated into hematopoietic progenitor cells (HPCs). The HPCs are differentiated into CD4+ CD8+ double-positive T cells using a differentiation medium. These cells are then stimulated to generate single-positive T cells expressing CD8.

Generating Single Positive CD8 T Cells from Induced Pluripotent Stem Cells

Dit artikel beschrijft een methode voor de generatie en proliferatie van humane T-celklonen die specifiek reageren op een gedefinieerd allo-antigen. Dit protocol kan worden aangepast voor het klonen van humane T-cellen die specifiek zijn voor een verscheidenheid aan peptide-MHC-liganden.

Genereren van menselijke allogeen-specifieke T-cellen uit perifeer bloed

Hierin beschrijven we een nieuwe methode om antigeenspecifieke T-celreceptoren (TCR's) door het koppelen van de TCRα of TcR van een bestaande TCR, bezit de antigeen-specificiteit van interesse, met aanvullende hemichain van de perifere T-cel receptor repertoire genereren. De novo geproduceerde TCRs behouden antigeen-specificiteit met verschillende affiniteit.

Generating<em&gt; De Novo</em&gt; Antigeen-specifieke menselijke T-cel receptoren door Retrovirale Transductie van Centric Hemichain

Hier demonstreren we hoe monocyten worden geïsoleerd door magnetische kralenscheiding van mononucleaire cellen uit het perifere bloed na dichtheidsgradiëntcentrifugatie van humaan geanticoaguleerd bloed. Na incubatie gedurende 5 dagen, worden menselijke monocyten gedifferentieerd in onrijpe dendritische cellen en zijn ze klaar voor experimentele procedures in een niet-klinische omgeving.

Genereren van Human-monocyten afgeleide dendritische cellen uit volbloed

Beschrijven we een methode voor de productie van menselijke antilichamen specifiek voor een antigeen van belang vanaf zeldzame B-cellen die in menselijk bloed circuleren. Generatie van deze natuurlijke antilichamen is efficiënt en snel, en de verkregen antilichamen kunnen onderscheid maken tussen sterk verwante antigenen.

Generatie van discriminatoire menselijke monoklonale antistoffen uit zeldzame antigeen-specifieke B-cellen in bloed circuleert

Met behulp van scriptingregel cultuur systemen, wij brengen verslag een in vitro B-cel plasma cel differentiatie model.

In Vitro differentiatie Model van menselijke normale B geheugencellen te langlevende plasmacellen

Dit protocol biedt een gestroomlijnde workflow voor het genereren en testen van menselijke chimere antigeenreceptorregulerende T-cellen (CAR Tregs).

Generatie van menselijke chimere antigeenreceptorregulerende T-cellen

Leer de ex vivo generatie en expansie van menselijke CD40-geactiveerde B-cellen uit perifere bloedmononucleaire cellen. Deze methode onderzoekt antilichaamonafhankelijke functies van B-cellen.

Generatie van de Mens CD40-geactiveerde B-cellen

Meer video's verkennen