Name: Lexamen des télomères G-structure en porte à faux Trypanosoma brucei /em (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-01-26T17:00:00.000+00:00
Duration: 15 min 25 s
Description: Découvrez l'analyse de la structure G-overhang des télomères chez Trypanosoma brucei par hybridation native en gel et extension d'amorce. Ces méthodes permettent d'étudier la stabilité chromosomique et le vieillissement cellulaire.

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Nous tenons à remercier le Dr Carolyn Prix pour les discussions scientifiques et suggestions judicieuses. Ce travail est soutenu par le NIH octroi AI066095 (PI: Bibo Li).

<ol><li>Munoz-Jordan, J. L., Cross, G. A., de Lange, T., Griffith, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((t-loops+at+trypanosome+telomeres%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">t-loops at trypanosome telomeres.</a> EMBO J. 20, 579-588 (2001).</li>
<li>Li, B., Espinal, A., Cross, G. A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trypanosome+telomeres+are+protected+by+a+homologue+of+mammalian+TRF2%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Trypanosome telomeres are protected by a homologue of mammalian TRF2.</a> Mol Cell Biol. 25, 5011-5021 (2005).</li>
<li>Wellinger, R. J., Wolf, A. J., Zakian, V. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Saccharomyces+telomeres+acquire+single-strand+TG1-3+tails+late+in+S+phase%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Saccharomyces telomeres acquire single-strand TG1-3 tails late in S phase.</a> Cell. 72, 51-60 (1993).</li>
<li>McElligott, R., Wellinger, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+terminal+DNA+structure+of+mammalian+chromosomes%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">The terminal DNA structure of mammalian chromosomes.</a> EMBO J. 16, 3705-3714 (1997).</li>
<li>Harrington, L. A., Greider, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Telomerase+primer+specificity+and+chromosome+healing%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Telomerase primer specificity and chromosome healing.</a> Nature. 353, 451-454 (1991).</li>
<li>Jacob, N. K., Skopp, R., Price, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((G-overhang+dynamics+at+Tetrahymena+telomeres%5BTitle%5D)+AND+%22Embo+J%22%5BJournal%5D)">G-overhang dynamics at Tetrahymena telomeres.</a> Embo J. 20, 4299-4308 (2001).</li>
<li>Barry, J. D., McCulloch, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antigenic+variation+in+trypanosomes%3A+enhanced+phenotypic+variation+in+a+eukaryotic+parasite%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Parasitol%22%5BJournal%5D)">Antigenic variation in trypanosomes: enhanced phenotypic variation in a eukaryotic parasite.</a> Adv Parasitol. 49, 1-70 (2001).</li>
<li>Yang, X., Figueiredo, L. M., Espinal, A., Okubo, E., Li, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RAP1+is+essential+for+silencing+telomeric+variant+surface+glycoprotein+genes+in+Trypanosoma+brucei%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">RAP1 is essential for silencing telomeric variant surface glycoprotein genes in Trypanosoma brucei.</a> Cell. 137, 99-109 (2009).</li>
</ol>

Trypanosoma brucei provoque la maladie du sommeil chez les humains. Cette maladie, si elle n&#39;est pas traitée, est inévitablement mortelle. T. cellules brucei chez des hôtes mammifères subissent une variation antigénique régulièrement afin d&#39;échapper à l&#39;attaque immunitaire de l&#39;hôte 7. C&#39;est pourquoi il est très difficile d&#39;éliminer T. cellules brucei fois l&#39;infection est établie. Nous avons récemment démontré que les télomères jouent un...

<table><tbody><tr><td>Agarose SeaKem LE</td><td>Lonza Inc.</td><td>50004</td><td></td></tr><tr><td>Agarose de type VII (agarose à bas point de fusion)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A4018</td><td></td></tr><tr><td>Protéinase K, recombinante, qualité PCR</td><td>Roche Group</td><td>03 115801001</td><td></td></tr><tr><td>Exo I</td><td>New England Biolabs</td><td>M0293</td><td></td></tr><tr><td>Exo T</td><td>New England Biolabs</td><td>M0265</td><td></td></tr><tr><td>Exonucléase T7</td><td>New England Biolabs</td><td>M0263</td><td></td></tr><tr><td>Polymérase ADN T4</td><td>New England Biolabs</td><td>M0203</td><td></td></tr><tr><td>Kit QIAquick de retrait des nucléotides</td><td>Qiagen</td><td>28304</td><td></td></tr></tbody></table>

