Name: 분리 및 조혈 줄기 세포의 이식 (HSCs) (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2007-02-25T00:00:00.000+00:00
Duration: 20 min 38 s
Description: 학습하세요 조혈 줄기 세포 분리 및 이식 기법을 마우스 모델에서. PBS와 2% 혈청을 사용한 멸균 및 해부 과정을 통해 세포 정화와 꼬리 정맥 주사법을 익힐 수 있습니다.

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<p class="jove_title"> 총 골수 준비 </p><ol><li> 네 B6 생쥐는 희생과 tibias, 대퇴골, 허리와 척추를 얻을 해부하고 있습니다. </li><li> 해부 동안 팔다리와 뼈는 PBS 2퍼센트 FCS 열 inactivated에 보관 (옵션 2mM EDA - 해부 매체를.) </li><li> 깨끗한 뼈가 해부 매체에 박격포와 유봉과 함께 깔린 있습니다. 그것을 할 효율적인 방법은 한 번에 다음 각 마우스의 tibias, 대퇴골과 엉덩이, 2 쪽이를 부술 것입니다. </li><li> 각 마우스에서 얻은 세포 혼합물은 별도의 보관 및 50ml 팔콘 튜브로 40μm 필터를 통해 필터링됩니다. 이런 방식으로, 각 튜브는 마우스, 2 쪽이에서 얻은 혼합물의 절반의 모든 다리 뼈 밖으로 얻은 세포 혼합되어 있습니다. 이 단계에서는 필터는 뼈 파편을 구분하는 데 사용됩니다. </li><li> 그것은 두 번 (NO 골수와) 뼛조각은 흰색을 얻기 위해 다리의 뼈를 부수기 위해서는 일반적으로 권장되고 척추 조각은 2 또는 3 번. </li><li> 그들이 균형을 이룰 수있는 튜브를 채워, 5 분 1200rpm을 스핀. </li><li> 뜨는을 기음과 튜브 랙 (이 단계는 클럼프 형성과 세포의 손실을 최소화하기 위해 각 원심 분리 후 중요합니다)에 튜브를 드래그하여 펠렛을 푸세요. 이 혈통 고갈을하고있다면 한 ML PBS 2퍼센트 FCS (지금부터 NO EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산))에서 각 튜브를 Resuspend,하거나 당신을 위해 편리하게 어떤 볼륨에 있습니다. </li></ol><p class="jove_title"> 리니지 고갈 </p><ol><li> 이 절차는 매우 차별화된 세포를 제거하고 세포의 매우 이질적인 인구를 얻을, 줄기 및 전구 세포에 대한 풍부하게 할 수 있습니다. 당신은 HSC를 정렬하는 경우,이 단계는 크게 따라서 정렬 시간을 절감하고 귀하가 높은 숫자를 얻을 수 있도록 마우스의 높은 숫자 HSC를 정렬 있도록 셀 정렬을 통해 갈 필요 세포의 수를 감소 하나의 분류에 HSC. </li><li> 나중에 정렬하려고하는 경우 (흠없는 및 Sca1, C - 키트, CD48, Flk2 단일 색상 컨트롤) 컨트롤을 정렬을위한 세포 혼합물 (나는 보통 각 튜브의 조금을)를 50μl를 가져가라. </li><li> 린 칵테일 30ml/tube를 추가합니다. 리니지 칵테일은 불행히도 실험실에서 실험실에 조금 변화 항체 다양한 포함되어 있습니다. 스캐든 연구실에서 우리는 B220 Gr1에 대한 biotinilated 항체, Ter119, CD4, CD8, 인 경우에는 3 번 CD를 사용합니다. 얼룩 그들의 최종 희석은 1:700입니다. </li><li> 와동 신속하게 혼합, 4 15 분 부화 ° C. </li><li> 부화하는 동안 열 아래에있는 자석과 용출 15ml 튜브에 열을 준비. 데가스 일부 PBS는 steriflip 필터 (당신은 진공 흡인에 의한 PBS의 표면을 향해 이동 작은 공기 방울이 나타납니다)을 사용하고, 각각의 컬럼에 3ml degassed PBS를 적용하여 열 평형. </li><li> 열 흐름에 대한 1ml/5min이므로 사용할 준비가 열을 가지고 약 15 분 소요됩니다. </li><li> 부화의 끝에, 튜브를 작성하여 1200rpm에서 5 분 스핀 다운을 PBS 2% FCS를 추가합니다. </li><li> 뜨는을 기음, 알약을 풀어 1 ML / PBS를 degassed 튜브 resuspend. </li><li> 나중에 정렬하는 경우 (15ml, 각 튜브의 비트) 단일 색상 얼룩 CTRL 리니지 총 골수를 꺼내. </li><li> 신속 streptavidin 비즈 30ml/tube, 소용돌이 믹스, 4 15 분 부화 ° C. 