Name: ラット間葉系幹細胞（MSC）とMSCを派生シングルコロニーの分離の分離と濃縮 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-03-22T17:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 18 s
Description: 学ぶラット由来間葉系幹細胞の磁気細胞分選による分離・濃縮とフローサイトメトリーによる表面マーカー確認、単一コロニー分離法。この手法は再生医療研究に応用可能です。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

作品は、国立衛生研究所（R01GM079688、R21RR024439、およびR21GM075838）、国立科学財団（CBET 0941055）、およびMSU財団によって部分的にサポートされていました。

1。ラットMSCの単離間葉系幹細胞は、以前は1で説明した6〜8週齢のSprague - Dawley雌ラット、2から分離された。隔離されたMSCは、プラスチック表面に付着し、容易にin vitro培養中に展開することができます。 <ol><li>動物は、麻酔室に入れ、約5分間麻酔した。麻酔中は、点滅して、呼吸と運動の速度を観察。それは運動を停止すると点滅速度が頻繁になった直後にチャンバーから動物を取り外します。 </li><li>操作ステーションで動物を下に置くと、頚椎脱臼により動物を殺す。バック手足から大腿骨と脛骨を切って、皮膚と筋肉を取り除く。 </li><li>数秒と1 × D - PBSに転送するためにイソプロパノール70％で解剖大​​腿骨と脛骨を置く。 </li><li>バイオセーフティキャビネットでは、大腿骨と脛骨をDMEMを含む10 cmディッシュに移した。それぞれの骨は、その後、ピンセットで開催され、両端はハサミで切開した。 3ミリリットルシリンジに22G針を添付し、DMEMでそれを埋める、そして骨の一つ開放端に針を挿入して50ミリリットルチューブに骨髄をフラッシュします。 〜3回、各骨を繰り返します2。すべての髄が得られたときに、細胞を再懸濁し、骨の破片と血液の凝集物を除去するために70μmセルストレーナーを通して細胞懸濁液を渡します。 </li><li> 200グラムで細胞を、5分間、4℃の回転を停止し、吸引により上清を取り除く。 25ミリリットルのMSC培地で再懸濁し、細胞（DMEM、10％FBS、1％ペン連鎖球菌を含む）。 10mlの細胞懸濁液は、2つの皿の合計のために各10cmの培養皿に播種した。 1〜2週間で37℃、5％CO 2インキュベーターで培養皿をおいてください。培地は2〜3日ごとに変更されました。 </li></ol> 2。ラットMSCの濃縮表面タンパク質の数は、CD54、CD90、CD73、CD105やCD271 3月5日を含めて、MSCを豊かにするために使用されている。私たちの研究では、磁気細胞選別によって、MSCを豊かにするためのマーカーとしてCD54とCD90を使用していました。 <ol><li>細胞がコンフルエントに約80％に達したとき、培地を吸引し、各シャーレに4〜5ミリリットルトリプシン- EDTAを加える。インキュベーターに戻し皿を置き、細胞の剥離を可能にするために約5分間インキュベートする。細胞が切り離された後、トリプシンを不活化するために培養液の同量を追加します。 5分間、4℃、200グラムで15ミリリットルチューブとスピンの細胞下に細胞懸濁液を収集する。 </li><li>次の手順では、BD IMagnetを用いた細胞分離のためのマニュアルに従って、2つの表面マーカーCD54とCD90でMSCを豊かにする方法について説明します。細胞ペレットを20万細胞/ mlで細胞を染色バッファー（1X D - PBSで3％の熱不活化FBS）中に再懸濁した。ビオチン化CD54抗体（0.25μg百万分の一の細胞）とビオチン化CD90抗体（万個の細胞あたり0.15μg）を添加し、細胞懸濁液を穏やかに混合した。 15分間氷上でインキュベートした後、標識された細胞を1X BD IMAGバッファの過剰量で洗浄した。標識された細胞を5分間、4℃200グラムでスピンダウンされました。 </li><li>渦BD IMAGストレプトアビジン粒子は完全に、すべての10万個の細胞に対して40μlの粒子を追加してください。徹底的に標識された細胞と粒子を混合し、6〜12で細胞をインキュベート℃で30分間。これにより、ストレプトアビジン粒子はそれぞれ表面タンパク質CD54とCD90にバインドされているビオチン化抗CD54および抗CD90に結合することができます。 </li><li>インキュベーション時間の間に、正の分数を収集するための丸底試験管にラベルを付けます。インキュベーション後、1 × BD IMAGバッファを20万細胞/ mlにラベリングのボリュームをもたらすと正のフラクションコレクションチューブに標識された細胞を移す。 BDのIMagnetにポジティブフラクションチューブを配置し、6分間滞在させ、その後も、BDのIMagnet上で正のフラクションチューブにガラスパスツールピペットで上清を取り除く。 </li><li> BDのIMagnetからポジティブフラクションチューブを外し、氷の上に置きます。 1ミリリットルの氷冷1 × BD IMAGバッファと穏やかに混合して再懸濁し、細胞を追加。 BD IMagnetに戻ってチューブを置き、それが2〜4分の滞在ができます。新しいガラスパスツールピペットで上清を取り除きます。 2.5つのより多くの時間で説明するように洗浄を繰り返します。 </li><li> 、培養培地中にBD IMagnetを再懸濁します細胞からチューブを外しシード細胞とフローサイトメトリー用の10cmディッシュを維持用の75センチメートル2フラスコ。 </li></ol> 3。フローサイトメトリーによる表面マーカーの発現の検証フローサイトメトリー分析は、我々が明示CD54とCD90を得られる細胞を確認するために実施した。 HSCマーカーCD45はMSCが造血幹細胞が枯渇していたことを確認するために使用されていました。 <ol><li>細胞がコンフルエント〜80％になると、トリプシン- EDTAで細胞をトリプシン処理し、15ミリリットルチューブに細胞を集める。 ° Cで5分間、細胞を収集するために200グラム、4で遠心分離します。 </li><li>上清を吸引していたかつて1X D - PBSでH細胞。 5の最終濃度が約10万細胞/ mlにし、氷上で細胞を維持する細胞の染色バッファーに再懸濁し細胞（1 × D - PBS、2％FBS、0.05％アジ化ナトリウムを含む）。 （。、2アイソタイプコントロール的なIgG2a、。。3アイソタイプコントロールIgG1を、4 CD45、5 CD54、。。6 CD90 1細胞のみ）6つのラベルの付いた試験管に分注し100μlの細胞懸濁液。 </li><li> （：;：0.5μg百万分の一の細胞、CD54：0.25μg百万分の一の細胞、CD90：CD4520μlの百万分の一の細胞IgG2aおよびIgG1の0.15μg百万分の一の細胞）を適切な濃度でアイソタイプコントロールおよび一次抗体を追加して4℃でインキュベートする30分。 </li><li>二回して、100μlの細胞の染色バッファーで細胞を再懸1X D - PBSで細胞を洗浄する。 SA - PE（ストレプトアビジン - フィコエリスリン、百万個の細胞あたり0.15μgを使用）を追加し、4℃でインキュベートCの暗所で30分間。 </li><li>倍1X D - PBSで標識した細胞を洗う。 400μlの細胞の染色バッファーで細胞を再懸濁し、フローサイトメトリー分析のためにファルコンチューブに移す。 </li></ol> 4。 MSCを派生シングルコロニーの分離 MSCは、異なるセルの形状、成長率だけでなく、分化能6の異なる亜集団から構成される不均一な集団である。しかし、すべての亜集団は、既知のMSCマーカーを発現し、従ってそれはこれらの亜集団を分離するためのマーカーを使用することは不可能です。したがって、我々は単一細胞によって形成されたコロニーな異なる亜集団を、分離するクローニングシリンダーを適用する。 <ol><li> 10 cmディッシュあたり約50〜100個の細胞で細胞を​​プレート。 1〜2週間で37℃、5％CO 2インキュベーター中でインキュベートする。この期間中、倒立顕微鏡でよく分離したコロニーを調べる。コロニーが十分に大きいサイズを（より各コロニーにおける100以上の細胞）に到達したら、皿の底にあるシャーピーとコロニーをマーク。マークされるコロニーを選択するときに、厳選されたGoogle Earthでも周囲のコロニーがないことを確認してください。 </li><li>培地を吸引し、1XのD - PBSで一度皿を洗う。滅菌ピンセットで滅菌クローニングシリンダーをピックアップし、優しく著しいコロニーの周りに置きます。すべてのマークされたコロニーは、上に配置、クローニングシリンダーになるまでこれを繰り返します。選んだコロニーは遠く離れてお互いからすべてのクロー​​ニングシリンダーが1つしかコロニーが含まれているようなものであるべきである。 </li><li>各クローニングシリンダーに100μlのトリプシン- EDTAを追加し、約5分間インキュベーターに皿を戻す。 5分後、彼らは切り上げかどうかを確認するために顕微鏡下で細胞を確認してください。細胞が持ち上げているときは、トリプシンを不活化するために培養液の同量を追加します。 200μlのマイクロピペッタで細胞懸濁液を混和し、3ミリリットル温めておいた培地を含む60ミリメートルディッシュに細胞懸濁液を移す。適切に皿にラベルを付け、インキュベーターにそれらを戻す。これから数日間にわたって形態学的変化を追跡。 </li></ol> 5。代表的な結果ラットMSCの分離のための部分で説明されているプロトコルによると、プラスチックの接着MSCは、めっき後の翌日に見えるはずです。細胞が増殖し続けているため、コンフルエントな細胞は、図1Aに示すように細胞のようになります。細胞がコンフルエント〜80％（図1B）に到達すると、継代培養を行うことができる。サブカルチャーの間に、トリプシン- EDTAは、細胞と持ち上げ細胞を分離するために使用され、図1Cに示すように小さくし、丸いです。 <img src="/files/ftp_upload/1852/1852fig1.jpg" alt="図1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図1"> 図1。ラットMSCの位相コントラスト像 。 （A）コンフルエントのMSC。細胞の大多数は、紡錘状または星状です。 （B）のMSC約80％コンフルエント。 （C）トリプシン処理後の細胞は小さく、丸い浮き。 一度のMSCは、フローサイトメトリー分析は表面マーカーの式を検証するために行われる、磁気細胞ソーティングによって濃縮される。濃縮が良ければ、細胞はHSCマーカーCD45（図2）に対してMSCマーカーCD54とCD90が陰性に対して陽性染色を示す必要があります。アイソタイプコントロールIgG2aおよびIgG1を陰性コントロールとして使用されています。 <img src="/files/ftp_upload/1852/1852fig2.jpg" alt="図2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図2"> 図2。表面マーカーのためのMSCのフローサイトメトリー分析。MSCはIgG2aの（アイソタイプコントロール1）、IgG1の（アイソタイプコントロール2）、CD45、CD54およびCD90に対する抗体で標識した。 MSCはCD54とCD90ではなくCD45を表明した。 細胞は適切なクローン密度で播種されると、コロニーは単一の細胞から立ち上がる必要があります。図3Aは、単一のセルによって形成されたコロニーを表します。クローニングシリンダーは、別々に培養することができるコロニー由来するコロニーと細胞を分離するために使用することができます。図3Bおよび3Cは、2つの個々のコロニーに由来する細胞を表しています。コロニー1から由来する細胞は、コロニー2由来の細胞のに対し（図3B）のようなスピンドルですラウンド（図3C）です。 図3。 MSCおよび単一コロニー由来の細胞によるコロニー形成。MSCは、クローン密度のフォームの個々のコロニーで培養。これらのコロニーは別々に培養することができるクローニングシリンダーと異なるコロニー由来の細胞で区切ることができます。クローン密度で播種したとき（A）代表的なコロニーは、MSCによって形成。 （B）1つのコロニーに由来する細胞を紡錘状。 （C）円形細胞が別のコロニーから派生。

