Name: Test per patogeni associati modello molecolare (PAMP)-trigger Immunità (PTI) nelle piante (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-09-09T16:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 45 s
Description: Scopri un saggio basato sulla morte cellulare per valutare l'immunità innata PTI in Nicotiana benthamiana. Questo metodo consente di analizzare il coinvolgimento di geni specifici nelle risposte immunitarie delle piante.

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Ringraziamo Hye-Sook Oh, Joanne Morello e Alan Collmer, Dipartimento di Patologia Vegetale e Plant-Microbe Biologia, Cornell University, per le discussioni importanti. Ringraziamo Jesse Munkvold per commenti su questo articolo. Il finanziamento è stato fornito dal Programma Nazionale Genoma Plant Science Foundation, il numero di riconoscimento DBI-0605059 (GBM).

Parte 1: La crescita delle piante e la manutenzione Nicotiana benthamiana impianti utilizzati nel test dovrebbe essere di circa 7 settimane di vita. Essi dovrebbero essere tagliati almeno 4-5 giorni prima del test di rimuovere tutti i rami ascellari e fiori. E &#39;una buona idea per rimuovere rami ascellari subito dopo emergono in modo da rendere le piante più gestibile. Parte 2: coltura batterica GIORNO 1: <ol><li> Piastre o culture per tutti i ceppi utilizzati nel test sono iniziati allo stesso tempo. Per la Pseudomonas spp. tra cui 2 induttori e 3 ceppi di sfida, i batteri striscia su piastre KBM contenenti antibiotici appropriati dalle scorte glicerolo congelati (tabella 2). Una piccola quantità di batteri dovrebbero essere diffuse al centro del piatto. Incubare la piastra a 30 ° C per circa 18-24 ore. Per Agrobacterium, avviare una coltura liquida in 2 ml di LB da un piatto fresco e crescere durante la notte a 250 rpm, 30 ° C. </li></ol> 2 ° GIORNO: <ol start="2"><li> Per Pseudomonas, aggiungere 150-200 ml di liquido KBM ai batteri e li stendevano sulla intera piastra utilizzando una spatola sterile di vetro. Mettere la piastra posteriore nell&#39;incubatrice e lasciarlo crescere per un altro 20-24 ore. Ci dovrebbe essere un prato batterica sul piatto il giorno seguente, che indica una buona crescita. Per Agrobacterium, avviare una cultura secondaria LB in circa 5-10 ml con 20 acetosyringone mM e lasciarlo crescere durante la notte per 20 ore a 250 rpm, 30 ° C. </li></ol> Parte 3: impianti di Preparazione per il test 2 ° GIORNO: <ol><li> Un giorno prima del test le piante dovrebbero essere spostati in una stanza a 22-24 ° C, ~ luce del 35-40% di umidità relativa e costante. </li><li> Segna cerchi sulle foglie che sono almeno 1,5 cm di diametro con un pennarello nero spesso. Da due a quattro cerchi può essere contrassegnato per anta. I cerchi dovrebbero essere ben distanziati e preferibilmente non attraversare un grande vena. Scegli bene espanso foglie. Evitare di foglie più vecchie o foglie che sono difficili o spesso al tatto e di evitare la marcatura cerchi sulle parti inferiore della foglia. </li></ol> Cerchi segnando un giorno prima l&#39;esperimento non è essenziale per il protocollo. Tuttavia, fa risparmiare tempo se ci sono un gran numero di piante di essere analizzati, e rende più facile per raggiungere tempistica precisa tra l&#39;induzione di PTI e vaccinazioni sfida. Parte 4: Induzione di PTI 3 ° GIORNO: <ol><li> Raccolta le cellule dalla piastra in mM MgCl 10 2 per P. fluorescens e P. putida. Per Agrobacterium, centrifuga della cultura per raccogliere le cellule e risospendere in 10mM MgCl 2 + 10 mM MES pH 5,6. Ripetere la centrifugazione e risospendere in MgCl 2-MES soluzione. Misurare la densità ottica (DO) delle celle a 600 nm. Regolare l&#39;OD per i valori finali richiesti come descritto nella tabella 2. Pseudomonas dovrebbe essere infine risospeso in 10 mM MgCl 2 e Agrobacterium nel MgCl 2-MES soluzione. Un volume totale di 25 ml è sufficiente per inoculare circa 40-50 punti. </li><li> Infiltrarsi nel induttori PTI nel pre-segnato cerchi sulle foglie utilizzando una siringa da 1 ml senza ago. Scrivere l&#39;ordine in cui sono stati infiltrati nelle piante e l&#39;ora esatta in cui l&#39;infiltrazione è stata iniziata. </li></ol> Parte 5: inoculazione sfida <ol><li> Preparare P. syringae pv. pomodoro DC3000, DC3000 Δ hopQ1 Pst-1 e Ps pv. tabaci per la sfida, come