추가 </li><li> 부화의 끝에, 2 ML / degassed PBS의 튜브를 추가합니다. 열 아래에 새 컬렉션의 튜브를 넣어, 그리고 40μm 필터를 통해 필터링, 컬럼 각 서스펜션을 적용합니다. </li><li> 그것을 씻어 각 튜브에 degassed PBS의 다른 세 ML을 추가합니다. 컬럼이 비어되면 다시 같은 40μm 필터를 사용하여 적용됩니다. </li><li> eluate은 혈통이 소진 세포 혼합, 줄기와 progenitors 세포에 대한 풍부하게 이기종 인구가 포함되어 있습니다. 수영장이 튜브로 4 튜브의 내용. 1500rpm에서 5 분 스핀. </li><li> 뜨는을 대기음. 펠렛은 주로 흰색 또는 흰색해야합니다. 나중에 정렬하는 경우에는 산탄을 풀어 1ml 총 PBS 2% FCS에서 그들을 함께 resuspend 그렇지 않으면 당신을 위해 편리한 어떤 볼륨에 resuspend. </li></ol><p class="jove_title"> LKS 또는 장기 HSC 정렬 </p><ol><li> 고갈 단일 색상 얼룩 CTRL (15ml) 혈통 꺼내. 이것은 당신의 혈통 고갈의 효율성을 평가할 수 있습니다. </li><li> 정렬 셀 혼합물은 15ml 튜브에 물들어있다. </li></ol><p class="jove_content"> 항체 추가 : </p><p class="jove_content"><table border="0"><tbody><tr><td> SCA PE - Cy5.5 </td><td> 1 : 100 </td><td> 10ml </td></tr><tr><td> 키트 APC </td><td> 1:100 </td><td> 10ml </td></tr><tr><td> SA PE - Cy7 </td><td> 1:500 </td><td> 2ml </td></tr></tbody></table></p><p class="jove_content"> 장기 HSC를 정렬하려면, 또한 추가 : </p><p class="jove_content"><table border="0"><tbody><tr><td class="jove_content"> CD48 FITC </td><td class="jove_content"> 1:1000 </td><td class="jove_content"> 1ml </td></tr><tr><td class="jove_content"> Flk2 PE </td><td class="jove_content"> 1:200 </td><td class="jove_content"> 5ml </td></tR&gt; </tbody></table></p><p class="jove_content"> 또한, 하나의 얼룩은 절개와 총 골수 가계 자국 후 별도로 보관 총 골수를 사용하여 컨트롤을 준비합니다. 이러한 stainings은 외과 튜브에 직접 할 수 있습니다. </p><p> <em class="jove_content">어둠 속에서 수 있는지 확인하십시오!</em> </p><ol><li> 와동 빨리 ° 20~30분에 대한 C, 다시 혼합 반은 방법을 통해 4 믹스와 부화. </li><li> 항체의 초과 멀리 씻어, 1,500 rpm으로 5 분 PBS 2% FCS와 스​​핀으로 튜브를 입력합니다. </li><li> 뜨는 제거, 모든 알약을 resuspend 및 필터 모자 새로운 외과 튜브로 이동합니다. 그것은이 필터를 통과하기 위해 세포를 얻으려면 시간이 걸릴 수도 있습니다, 그리고 그것은 필터를 세척하고 세포의 손실을 최소화하기 위해 나중에 PBS 좀 더 적용하는 것이 중요합니다. 이 단계는 분류기의 막히는 것을 방지하는 것이 필요합니다, 이것은 모든 세포 분류기 사용자의 최악의 악몽이다. </li><li> 셀 정렬 시설에 세포를 나눠주고하면, 또한 전지를 수집합니다 PBS 10% HI FCS와 튜브를 준비했는지 확인하십시오. </li><li> 당신은 LKS 세포를 정렬하는 경우, 당신은 HSC와 multipotent progenitors을 repopulating 장기와 단기를 포함하는 이기종 인구를 얻을 것이다. 평균 수확량은 4 생쥐에서 300,000 LKS 있습니다. </li><li> 당신은 또한 CD48 항체와 Flk2을 사용한 적이있다면, 당신은 장기 HSC, 단기 HSC와 MPP의 각 인구를 분리할 수 있습니다. LT - HSC는 가장 드문 인구입니다. 평균 수확량은 4 생쥐에서 60,000에 50,000에 대한 세포입니다. </li></ol>

