Name: Onderzoek van de telomeren G-overhang Structuur in Trypanosoma brucei /em (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-01-26T17:00:00.000+00:00
Duration: 15 min 25 s
Description: Leer de telomeer G-overhang structuur analyseren in Trypanosoma brucei met native in-gel hybridisatie en ligation-mediated primer extension. Deze methoden onthullen cruciale inzichten over chromosoomstabiliteit en telomerasefunctie.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

We willen graag Dr Carolyn Price bedanken voor de wetenschappelijke discussies en inzichtelijke suggesties. Dit werk wordt ondersteund door NIH subsidie ​​AI066095 (PI: Bibo Li).

<ol><li>Munoz-Jordan, J. L., Cross, G. A., de Lange, T., Griffith, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((t-loops+at+trypanosome+telomeres%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">t-loops at trypanosome telomeres.</a> EMBO J. 20, 579-588 (2001).</li>
<li>Li, B., Espinal, A., Cross, G. A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trypanosome+telomeres+are+protected+by+a+homologue+of+mammalian+TRF2%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Trypanosome telomeres are protected by a homologue of mammalian TRF2.</a> Mol Cell Biol. 25, 5011-5021 (2005).</li>
<li>Wellinger, R. J., Wolf, A. J., Zakian, V. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Saccharomyces+telomeres+acquire+single-strand+TG1-3+tails+late+in+S+phase%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Saccharomyces telomeres acquire single-strand TG1-3 tails late in S phase.</a> Cell. 72, 51-60 (1993).</li>
<li>McElligott, R., Wellinger, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+terminal+DNA+structure+of+mammalian+chromosomes%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">The terminal DNA structure of mammalian chromosomes.</a> EMBO J. 16, 3705-3714 (1997).</li>
<li>Harrington, L. A., Greider, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Telomerase+primer+specificity+and+chromosome+healing%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Telomerase primer specificity and chromosome healing.</a> Nature. 353, 451-454 (1991).</li>
<li>Jacob, N. K., Skopp, R., Price, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((G-overhang+dynamics+at+Tetrahymena+telomeres%5BTitle%5D)+AND+%22Embo+J%22%5BJournal%5D)">G-overhang dynamics at Tetrahymena telomeres.</a> Embo J. 20, 4299-4308 (2001).</li>
<li>Barry, J. D., McCulloch, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antigenic+variation+in+trypanosomes%3A+enhanced+phenotypic+variation+in+a+eukaryotic+parasite%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Parasitol%22%5BJournal%5D)">Antigenic variation in trypanosomes: enhanced phenotypic variation in a eukaryotic parasite.</a> Adv Parasitol. 49, 1-70 (2001).</li>
<li>Yang, X., Figueiredo, L. M., Espinal, A., Okubo, E., Li, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RAP1+is+essential+for+silencing+telomeric+variant+surface+glycoprotein+genes+in+Trypanosoma+brucei%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">RAP1 is essential for silencing telomeric variant surface glycoprotein genes in Trypanosoma brucei.</a> Cell. 137, 99-109 (2009).</li>
</ol>

Trypanosoma brucei veroorzaakt slaapziekte bij de mens. Deze ziekte, indien onbehandeld, is onvermijdelijk fataal. T. brucei cellen in zoogdieren gastheren ondergaan antigene variatie regelmatig, zodat de gastheer immuunsysteem aanvallen 7 te ontwijken. Daarom is het erg moeilijk uit te roeien T. brucei cellen zodra een infectie wordt vastgesteld. We hebben onlangs aangetoond dat telomeren een belangrijke rol spelen in de regulatie van de expressie van T. brucei oppervlakte...

<table><tbody><tr><td>SeaKem LE Agarose</td><td>Lonza Inc.</td><td>50004</td><td></td></tr><tr><td>Agarose Type VII (laagsmeltende agarose)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A4018</td><td></td></tr><tr><td>Proteinase K, recombinant, PCR-grade</td><td>Roche Group</td><td>03 115801001</td><td></td></tr><tr><td>Exo I</td><td>New England Biolabs</td><td>M0293</td><td></td></tr><tr><td>Exo T</td><td>New England Biolabs</td><td>M0265</td><td></td></tr><tr><td>T7 exonuclease</td><td>New England Biolabs</td><td>M0263</td><td></td></tr><tr><td>T4 DNA-polymerase</td><td>New England Biolabs</td><td>M0203</td><td></td></tr><tr><td>QIAquick nucleotide removal kit</td><td>Qiagen</td><td>28304</td><td></td></tr></tbody></table>