<ol><li>de Hemptinne, I., Vermeiren, C., Maloteaux, J. M., Hermans, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+glial+glutamate+transporters+in+adult+mesenchymal+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurochem%22%5BJournal%5D)">Induction of glial glutamate transporters in adult mesenchymal stem cells.</a> J Neurochem. 91, 155-166 (2004).</li>
<li>Porter, R. M., Huckle, W. R., Goldstein, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+dexamethasone+withdrawal+on+osteoblastic+differentiation+of+bone+marrow+stromal+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biochem%22%5BJournal%5D)">Effect of dexamethasone withdrawal on osteoblastic differentiation of bone marrow stromal cells.</a> J Cell Biochem. 90, 13-22 (2003).</li>
<li>Chamberlain, G., Fox, J., Ashton, B., Middleton, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Concise+review%3A+mesenchymal+stem+cells%3A+their+phenotype%2C+differentiation+capacity%2C+immunological+features%2C+and+potential+for+homing%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Concise review: mesenchymal stem cells: their phenotype, differentiation capacity, immunological features, and potential for homing.</a> Stem Cells. 25, 2739-2749 (2007).</li>
<li>Abdallah, B. M., Kassem, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+mesenchymal+stem+cells%3A+from+basic+biology+to+clinical+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Human mesenchymal stem cells: from basic biology to clinical applications.</a> Gene Ther. 15, 109-116 (2008).</li>
<li>Erica, L., Herzog, L. C., Diane, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Krause+Plasticity+of+marrow-derived+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Krause Plasticity of marrow-derived stem cells.</a> Blood. 102, 3483-3493 (2003).</li>
<li>Colter, D. C., Sekiya, I., Prockop, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+subpopulation+of+rapidly+self-renewing+and+multipotential+adult+stem+cells+in+colonies+of+human+marrow+stromal+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Identification of a subpopulation of rapidly self-renewing and multipotential adult stem cells in colonies of human marrow stromal cells.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 98, 7841-7845 (2001).</li>
</ol>