분리 및 조혈 줄기 세포의 이식 (hscs)

Isolation and Transplantation of Hematopoietic Stem Cells (HSCs)

분리 및 조혈 줄기 세포의 이식 (HSCs)

<p>저는 Christina Ceso입니다. David's Den 연구실의 박사후 연구원으로 조혈모세포를 연구하고 있습니다. 오늘은 장기 재구성 조혈모세포를 정제하여 마우스에 이식하는 과정을 살펴보겠습니다.</p><p>먼저 마우스에 알코올을 분무하여 소독하고, 털이 해부 과정에 방해되지 않도록 합니다. 해부 시에는 2% serum이 포함된 PBS를 사용합니다. 등 쪽 피부를 절개한 후, 조직이 드러나도록 피부를 양옆으로 당겨 벌립니다.</p><p>경골을 분리하기 위해, 핀셋으로 경골을 잡습니다. 무릎 위의 힘줄을 절단하고 무릎 아래의 근육들을 절단한 후, 경골이 사지의 나머지 부분과 더 이상 연결되지 않도록 무릎 부위를 절단하고 잡아당겨 분리합니다. 그런 다음 경골을 거꾸로 잡고 가위로 발 부분을 경골에서 분리하여 대퇴골을 얻습니다.</p><p>대퇴골 주변의 근육을 절개한 후, 대퇴골을 고관절에서 탈구시킵니다. 고관절을 분리하기 위해 생쥐 꼬리 쪽 고관절 뼈 주변의 근육을 절개하고, 고관절을 몸체에서 끌어내어 분리합니다. 척추를 분리하기 위해, 등의 시작 지점에 최대한 가깝게 꼬리를 절단한 다음, 복막이 절개되지 않고 장기가 손상되지 않도록 척추에 최대한 밀착하여 척추의 양측과 하단을 절개합니다.</p><p>먼저 메스를 사용하여 뼈를 긁어내며 뼈에서 근육을 제거하는 1차 세척 과정을 수행합니다. 메스는 대퇴골, 고관절 및 척추를 세척하는 데 유용합니다. 경골을 세척하기 위해서는 핀셋으로 경골을 잡고, 핀셋을 이용해 가능한 한 많은 조직을 제거합니다.</p><p>근육에서 뼈를 완전히 분리하기 위해 클린 와이프(clean wipe)를 사용하여 2차 세척을 수행하며, 경골, 대퇴골 및 고관절을 세척하는 데 F 와이프를 사용합니다. 이것이 세척된 뼈의 모습입니다. 세척 후, 상단에 필터가 있는 50 mL 튜브를 사용하여 뼈를 막자사발로 옮깁니다.</p><p>섹션 배지를 첨가하고 1차 골쇄쇄 과정을 위해 뼈를 분쇄합니다. 용액 내로 가능한 한 많은 a-style을 방출하고 덩어리를 줄이기 위해 혼합물을 파이펫팅합니다. 필터를 통해 혼합물을 튜브로 옮겼으며, 이것이 1차 분쇄 후의 골편 모습입니다.</p><p>따라서 골편에 박리액을 더 추가하고 다시 한번 빠르게 세척합니다. 필터를 통해 셀린 혼합물을 튜브로 옮겼으며, 이 시점에서 남은 골편은 하얀색이며 골수가 더 이상 남아있지 않습니다. 튜브는 PBS 2% serum으로 채워져 있으며, 원심분리기에서 균형을 맞추기 위해 모든 튜브의 무게를 동일하게 하고, 가능한</p>

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Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

유동세포계측법의 골수 조혈 progenitors의 유통뿐만 아니라 효율적으로 분리 고도 정화 조혈 줄기 세포 (HSCs)를 분석하는 방법을 설명합니다. 분리 절차는 본질적으로 세포 및 분자 연구를위한 HSCs를 정화 정렬 C-키트 + 세포와 세포의 자성 농축에 근거한다.