descritto nella parte 4.1 e Tabella 2. </li><li> Sette ore dopo l&#39;infiltrazione induttore, eseguire l&#39;infiltrazione sfida nello stesso ordine delle piante come l&#39;induzione è stato fatto. In generale, un punto sulla periferia del cerchio prima inoculazione può essere utilizzato come il centro del cerchio seconda inoculazione. Se ci sono macchie più su una foglia quindi assicurarsi che le infiltrazioni non si sovrappongano. </li><li> Diluizioni seriali di tutte le culture usato nel test su piastre KBM o LB contenente l&#39;antibiotico appropriato per determinare il numero esatto CFU. </li></ol> Parte 6: punteggio per la ripartizione dei PTI Giorno 5: <ol><li> Cercare la comparsa di morte cellulare a causa di ETI nei luoghi che si sono sfidati con Pst DC3000. La morte cellulare dentro l&#39;area di sovrapposizione di infiltrazione indica la ripartizione dei PTI e risposta deve essere un fenotipo positivo. </li></ol> Giorno 7: <ol start="2"><li> Cercare la comparsa di morte cellulare a causa di malattia nei luoghi che si sono sfidati con Pst DC3000 Δ hopQ1-1 o Ps pv. Tabaci </em&gt;. Punteggio per un fenotipo positivo nello stesso modo come descritto nella parte 6.1. </li></ol> Quando le piante di controllo (che non deve essere compromessa per PTI) iniziano a mostrare la morte cellulare nella zona di sovrapposizione di infiltrazione, smettere di fare ulteriori osservazioni. Parte 7: I risultati rappresentativi La figura 1 mostra il risultato di un test in cui P. fluorescens è stato utilizzato come induttore e DC3000 Pst come la sfida. <img src="/files/ftp_upload/1442/fig1tmb.jpg" alt="Figura 1" border="0" /> Figura 1. P. fluorescens era infiltrata sul N. benthamiana foglie (cerchio nero) per indurre PTI e 7 ore dopo, il luogo è stato contestato con Pst DC3000 (cerchio bianco). Impianti a tacere per FLS2 ha mostrato un crollo del PTI nella regione in cui P. fluorescens era infiltrata (A), come si vede dalla morte cellulare. Impianti di controllo che non sono stati ridotti al silenzio non ha mostrato la morte delle cellule nella zona di sovrapposizione a causa dell&#39;induzione di PTI (B). Frecce rosse indicano la mancanza o la presenza di morte cellulare nella zona di sovrapposizione di infiltrazione. Fotografie sono state scattate 2 giorni dopo le infiltrazioni. Si prega di <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1442/fig1.jpg">cliccare qui</a> per vedere una versione più grande della figura 1. <table border="1"><tbody><tr><td> PTI induttore </td><td> Cellule morte suscitando sfida </td><td> Natura della morte cellulare </td><td> Codice </td></tr><tr><td> Pseudomonas fluorescens 55 </td><td> Pseudomonas syringae pv pomodoro (Pst). DC3000 6 </td><td> ETI </td><td> Pf / DC </td></tr><tr><td> P. putida KT2440 </td><td> Pst DC3000 </td><td> ETI </td><td> Pp / DC </td></tr><tr><td> P. fluorescens 55 </td><td> Pst DC3000 Δ hopQ1-1 6 </td><td> Malattia </td><td> Pf/Q1-1 </td></tr><tr><td> Agrobacterium tumefaciens GV2260 </td><td> P. syringae pv. tabaci 11528R </td><td> Malattia </td><td> Agro / ptab </td></tr></tbody></table> Tabella 1: Combinazioni di indurre la morte delle cellule e PTI-suscitando microbi utilizzati nel test delle cellule morte per PTI. <table border="1"><tbody><tr><td> Ceppo batterico </td><td> Selezione di media </td><td> Finale OD utilizzati nell&#39;esperimento </td><td> Corrispondenti CFU / ml </td></tr><tr><td> P. fluorescens 55 </td><td> KBM ampicillina (100 ug / ml) </td><td> 0,5 </td><td> 1 x 10 9 </td></tr><tr><td> P. putida KT2440 </td><td> KBM ampicillina (100 ug / ml) </td><td> 0,5 </td><td> 1 x 10 8 </td></tr><tr><td> A. tumefaciens GV2260 </td><td> LB Rifampicina (100 ug / ml) </td><td> 0,5 </td><td> 5 x 10 8 </td></tr><tr><td> Pst DC3000 </td><td> KBM Rifampicina (100 ug / ml) </td><td> 0,02 </td><td> 2 x 10 7 </td></tr><tr><td> Pst DC3000 Δ hopQ1-1 </td><td> KBM Rifampicina (100 ug / ml) </td><td> 100 volte diluizione di 0,1 </td><td> 1 x 10 6 </td></tr><tr><td> P. syringae pv. tabaci 11528R </td><td> KBM Rifampicina (100 ug / ml) </td><td> 100 volte diluizione di 0,1 </td><td> 1 x 10 6 </td></tr></tbody></table> Tabella 2: condizioni di coltura e livelli di inoculo utilizzato nel saggio. L&#39;OD e corrispondenti livelli di CFU può variare tra di marca diversa spettrofotometri.