l&#39;examen des télomères g-structure en porte à faux trypanosoma brucei</em

Examination of the Telomere G-overhang Structure in Trypanosoma brucei

Le G-télomères surplombent structure a été identifiée chez les eucaryotes, y compris de nombreuses levures, les vertébrés, et Trypanosoma brucei. Elle sert de substrat pour la télomérase pour la synthèse de novo d&#39;ADN des télomères et est donc important pour le maintien des télomères. T. brucei est un parasite protozoaire qui provoque la maladie du sommeil chez les humains et le nagana chez les bovins. Une fois infecté hôte mammifère, T. cellulaire brucei commutateurs régulièrement ses antigènes de surface pour échapper à l&#39;attaque immunitaire de l&#39;hôte. Nous avons récemment démontré que le T. brucei télomères structure joue un rôle essentiel dans la régulation de l&#39;expression du gène antigène de surface, ce qui est essentiel pour T. pathogenèse brucei. Toutefois, T. brucei télomères structure n&#39;a pas été étudiée en raison de la limitation des méthodes d&#39;analyse de cette structure spécialisée. Nous avons maintenant adopté avec succès le natif de gel-hybridation et ligation médiée par des méthodes d&#39;extension d&#39;amorces pour l&#39;examen des télomères G-faux structure et une méthode de ligature adaptateur pour la détermination de la borne télomères nucléotides dans T. cellules brucei. Ici, nous allons décrire les protocoles en détail et comparer leurs avantages et leurs limites.

Les télomères sont essentiels pour la stabilité des chromosomes et le G-télomères surplombent la structure est essentielle pour la télomérase médiée par le maintien des télomères. Nous avons récemment adopté deux méthodes pour détecter les télomères G-faux structure dans<em&gt; Trypanosoma brucei</em&gt;, Qui sont natifs en gel d&#39;hybridation et la ligature médiée par extension d&#39;amorce, qui seront décrits.

L&#39;examen des télomères G-structure en porte à faux Trypanosoma brucei</em

La structure du surplomb G télomérique a été identifiée chez de nombreux eucaryotes, notamment la levure, les vertébrés et Trypanosoma brucei. Elle sert de substrat...

L'objectif général de l'expérience suivante est d'examiner la structure du brin en surplomb G des télomères. Dans les cellules de trap brucey. L'hybridation native en gel utilise une sonde oligonucléotidique spécifique de séquence pour s'hybrider à la région simple brin du télomère dans des conditions natives.Cette région simple brin correspond à la région en surplomb G du télomère et, par conséquent, la quantité de sonde oligonucléotidique hybridée représente la longueur de l'adaptateur. La ligature permet de déterminer la séquence terminale du surplomb G du télomère lorsque l'oligonucléotide unique est marqué. Cette méthode implique la ligature d'un adaptateur spécifique de séquence à l'extrémité de la structure en surplomb G du télomère pour le dosage par extension primaire médiée par ligature.L'oligo-guide est marqué en extrémité et complémentaire à l'oligo unique avant d'être ligaturé aux extrémités des chromosomes. Après la ligation, une extension primaire est réalisée à l'aide de la polymérase ADN T4. La longueur du dépassement G peut alors être déterminée, le produit étant plus long de n moins six nucléotides que le véritable dépassement G, où N représente la longueur de l'

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Recherche

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie et infection

La dynamique des glycosomes dans les trypanosomes africains est difficile à étudier par les techniques traditionnelles de biologie cellulaire telles que la microscopie électronique et la microscopie à fluorescence.  Comme moyen d’observer le comportement dynamique des organites, un système rapporteur d’organites fluorescents a été utilisé en conjonction avec la cytométrie en flux pour surveiller la dynamique des glycosomes en temps réel chez les parasites vivants.

Utilisation de protéines fluorescentes pour surveiller glycosome Dynamics dans le trypanosome africain

Nous rapportons une procédure concise d’hybridation in situ en fluorescence (FISH) dans la gonade et les embryons de Caenorhabditis elegans pour observer et quantifier les séquences répétitives. Nous avons réussi à observer et à quantifier deux séquences répétitives différentes, les répétitions de télomères et le modèle d’allongement alternatif des télomères (TALT).