onderzoek van de telomeren g-overhang structuur in trypanosoma brucei</em

Examination of the Telomere G-overhang Structure in Trypanosoma brucei

De telomeer G-overhang structuur heeft al in vele eukaryoten, met inbegrip gist, gewervelde dieren, en Trypanosoma brucei. Het dient als substraat voor telomerase voor de novo telomeren DNA-synthese en is daarom belangrijk voor telomeren onderhoud. T. brucei is een protozoaire parasiet die veroorzaakt slaapziekte bij de mens en nagana bij rundvee. Eenmaal besmet zoogdier gastheer, T. brucei cel schakelt regelmatig haar oppervlakte-antigeen te ontwijken van de gastheer immuunsysteem aan te vallen. We hebben onlangs aangetoond dat de T. brucei telomeer structuur speelt een essentiële rol in de regulatie van oppervlakte-antigeen genexpressie, die cruciaal is voor T. brucei pathogenese. Echter, T. brucei telomeer structuur niet is uitgebreid als gevolg van de beperking van de methoden voor de analyse van deze gespecialiseerde structuur bestudeerd. We hebben nu met succes heeft de autochtone in-gel hybridisatie en ligatie-gemedieerde primer extension methods voor het onderzoek van de telomeren G-overhang structuur en een adapter ligatie methode voor de bepaling van de telomeren terminal nucleotide in T. brucei cellen. Hier zullen we beschrijven de protocollen in detail en vergelijken hun verschillende voordelen en beperkingen.

Telomeren zijn essentieel voor chromosoom stabiliteit en de telomeer G-overhang structuur is essentieel voor telomerase-gemedieerde telomeren onderhoud. We hebben onlangs twee methoden voor het detecteren van de telomeer G-overhang structuur in<em&gt; Trypanosoma brucei</em&gt;, Die zijn eigen in-gel hybridisatie en ligatie-gemedieerde primer extensie, die zal worden beschreven.

Onderzoek van de telomeren G-overhang Structuur in Trypanosoma brucei</em

De telomeer G-overhangstructuur is geïdentificeerd in veel eukaryoten, waaronder gist, gewervelden en Trypanosoma brucei. Deze dient als het substraat ...

Het algemene doel van het volgende experiment is om de telomeer G-overhangstructuur in trap brucey-cellen te onderzoeken. Native in-gel hybridisatie maakt gebruik van een sequentie-specifieke oligo-probe om te hybridiseren met het enkelstrengs gebied van het telomeer onder native condities.Dit enkelstrengs gebied is de telomeer G-overhangregio, waardoor de hoeveelheid gehybridiseerde oligo-sonde de lengte van de adapter representeert. Ligatie maakt het mogelijk om de eindsequentie van de telomeer G-overhang te bepalen wanneer de unieke oligo is gelabeld. Deze methode omvat de ligatie van een sequentie-specifieke adapter aan het uiteinde van de telomeer G-overhangstructuur voor de ligatie-gemedieerde primaire extensie-assay.De gids-oligo is aan het uiteinde gelabeld en analoog aan de unieke oligo voordat deze aan de chromosoomuiteinden wordt geligeerd. Na ligatie wordt primaire extensie uitgevoerd met T four DNA polymerase. De lengte van de G-overhang kan vervolgens worden bepaald, aangezien het product n minus zes nucleotiden langer is dan de werkelijke G-overhang, waarbij N de lengte van de gids-oligo in de adapter vertegenwoordigt.Hoi, ik ben bi Bo, universitair docent bij de afd

examination-of-the-telomere-g-overhang-structure-in-trypanosoma-brucei

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie en Infectie

De dynamica van glycosomen in Afrikaanse trypanosomen is moeilijk te bestuderen met traditionele celbiologietechnieken zoals elektronen- en fluorescentiemicroscopie. Als middel om dynamisch orgaangedrag waar te nemen, is een fluorescentie-orgaanrapportagesysteem gebruikt in combinatie met flowcytometrie om de glycosoomdynamica in real-time in levende parasieten te monitoren.

Met behulp van fluorescerende eiwitten naar Monitor Glycosome Dynamiek in de Afrikaanse Trypanosoom

We rapporteren een beknopte procedure van fluorescentie in situ hybridisatie (FISH) in de geslachtsklieren en embryo's van Caenorhabditis elegans voor het observeren en kwantificeren van repetitieve sequenties. We hebben met succes twee verschillende repetitieve sequenties waargenomen en gekwantificeerd, telomeer herhalingen en sjabloon van alternatieve verlenging van telomeren (TALT).

Observatie en kwantificering van telomeren en repetitieve sequenties met behulp van fluorescentie<em&gt; In Situ</em&gt; Hybridisatie (FISH) met PNA Probes in<em&gt; Caenorhabditis elegans</em

Het toevoegen van een tag aan een eiwit is een krachtige manier om inzicht te krijgen in zijn functie. Hier beschrijven we een protocol om honderden Trypanosoma brucei-eiwitten parallel endogenetisch te taggen, zodat tagging op genoomschaal haalbaar is.