<ol><li>Abramovitch, R. B., Anderson, J. C., Martin, G. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+elicitation+and+evasion+of+plant+innate+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Bacterial elicitation and evasion of plant innate immunity.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 7 (8), 601-60 (2006).</li>
<li>Jones, J. D., Dangl, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+plant+immune+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The plant immune system.</a> Nature. 444 (7117), 323-323 (2006).</li>
<li>Zipfel, C., Robatzek, S., Navarro, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+disease+resistance+in+Arabidopsis+through+flagellin+perception%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Bacterial disease resistance in Arabidopsis through flagellin perception.</a> Nature. 428 (6984), 764-764 (2004).</li>
<li>Oh, H. S., Collmer, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Basal+resistance+against+bacteria+in+Nicotiana+benthamiana+leaves+is+accompanied+by+reduced+vascular+staining+and+suppressed+by+multiple+Pseudomonas+syringae+type+III+secretion+system+effector+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+J%22%5BJournal%5D)">Basal resistance against bacteria in Nicotiana benthamiana leaves is accompanied by reduced vascular staining and suppressed by multiple Pseudomonas syringae type III secretion system effector proteins.</a> Plant J. 44 (2), 348-348 (2005).</li>
<li>Goodin, M. M., Zaitlin, D., Naidu, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nicotiana+benthamiana%3A+its+history+and+future+as+a+model+for+plant-pathogen+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Plant+Microbe+Interact%22%5BJournal%5D)">Nicotiana benthamiana: its history and future as a model for plant-pathogen interactions.</a> Mol Plant Microbe Interact. 21 (8), 1015-1015 (2008).</li>
<li>Wei, C. F., Kvitko, B. H., Shimizu, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Pseudomonas+syringae+pv.+tomato+DC3000+mutant+lacking+the+type+III+effector+HopQ1-1+is+able+to+cause+disease+in+the+model+plant+Nicotiana+benthamiana%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+J%22%5BJournal%5D)">A Pseudomonas syringae pv. tomato DC3000 mutant lacking the type III effector HopQ1-1 is able to cause disease in the model plant Nicotiana benthamiana.</a> Plant J. 51 (1), 32-32 (2007).</li>
</ol>