このプロトコルは、分離してMSCを豊かにする方法について説明します。シングルコロニー由来の細胞を分離する方法も組み込まれています。成功した分離、濃縮とコロニー分離する際に重要となるいくつかのステップがあります。ラットからの細胞単離を行っている間、それは、セルストレーナーまたは血液凝固と骨の破片を取り除くために同じようなサイズの滅菌ナイロンメッシュを介してフィルタリングすることをお勧めします。一晩細胞を播種した後、多くの死んだ細胞が培地中にフローティングされ、死んだ細胞は接着細胞の成長を支援すべき新鮮な培地と置換することによって除去される。 このプロトコルでソート磁気セルは、正の選択を実行する方法について説明し、同様の手続きが負の選択を実行するために使用することができます。追加される抗体の量が異なる場合がありますし、最適化は、より良いソートを達成するために要求されます。これは、フローサイトメトリー分析のために細胞を標識する場合も同様です。すぐに標識サンプルのフローサイトメトリー分析を実行していない場合、サンプルは2％ホルムアルデヒドで固定し、後で実行することができます。これは自家蛍光...

<table><tbody><tr><td>1X D-PBS</td><td>Invitrogen</td><td>14040-133</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Invitrogen</td><td>11885-084</td><td></td></tr><tr><td>セルストレーナー</td><td>BD Biosciences</td><td>352350</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Invitrogen</td><td>26140-079</td><td></td></tr><tr><td>Pen-Strep</td><td>Invitrogen</td><td>15140</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA</td><td>Invitrogen</td><td>25200-056</td><td></td></tr><tr><td>BD Imagnet</td><td>BD Biosciences</td><td>552311</td><td></td></tr><tr><td>ビオチン化マウスIgG2a</td><td>BD Biosciences</td><td>555572</td><td></td></tr><tr><td>ビオチン化マウスIgG1</td><td>BD Biosciences</td><td>555747</td><td></td></tr><tr><td>ビオチン化抗ラットCD54抗体</td><td>Cedarlane Labs</td><td>CL054B</td><td></td></tr><tr><td>ビオチン化抗ラットCD90抗体</td><td>Cedarlane Labs</td><td>CL005B</td><td></td></tr><tr><td>ビオチン化抗ラットCD45抗体</td><td>Cedarlane Labs</td><td>CL001B</td><td></td></tr><tr><td>BD Imag バッファー</td><td>BD Biosciences</td><td>552362</td><td></td></tr><tr><td>ラウンドボトムチューブ</td><td>BD Biosciences</td><td>352063</td><td></td></tr><tr><td>ストレプトアビジン粒子</td><td>BD Biosciences</td><td>557812</td><td></td></tr><tr><td>SA-PE</td><td>R&amp;amp;D Systems</td><td>F0040</td><td></td></tr><tr><td>クローニングシリンダー</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C2059</td><td></td></tr></tbody></table>

ラット間葉系幹細胞（msc）とmscを派生シングルコロニーの分離の分離と濃縮

Isolation and Enrichment of Rat Mesenchymal Stem Cells (MSCs) and Separation of Single-colony Derived MSCs