High-throughput Gene Tagging in<em&gt; Trypanosoma brucei</em

Afrikaanse trypanosomen die in vitro gekweekt worden, ondergaan antigeenvariatie met een lage snelheid, zodat populaties bestaan uit parasieten die een dominante variant van het oppervlakteglycoproteïne (VSG) en een kleine populatie van 'geschakelde' varianten tot expressie brengen. Dit protocol beschrijft een snelle methode voor het detecteren en kwantificeren van deze populaties.

detectie van<em&gt; Trypanosoma brucei</em&gt; Variant oppervlakte glycoproteïne Schakelen van Magnetic Activated Cell Sorting en flowcytometrie

Dit rapport beschrijft een monstervoorbereidingsprotocol en specifieke beeldvormingscondities voor het uitvoeren van schuifende transmissie-elektronentomografie van dikke biologische monsters.

Voorbereiding en observatie van Thick biologische monsters door Scanning Transmission Electron Tomografie

In dit artikel wordt een gedetailleerd protocol voor het kwantificeren van telomere lengte met behulp van een gewijzigde terminal restrictie fragment analyse besproken die snelle en efficiënte directe meting van telomere lengte biedt. Deze techniek kan toegepast worden op een verscheidenheid aan celbronnen van DNA voor het kwantificeren van telomere lengte.

Aangepaste Terminal Restriction Fragment Analyse voor het kwantificeren van telomere lengte met behulp van in-gel hybridisatie

De Trypanosoma cruzi agent van de ziekte van Chagas produceert langdurig asymptomatische infecties die abrupt tot klinisch erkende pathologie uitgroeien. Het volgende onderzoeksprotocol beschrijft een short-run programma gezinsgerichte epidemiologische studie om te ontrafelen de T. cruzi infectie van bovenliggende seksueel overgedragen aan nakomelingen.

Seksuele transmissie van Amerikaanse trypanosomen van mannetjes en vrouwtjes te naïeve Mates

Deze methode van trypanosoom afscheiding van bloed is afhankelijk van hun oppervlakte lading minder negatief dan bloed zoogdiercellen. Geïnfecteerd bloed is geplaatst en worden behandeld op een anionenwisselaar kolom. Deze methode, de meest passende diagnose voor slaapziekte, biedt gezuiverde parasieten voor immunologische, biologische, biochemische, farmaceutische en moleculaire biologie onderzoek.

Zuivering van extracellulaire trypanosomen, met inbegrip van Staten in Afrika, van bloed door Anion-wisselaars (Diethylaminoethyl-gemengd met cellulose kolommen)

Fijne naald aspiratie is een techniek, waarbij cellen worden verkregen uit een laesie of orgaan met behulp van een dunne naald. Aspirated materiaal is besmeurd, gekleurd en onderzocht onder een Microscoop voor diagnose of gebruikt voor moleculaire biologie, cytometrie of in vitro analyse. Het is goedkope, eenvoudig, snel en veroorzaakt een minimaal trauma.

Detectie van Extravasculaire Trypanosoma -parasieten door fijne naald aspiratie

Deze studie toont een gedetailleerd protocol voor het uitvoeren van ultrastructuurexpansiemicroscopie in drie in vitro levenscyclusstadia van Trypanosoma cruzi, de ziekteverwekker die verantwoordelijk is voor de ziekte van Chagas. We nemen de geoptimaliseerde techniek voor cytoskeletale eiwitten en pan-proteoomlabeling op.

Ultrastructurele expansiemicroscopie in drie in vitro levenscyclusstadia van Trypanosoma cruzi

Dit protocol demonstreert het gebruik van een magnetisch pincet met één molecuul om interacties te bestuderen tussen telomere DNA-bindende eiwitten (Telomere Repeat-binding Factor 1 [TRF1] en TRF2) en lange telomeren die uit menselijke cellen worden geëxtraheerd. Het beschrijft de voorbereidende stappen voor telomeren en telomere repeat-bindingsfactoren, de uitvoering van experimenten met één molecuul en de methoden voor gegevensverzameling en -analyse.

Analyse van telomere eiwit-DNA-interacties met behulp van een magnetisch pincet met één molecuul

Leer de telomeer G-overhang structuur analyseren in Trypanosoma brucei met native in-gel hybridisatie en ligation-mediated primer extension. Deze methoden onthullen cruciale inzichten over chromosoomstabiliteit en telomerasefunctie.

Onderzoek van de telomeren G-overhang Structuur in Trypanosoma brucei

Meer video's verkennen