Morte a base della cellula test può essere usato per determinare il coinvolgimento di un gene nel PTI. Per esempio, la perdita di funzione mutanti per un gene di interesse può essere provata da questo test. Dei 4 combinazioni di induttore e inoculazioni sfida riportati nella tabella 1, è possibile che una sola combinazione può causare un fenotipo in fondo dell&#39;impianto. Abbiamo osservato che le piante a tacere per FLS2 mostrano una ripartizione del PTI nel Pf / DC e Pf/Q1-1 combinazioni di induttore e vaccinazioni sfida (tabella 1). E &#39;essenziale che le condizioni ambientali per il saggio sono il più vicino possibile a quelli descritti nella Parte 3.1. Bassa umidità provoca la morte cellulare per procedere troppo velocemente, rendendo difficile il test di segnare. Se le condizioni descritte nel nostro protocollo non lavorano nel vostro laboratorio, poi provare a modificare il livello di induttore o inoculazione sfida. Un altro parametro che può essere modificato è il divario di tempo tra induzione e di sfida, anche se abbiamo trovato che le lacune più breve tempo ha causato il saggio di abbattere troppo in fretta negli impianti di controllo. Si consiglia di almeno 4-5 impianti essere testato in un esperimento e un fenotipo positivo deve essere ripetuto in almeno 3-4 esperimenti indipendenti.

<table><tbody><tr><td>MES</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP300-100</td><td>Preparare una soluzione madre 1 M, regolare il pH e sterilizzare per filtrazione. Conservare a temperatura ambiente.</td></tr><tr><td>Spettrofotometro UV/Vis per scienze della vita</td><td>Beckman Coulter Inc.</td><td>DU 730</td><td></td></tr></tbody></table>

test per patogeni associati modello molecolare (pamp)-trigger immunità (pti) nelle piante

Assay for Pathogen-Associated Molecular Pattern (PAMP)-Triggered Immunity (PTI) in Plants

Percepire potenziali patogeni nel loro ambiente, le piante usano recettori pattern recognition (PRR) presenti sulla loro membrana plasmatica. PRR riconoscere caratteristiche microbiche conservato chiamato pattern molecolare patogeni associati (PAMPs) e questo porta alla rilevazione PAMP-triggered immunità (PTI), che previene efficacemente la colonizzazione dei tessuti vegetali da parte di non-patogeni 1,2. Il sistema più ben studiata nel PTI è il FLS2-dipendente 3 percorso. FLS2 riconosce il flg22 PAMP che è un componente di flagellina batterica. Agenti patogeni di successo possiedono fattori di virulenza o effettori che possono sopprimere PTI e permettere al patogeno di causare malattie 1. Alcune piante, a loro volta in possesso di geni di resistenza che rilevano effettori o la loro attività, che porta a effettrici-triggered immunità (ETI) 2. Descriviamo una morte saggio basato su cellule di PTI modificato da Oh e Collmer 4. Il test è stato standardizzato in N. benthamiana, che viene utilizzato sempre più come sistema modello per lo studio delle interazioni pianta-patogeno 5. PTI è indotta da infiltrazione di un non-patogeno ceppo batterico in foglie. Sette ore dopo, un ceppo batterico che causa la malattia sia o che attiva ETI è infiltrato in una zona di sovrapposizione la zona di infiltrazione originale. PTI indotta dalla infiltrazione prima è in grado di ritardare o impedire la comparsa di morte cellulare a causa delle infiltrazioni seconda sfida. Al contrario, l&#39;aspetto della morte cellulare nella zona di sovrapposizione di inoculazione indica la ripartizione dei PTI. Quattro diverse combinazioni di induttori del PTI e vaccinazioni sfida sono stati standardizzati (Tabella 1). Il test è stato testato in materia di non tacere N. piante benthamiana che serviva come il controllo e le piante a tacere per FLS2 che sembravano destinate a essere compromessi nella loro capacità di sviluppare PTI.