MSCは、治療用途のための有望な源である成体幹細胞の集団である。これらの細胞は、骨髄から単離することができると簡単に、プラスチック接着による造血幹細胞（HSC）から分離することができる。このプロトコルは、ラットの大腿骨と脛骨からMSCを分離する方法について説明します。分離した細胞をさらに磁気細胞選別して、2つのMSCの表面マーカーCD54とCD90に対する濃縮した。表面マーカーCD54とCD90の発現は、フローサイトメトリー分析によって確認した。 HSCマーカーCD45はまた、ソートされたMSCのが造血幹細胞が枯渇していたかどうかを確認するために含まれていた。 MSCは、自然にかなり異質です。さまざまな形状、増殖および分化能力を有する細胞の亜集団がある。これらの亜集団は、すべての既知のMSCのマーカーを発現していないユニークなマーカーはまだ異なる部分母集団に同定されていない。したがって、別の亜集団を分離するための代替アプローチは、単一コロニー由来の細胞を分離するためにクローニングシリンダーを使用しています。シングルコロニーに由来する細胞を培養すると別々に評価することができます。

ラットMSCを、大腿骨と脛骨から分離し、磁気細胞ソーティングで濃縮した。ソートされた細胞はフローサイトメトリーによる表面マーカーの発現について確認した。これらの細胞はまた、単一のコロニーを形成するためにクローン密度で培養した後、これらのコロニーをクローニングシリンダーにより分離した。

ラット間葉系幹細胞（MSC）とMSCを派生シングルコロニーの分離の分離と濃縮

MSC（間葉系幹細胞）は、治療への応用において有望な供給源となる成体幹細胞の一群である。これらの細胞は、骨髄から分離することが可能であり、...