Observation et la quantification des télomères et des séquences répétitives utilisant Fluorescence<em&gt; In Situ</em&gt; Hybridation (FISH) avec PNA Sondes en<em&gt; Caenorhabditis elegans</em

L’ajout d’une étiquette à une protéine est un moyen puissant de mieux comprendre sa fonction. Ici, nous décrivons un protocole permettant de marquer de manière endogène des centaines de protéines de Trypanosoma brucei en parallèle afin que le marquage à l’échelle du génome soit réalisable.

Haut-débit Gene Tagging dans<em&gt; Trypanosoma brucei</em

Les trypanosomes africains cultivés in vitro subissent une variation antigénique à un faible taux, de sorte que les populations sont constituées de parasites exprimant un variant dominant de type glycoprotéine de surface (VSG) et d’une petite population de variants « commutés ».  Ce protocole décrit une méthode rapide de détection et de quantification de ces populations.

détection de la<em&gt; Trypanosoma brucei</em&gt; Switching Variant de glycoprotéine de surface par magnétique tri cellulaire activé et cytométrie de flux

Ce rapport décrit un protocole de préparation d’échantillons et des conditions d’imagerie spécifiques pour effectuer la tomographie électronique à transmission à balayage d’échantillons biologiques épais.

Préparation et observation d&#39;échantillons biologiques épais par tomographie électronique à transmission à balayage

Dans cet article, un protocole détaillé pour quantifier la longueur des télomères en utilisant une analyse de fragment de restriction terminale modifiée est discuté qui fournit une mesure directe rapide et efficace de la longueur des télomères. Cette technique peut être appliquée à une variété de sources cellulaires d'ADN pour quantifier la longueur des télomères.

Analyse modifiée des fragments de restriction des terminaux pour quantifier la longueur de télomère à l&#39;aide de l&#39;hybridation en gel

L’agent de la maladie de Chagas de Trypanosoma cruzi produit durable des infections asymptomatiques qui brusquement se développent en pathologie cliniquement reconnue. Le protocole de recherche suivant décrit une étude épidémiologique axée sur la famille de court terme pour démêler l’infection de T. cruzi transmise sexuellement des parents aux descendants.

Transmission sexuelle du trypanosome américaine des mâles et des femelles à des camarades de Naive

Cette méthode de séparation des trypanosomes dans le sang dépend de leur charge de surface étant moins négatif que les cellules de sang de mammifères. Sang contaminé est placé et traité sur une colonne d’échangeur d’anions. Cette méthode, plus raccord diagnostique pour la trypanosomiase africaine, fournit parasites purifiées à des investigations immunologiques, biologiques, biochimiques, pharmaceutiques et de la biologie moléculaire.

Purification des Trypanosomes extracellulaires, y compris les pays d’Afrique, du sang par échangeurs d’anions (colonnes diéthylaminoéthyl-cellulose)

Fine Needle Aspiration est une technique, par laquelle les cellules sont obtenues à partir d'une lésion ou d'un organe à l'aide d'une aiguille mince. Le matériel aspiré est enduit, taché et examiné au microscope pour le diagnostic ou utilisé pour la biologie moléculaire, la cytométrie ou l'analyse in vitro. Il est bon marché, simple, rapide et provoque un traumatisme minimal.

Détection des parasites extravasculaires de trypanosoma par l'aspiration fine d'aiguille

Cette étude montre un protocole détaillé pour effectuer la microscopie à expansion d’ultrastructure dans trois stades du cycle de vie in vitro de Trypanosoma cruzi, l’agent pathogène responsable de la maladie de Chagas. Nous incluons la technique optimisée pour les protéines cytosquelettiques et le marquage pan-protéome.

Microscopie à expansion ultrastructurale en trois étapes du cycle de vie in vitro de Trypanosoma cruzi

Ce protocole démontre l’utilisation d’une pince magnétique à molécule unique pour étudier les interactions entre les protéines de liaison à l’ADN télomérique (facteur de liaison à la répétition des télomères 1 [TRF1] et TRF2) et les télomères longs extraits de cellules humaines. Il décrit les étapes préparatoires pour les télomères et les facteurs de liaison de répétition télomérique, l’exécution d’expériences sur une seule molécule et les méthodes de collecte et d’analyse des données.

Analyse des interactions protéine-ADN télomériques à l’aide d’une pince magnétique à molécule unique

Découvrez l'analyse de la structure G-overhang des télomères chez Trypanosoma brucei par hybridation native en gel et extension d'amorce. Ces méthodes permettent d'étudier la stabilité chromosomique et le vieillissement cellulaire.

L'examen des télomères G-structure en porte à faux Trypanosoma brucei

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