Una morte saggio basato su cellule di PTI in piante di Nicotiana benthamiana è descritto.

Test per patogeni associati modello molecolare (PAMP)-trigger Immunità (PTI) nelle piante

Per percepire i potenziali patogeni nel proprio ambiente, le piante utilizzano recettori di riconoscimento dei pattern (PRR) presenti sulle loro membrane plasmatiche. I PRR riconoscono...

Ciao, sono Suma TI del laboratorio di Greg Martin presso l'Istituto di Ricerca sulle Piante Voice Thompson. Oggi vi mostreremo un procedimento per un saggio basato sulla morte cellulare per l'immunità indotta da PAM, o PTI. Utilizziamo questo procedimento nel nostro laboratorio per verificare il coinvolgimento di un gene nella PTI.Iniziamo. Avvii la procedura coltivando Nicotiana ANA fino a quando non raggiungono circa sette settimane di età. Da quattro a cinque giorni prima dell'inizio.Il saggio dell'immunità innescata da PAM o PTI. Potare le piante per rimuovere tutti i rami ascellari e i fiori. Provare a rimuovere i rami ascellari subito dopo la loro comparsa per rendere le piante più facili da gestire.Dopo aver preparato le piante, procedere alla coltivazione dei batteri. Questa procedura utilizza batteri non patogeni per indurre l'immunità vegetale prima di una seconda inoculazione con batteri sfida; avviare la crescita di tutti i batteri impiegati nel saggio. Allo stesso tempo, utilizzare stocchi glicerolati congelati dei batteri pseudomonas per ciascun ceppo batterico di pseudomonas.Spargere una piccola quantità di batteri al centro di una piastra KBM contenente l'antibiotico appropriato e incubare la piastra a 30 gradi Celsius per circa 18-24 ore. Per l'agrobatterio, utilizzare una piastra fresca precedentemente preparata per avviare una coltura liquida in due millilitri di lb. Far crescere in agitazione durante la notte a 30 gradi Celsius il giorno successivo.Aggiungere da 150 a 200 microlitri di terreno liquido KBM nelle piastre contenenti i batteri pseudomonas. Distribuire i batteri su tutta la superficie della piastra. Utilizzando un contagocce sterile.Rimettere le piastre nell'incubatrice per altre 20-24 ore. Agrobacterium. Avviare una coltura secondaria in circa 5-10 millilitri di LB contenente 20 micromolari di acetosiringone.Coltivare la coltura durante la notte a 30 gradi Celsius con agitazione. Dopo aver preparato i batteri, procedere alla preparazione delle piante per il saggio il giorno precedente l'esecuzione del saggio PTI. Dopo aver preparato i batteri, trasferire le piante in una stanza a 22-24 gradi Celsius con un'umidità relativa di circa il 35-40% e luce costante.Successivamente, utilizzare un pennarello nero spesso per tracciare cerchi sulle foglie. Scegliere foglie ben espanse ed evitare le foglie più vecchie o quelle che risultano dure o spesse al tatto. Evitare di segnare le porzioni inferiori della foglia.I cerchi devono avere un diametro di almeno 1,5 centimetri e se ne possono marcare da due a quattro per foglia. I cerchi devono essere ben distanziati e, preferibilmente, non devono attraversare una grossa venatura. Iniziare il saggio PTI raccogliendo i batteri utilizzati nell'induzione della PTI.Il ceppo di Pseudomonas utilizzato dovrebbe aver formato un tappeto batterico indicativo di una buona crescita. Raccoglierlo dalla piastra raschiando con un bastoncino di legno sterile lungo e risospendere in circa 20-25 millilitri di soluzione di cloruro di magnesio 10 millimolare per la centrifugazione di Agrobacterium.Coltivare per raccogliere le cellule e risospendere in circa 20-25 millilitri di cloruro di magnesio 10 millimolare più MES a pH 5,6, ripetere la centrifugazione e quindi risospendere nuovamente