間葉系幹細胞（MSCsと略記）を、6〜8週齢のRag Dolly雌ラットから単離し、約80%のコンフルエンスに達するまで10 cmペトリ皿で培養します。MSCを濃縮するため、細胞をビオチン標識一次抗体で染色し、続いてストレプトアビジン標識磁気ビーズで染色します。その後、磁気活性化細胞分取法（MACS）により、標識された細胞を陰性分画と陽性分画の2つの分画に分離します。続いて、フローサイトメトリー解析を用いて表面マーカーの発現を確認します。最後に、クローニングシリンダーを用いて単一コロニー由来のMSCを取得します。こんにちは、ミシガン州立大学化学工学・材料科学科のChristina Chang研究室のLeeです。本日は、chy幹細胞の単離および濃縮、ならびにシングルコロニー由来細胞の取得手順について解説します。当研究室では、赤色幹細胞の増殖および分化挙動を研究するためにこの手順を用いています。それでは、始めていきましょう。間葉系幹細胞（MSC）を、生後6〜8週の雌のSprague Dawleyラットから単離します。まず、安楽死させた動物の後肢から大腿骨と脛骨を切除します。皮膚と筋肉を取り除き、切除した大腿骨と脛骨を70%イソプロパノールに数秒間浸した後、1 X DPBSに移します。以下の手順はバイオセーフティキャビネット内で行ってください。まず、大腿骨と脛骨をDMEMを含む10 centimeterのディッシュに移します。次に、ピンセットで各骨を固定しながら、両端をハサミで切開します。22ゲージの針を3 mLシリンジに取り付け、DMEMを満たします。骨の開いた端の一方に針を挿入し、骨髄を50 mLチューブへ洗い出します。すべての骨髄が得られるまで、各骨に対してこの操作を2〜3回繰り返します。細胞を再懸濁し、70 µmのセルストレーナーに通過させて骨片や血液凝集塊を除去します。4 °Cで200 ×g、5分間遠心分離します。吸引により上澄みを除去した後、25 mLのMSC medium seedで細胞を再懸濁します。10 mLの細胞懸濁液を、2枚の10 cm培養皿にそれぞれ分注します。これらの培養皿を37 °C、5% CO₂インキュベーター内で1〜2週間培養します。 previously isolated rat MSCsが約80%のコンフルエンスに達したら、培地を吸引し、各皿に4〜5 mLのtrypsin EDTAを加えます。ディッシュをインキュベーターに戻し、約5分間インキュベートします。細胞を遊離させるため、等量の培地を加えてトリプシンを不活化します。細胞懸濁液を15 mLチューブに回収し、4 °C、200 ×gで5分間遠心分離します。それでは、2つの表面マーカーであるCD 54およびCD 90を用いて、MSCを濃縮する方法を実演します。BD Biosciences社の細胞分離用マグネットであるBD I magnetを使用します。まず、細胞ペレットを細胞染色バッファーに再懸濁し、細胞濃度を20 million cells/mLに調整します。次に、ビオチン化CD 54抗体およびビオチン化CD 90抗体を細胞懸濁液に添加し、穏やかに混合します。氷上で15分間インキュベートした後、1X BD IMAGバッファーを十分な量加えて、標識した細胞を洗浄します。標識した細胞を200 ×g、4°Cで5分間遠心分離します。BD imagストレプトアビジン粒子を十分にボルテックスして調製し、細胞10 million個につき40 µLの粒子を添加します。粒子と標識細胞を十分に混合し、6〜12°Cで30分間インキュベートします。このインキュベーションの時間に、陽性画分を回収するためのラウンドボトム試験管にラベルを貼ります。インキュベーション終了後、標識体積を1 mLあたり2,000万細胞に調整します。1回分（1 mL）のExpedia I 磁気バッファーを用いて、標識した細胞を陽性分画回収チューブに転送します。陽性分画チューブをBDIマグネットの上に置き、6分間静置します。次に、陽性分画チューブをBDIマグネットに載せたまま、ガラスパステールピペットで上清を除去します。続いて、陽性分画チューブをBDIマグネットから取り出し、氷上に置きます。1 mLの氷冷した1×BDI mag bufferを加え、穏やかに混ぜて細胞を再懸濁させます。チューブをBDIマグネットに戻し、2〜4分間そのままにします。新しいガラスパステアピペットを用いて上清を除去します。前述の手順に従い、洗浄を繰り返します。もう一度繰り返します。最後に、新しいガラス製パスツールピペットで上澄み液を除去します。その後、BDIマグネットラックからチューブを取り出します。細胞を1 mLの培地で懸濁し、25 mLの播種用培地を含む50 mLチューブに細胞懸濁液を移します。細胞の維持には175 cm²のスクエアフラスコを、フローサイトメトリーには10 cmディッシュを使用します。単一コロニー由来のMSCを分離する手順を開始するには、10 cmディッシュあたり約50〜100個の細胞を播種し、37 °C、5% CO2インキュベーターで1〜2週間培養します。この1〜2週間の期間に、倒立顕微鏡を用いて十分に孤立したコロニーを確認します。各コロニーが100個以上の細胞を含む十分な大きさに達したら、ディッシュの底面に油性マジックでコロニーをマークします。マーキングするコロニーを選択する際は、周囲に他のコロニーがないことを確認してください。培地を吸引し、ピンセットを用いて1回のX-D-P-B-Sでディッシュを洗浄します。滅菌済みのクローニングシリンダーを手に取り、マーキングしたコロニーの周囲に静かに配置します。すべてのマークされたコロニーにクローニングシリンダーが配置されるまで、この操作を繰り返します。各クローニングシリンダーに100 µLのtrypsin EDTAを加え、ディッシュをインキュベーターに戻します。5分後、顕微鏡で細胞を確認し、細胞が丸くなっているかを確認します。細胞が剥離したら、等量の培地を加えてトリプシンを不活性化します。200 µL マイクロピペッターで細胞懸濁液を混合し、3 mL の予熱済み培地を含む 60 mm ディッシュに細胞懸濁液を移します。ディッシュにラベルを貼り、プラスチック接着性の細胞を単離した後、再びインキュベーターに戻します。播種した翌日には MSCs が確認できるはずです。細胞が増殖し続けるにつれて、コンフルエントになった細胞は、この位相差像に示されているように、大部分が紡錘形または星形に見えます。細胞が約 80% のコンフルエンスに達したときに継代を行うのが適切です。トリプシン処理後、遊離した細胞は円形になり、培地中に浮遊している必要があります。磁気細胞分取によってMSCを濃縮した後、表面マーカーの発現を確認するためにフローサイトメトリーを行います。濃縮が適切であれば、細胞はMSCマーカーであるCD 54およびCD 90に対して陽性反応を示し、HSCマーカーであるCD 45に対しては陰性反応を示します。陰性対照としては、アイソタイプコントロールのIgG two AおよびIgG oneが使用されます。細胞が適切なクローナル密度で播種されている場合、この例に示すように、単一の細胞からコロニーが形成されます。その後、クローニングシリンダーを使用してコロニーを分離し、そのコロニー由来の細胞を個別に培養することができます。これら2つの例では、一方のコロニー由来の細胞は紡錘形をしており、もう一方のコロニー由来の細胞は円形をしています。以上で、ランダムおよび共通の幹細胞の単離と濃縮方法、ならびに単一コロニー由来細胞の取得方法について説明しました。この手順において重要な点は、単離時に血液凝固物や骨の破片を除去することです。濃縮時には最適な量の抗体を使用し、コロニー分離時には十分に単離されたコロニーに明確に印を付けてください。以上です。ご視聴ありがとうございました。皆さんの実験の成功を願っております。