Murine 조혈 줄기 세포와 리니지 - 헌신 Progenitors의 Phenotypic 분석 및 절연

이 프로토콜의 목표 nonhuman 영장류 CD34 분리 하는+ 세포 액된 골, 유전자-수정 lentiviral 벡터와이 셀 하 고 주입 헌 호스트에 대 한 제품을 준비에서. 총 프로토콜 길이 약 48 h입니다.

준비 및 Nonhuman 영장류 조 혈 줄기와 조상 세포의 유전자 수정

여기서, 우리는 피더-및 제노프리 조건에서 인간 다능성 줄기 세포로부터 혈생 내피를 정밀하게 형성하는 프로토콜을 제시한다. 이 방법은 치료 화합물에 대한 질병 모델링 및 스크리닝에 광범위한 응용 프로그램을 가질 것이다.

피더 및 제노 프리 정의 상태에서 인간 다능성 줄기 세포에서 혈생 내피 분화

이 프로토콜은 조혈 줄기 및 전구 세포를 생성하는 전사 인자 GATA2, GFI1B 및 FOS의 발현을 강제함으로써 인간 진피 섬유아세포에서 혈생 프로그램의 유도를 입증한다.

전사 요인의 강제 표현에 의한 인간 섬유아세포의 혈생 재프로그래밍

이 프로토콜은 풍부한 지방산, 콜레스테롤, 사이토카인의 낮은 농도 및 저산소증을 사용하여 골수 마이크로 환경을 모방하여 체외에서 정지한 인간 조혈 줄기 세포의 유지를 가능하게 합니다.

정지 인간 조혈 줄기 세포를 유지하는 배양 방법

본 프로토콜은 생체 내에서 유전자 편집 세포의 강력한 생착을 위한 최적화된 조혈 줄기 및 전구 세포(HSPC) 배양 절차를 설명합니다.

유전자 치료 애플리케이션을 위한 조혈 줄기 및 전구 세포의 CRISPR/Cas9 유전자 편집

우리는 Hoxb5 리포터 시스템을 사용하여 장기 조혈 줄기 세포(LT-HSC) 및 단기 HSC(ST-HSC)의 분리를 위한 단계별 프로토콜을 제시합니다.

장기 및 단기 조혈모세포의 분리 방법

여기에 제시된 것은 생체 외 폴리비닐 알코올 기반 확장을 사용하여 마우스 조혈 줄기 세포 배양을 시작, 유지 및 분석하는 프로토콜과 렌티바이러스 형질도입 및 전기천공을 통해 유전적으로 조작하는 방법입니다.

<em>Ex Vivo (생체 외</em> ) 폴리비닐 알코올 기반 배양에서 마우스 조혈 줄기 세포의 확장 및 유전자 조작

여기서, 우리는 손상된 조혈 및 면역 체계의 재건을 위해 치료용 조혈 줄기세포/전구 세포를 수확하기 위해 뼈 형태 유전 단백질-2 로딩 젤라틴 골격에 의해 유발되는 생체 내 골 오가노이드를 확립했습니다. 전반적으로 이 접근법은 세포 치료를 위한 유망한 세포 공급원을 제공할 수 있습니다.

치료용 조혈 줄기세포/전구세포를 채취하기 위한 In vivo Osteo-organoid 접근법

여기에서는 쥐 뼈, 골수, 흉선 및 단일 세포 다생물체학(single-cell multiomics)과 호환되는 인간 흉선 조직에서 기질 세포를 분리할 수 있는 프로토콜을 제시합니다.

조혈 장기에서 기질 세포 분리(Stromal Cell Isolation from Hematopoietic Organs)

대퇴골 내 주사는 세포를 골수강에 직접 배치하여 소수의 조혈모세포 및 전구세포(HSPC)를 생착할 수 있습니다. 여기에서는 면역 결핍 마우스에 인간 HSPC를 대퇴골 내 주사하는 실험 프로토콜에 대해 설명합니다.

면역저하 마우스에 인간 조혈모세포와 전구세포의 대퇴골내 주입 

학습하세요 조혈 줄기 세포 분리 및 이식 기법을 마우스 모델에서. PBS와 2% 혈청을 사용한 멸균 및 해부 과정을 통해 세포 정화와 꼬리 정맥 주사법을 익힐 수 있습니다.

분리 및 조혈 줄기 세포의 이식 (HSCs)

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