in circa 20-25 millilitri della soluzione di cloruro di magnesio più MES. Ora i batteri Pseudomonas e Agrobacterium induttori sono risospesi.Misurare la densità ottica di tutte e tre le colture a una lunghezza d'onda di 600 nanometri. Regolare le ODS diluendo le cellule con cloruro di magnesio per il *Pseudomonas* e con MES più cloruro di magnesio per l'*Agrobacterium*. I valori finali richiesti di OD si trovano nel protocollo scritto allegato.Un volume totale di 25 millilitri di coltura batterica è sufficiente per inoculare circa da 40 a 50 punti. Iniziare ora il saggio infiltrando gli induttori PTI nei cerchi precedentemente segnati sulle foglie, utilizzando una siringa da un millilitro senza ago. Registrare l'ordine in cui le piante sono state infiltrate e l'ora esatta in cui è iniziata l'infiltrazione dopo l'induzione.Procedere all'inoculazione di sfida diverse ore dopo l'inoculazione induttiva. Raccogliere i ceppi batterici necessari per l'inoculazione di sfida come precedentemente mostrato per i ceppi di pseudomonas induttivi. Nuovamente, misurare la DO e aggiustare la concentrazione delle colture in base al protocollo GR allegato.Iniziare l'inoculazione di sfida sette ore dopo l'infiltrazione dell'induttore. Utilizzare le seguenti combinazioni di induttore e patogeno. Scegliere un punto sulla periferia del primo cerchio di inoculazione come centro del secondo cerchio di inoculazione.Eseguire l'infiltrazione di sfida nello stesso ordine delle piante utilizzato per l'induzione. Se su una foglia sono presenti più punti, assicurarsi che le infiltrazioni non si sovrappongano. Infine, piastrare diluizioni seriali di tutte le colture utilizzate nel saggio su piastre di KBM o LB contenenti gli antibiotici appropriati.Due giorni dopo l'inoculazione di sfida, è possibile iniziare a valutare la risposta di PTI. Due giorni dopo le inoculazioni di induzione e di sfida, osservare la comparsa di morte cellulare dovuta all'immunità attivata dall'effettore (ETI) nelle zone inoculate con PST DC 3000. La morte cellulare all'interno dell'area sovrapposta di infiltrazione indica un cedimento della PTI e deve essere registrata come fenotipo positivo. Da quattro a cinque giorni dopo le inoculazioni di induzione e di sfida, osservare la comparsa di morte cellulare dovuta alla malattia nelle zone inoculate con il mutante DC 3000 hop Q1 o PS back high. Cercare il cedimento della PTI, indicato dalla morte cellulare causata dalla malattia nell'area sovrapposta di infiltrazione. Continuare a osservare le piante finché quelle non compromesse per PTI iniziano a mostrare morte cellulare nell'area sovrapposta di infiltrazione.Le piante silenziate per FLS2 mostrano un'alterazione della PTI due giorni dopo l'inoculazione con la combinazione PFDC. Si osserva la morte cellulare nella zona di sovrapposizione, indicativa del collasso della PTI nei controlli non silenziati per alcun gene. Anche queste ultime sono state inoculate con la combinazione PFDC ed esaminate due giorni dopo l'esecuzione del saggio: la morte cellulare indotta dalla sfida è visibile all'esterno, ma non all'interno, della zona di sovrapposizione, a causa di una risposta PTI normale.Abbiamo appena mostrato come eseguire un saggio basato sulla morte cellulare per l'immunità innescata da PAMP o PTI durante questa procedura. È importante ricordare di mantenere le piante nelle condizioni ambientali che raccomandiamo. Livelli più elevati di umidità avrebbero un effetto negativo sulle piante e farebbero procedere il saggio più rapidamente.Ecco fatto. Grazie per aver guardato e buona fortuna con i vostri esperimenti.

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