isolation-enrichment-rat-mesenchymal-stem-cells-mscs-separation

Research

JoVE Journal

Biology

生物学

このプロトコルは、間葉系幹細胞および実験的移植の目的のために自己のペアを生成するために動物血清を使用することなく、内皮コロニー形成細胞の分離とその後の展開について説明します。...

ヒト臍帯由来間葉系幹細胞（MSCs）と血管内皮コロニー形成前駆細胞（ECFCs）の単離および動物血清自由膨張

このプロトコルは、酵素消化、密度勾配分離、プラスチック接着およびCD146 +磁気ビーズ選択を使用することにより、ラットから原発性肺常駐間葉系間質細胞を得るための分離技術について説明します。...

CD146の単離<sup&gt; +</supラット肺から&gt;常駐肺間葉系幹細胞

この記事で分離し、マウス長管骨から骨髄間質細胞と造血幹細胞を区別する手法を提案します。2...

分離、カルチャ、および骨髄間質細胞とマウスから破骨細胞前駆細胞の分化

この記事では、簡単な分離そしてニュージーランド白ウサギ滑液からの間葉系幹細胞の浄化のためのシンプルで経済的プロトコルを示します。...

磁気活性化細胞を分離し、滑膜液由来間葉系幹細胞が家兎モデルからの浄化戦略を並べ替え

この記事の全体的な目標は、分離と性質、大人マウス心臓から心臓の幹細胞 (CSCs) の分化のためのプロトコルを標準化することです。ここでは、マウス CSCs を分離する密度勾配遠心法と心筋細胞への分化、増殖、文化 CSC...

分離と性質、大人マウス心臓から心臓の幹細胞の分化

本稿では、ラット下顎骨から骨髄間葉幹細胞を単離、栽培、選別、同定するための骨髄付着とフローサイトメトリーの選別を組み合わせた方法を紹介する。...

ラットにおける骨髄間葉系幹細胞の単離と培養

脂肪組織由来間葉系幹細胞(Ad−MSC)は、インスリン産生細胞(IPC)に分化するMSCの潜在的な供給源となり得る。このプロトコルでは、ラット精巣上体Ad-MSCの単離と特性評価のための詳細な手順を提供し、続いて同じラットAd-MSCからIPCを生成するためのシンプルで短いプロトコルを提供します。...

インスリン産生細胞への分化のためのラット脂肪組織間葉系幹細胞の単離

このプロトコルは、Sprague Dawleyラットから脂肪組織由来間葉系幹細胞(MSC)を単離および同定するための方法論について説明しています。...

スプレイグドーリーラットの脂肪組織由来間葉系幹細胞の単離と同定

顎骨髄由来の間葉系幹細胞は、多様な分化、自己複製、免疫調節に重要な機能を持っています。それらは、遺伝子治療、組織工学、および再生医療における前駆細胞の重要な貯蔵庫として浮上しています。ここでは、ラットの顎骨髄間葉系幹細胞を単離する独自の方法を紹介します。...

ラット顎骨髄間葉系幹細胞の単離および培養技術

本プロトコルは、マウス由来の非常に均質な骨髄間葉系幹細胞(BMSC)を精製、増殖、および特徴付けるための費用対効果の高い方法を説明しています。このアプローチにより、高い増殖と分化の可能性のある大量のBMSCの取得が容易になり、マウスモデルをサポートし、前臨床研究を前進させることができます。...

マウス由来骨髄間葉系幹細胞の精製、増殖、およびフローサイトメトリーに基づく表現型解析

学ぶラット由来間葉系幹細胞の磁気細胞分選による分離・濃縮とフローサイトメトリーによる表面マーカー確認、単一コロニー分離法。この手法は再生医療研究に応用可能です。

ラット間葉系幹細胞（MSC）とMSCを派生シングルコロニーの分離の分離と濃縮

さらに動画を探す