Name: Lesame dei telomeri G-Struttura in aggetto Trypanosoma brucei /em (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-01-26T17:00:00.000+00:00
Duration: 15 min 25 s
Description: Scopri l'analisi della struttura G-overhang dei telomeri in Trypanosoma brucei mediante ibridazione in gel nativo ed estensione mediata da ligazione. Questi metodi permettono di determinare la lunghezza e la sequenza terminale dei telomeri.

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Vorremmo ringraziare il Dott. Carolyn Prezzo per discussioni scientifiche e suggerimenti penetranti. Questo lavoro è supportato dal NIH concedere AI066095 (PI: Bibo Li).

<ol><li>Munoz-Jordan, J. L., Cross, G. A., de Lange, T., Griffith, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((t-loops+at+trypanosome+telomeres%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">t-loops at trypanosome telomeres.</a> EMBO J. 20, 579-588 (2001).</li>
<li>Li, B., Espinal, A., Cross, G. A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trypanosome+telomeres+are+protected+by+a+homologue+of+mammalian+TRF2%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Trypanosome telomeres are protected by a homologue of mammalian TRF2.</a> Mol Cell Biol. 25, 5011-5021 (2005).</li>
<li>Wellinger, R. J., Wolf, A. J., Zakian, V. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Saccharomyces+telomeres+acquire+single-strand+TG1-3+tails+late+in+S+phase%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Saccharomyces telomeres acquire single-strand TG1-3 tails late in S phase.</a> Cell. 72, 51-60 (1993).</li>
<li>McElligott, R., Wellinger, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+terminal+DNA+structure+of+mammalian+chromosomes%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">The terminal DNA structure of mammalian chromosomes.</a> EMBO J. 16, 3705-3714 (1997).</li>
<li>Harrington, L. A., Greider, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Telomerase+primer+specificity+and+chromosome+healing%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Telomerase primer specificity and chromosome healing.</a> Nature. 353, 451-454 (1991).</li>
<li>Jacob, N. K., Skopp, R., Price, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((G-overhang+dynamics+at+Tetrahymena+telomeres%5BTitle%5D)+AND+%22Embo+J%22%5BJournal%5D)">G-overhang dynamics at Tetrahymena telomeres.</a> Embo J. 20, 4299-4308 (2001).</li>
<li>Barry, J. D., McCulloch, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antigenic+variation+in+trypanosomes%3A+enhanced+phenotypic+variation+in+a+eukaryotic+parasite%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Parasitol%22%5BJournal%5D)">Antigenic variation in trypanosomes: enhanced phenotypic variation in a eukaryotic parasite.</a> Adv Parasitol. 49, 1-70 (2001).</li>
<li>Yang, X., Figueiredo, L. M., Espinal, A., Okubo, E., Li, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RAP1+is+essential+for+silencing+telomeric+variant+surface+glycoprotein+genes+in+Trypanosoma+brucei%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">RAP1 is essential for silencing telomeric variant surface glycoprotein genes in Trypanosoma brucei.</a> Cell. 137, 99-109 (2009).</li>
</ol>

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

Trypanosoma brucei causa la malattia del sonno negli esseri umani. Questa malattia, se non trattata, è inevitabilmente fatale. T. cellule brucei a ospiti mammiferi subiscono variazione antigenica regolarmente in modo da eludere l&#39;attacco immunitario dell&#39;ospite 7. Quindi è molto difficile da eliminare T. cellule brucei una volta l&#39;infezione è stabilita. Abbiamo recentemente dimostrato che i telomeri svolgono un ruolo importante nella regolazione dell&#3...

<table><tbody><tr><td>Agarosio SeaKem LE</td><td>Lonza Inc.</td><td>50004</td><td></td></tr><tr><td>Agarosio tipo VII (agarosio a bassa temperatura di fusione)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A4018</td><td></td></tr><tr><td>Proteinasi K, ricombinante, di grado PCR</td><td>Roche Group</td><td>03 115801001</td><td></td></tr><tr><td>Exo I</td><td>New England Biolabs</td><td>M0293</td><td></td></tr><tr><td>Exo T</td><td>New England Biolabs</td><td>M0265</td><td></td></tr><tr><td>Esosonucleasi T7</td><td>New England Biolabs</td><td>M0263</td><td></td></tr><tr><td>Polimerasi del DNA T4</td><td>New England Biolabs</td><td>M0203</td><td></td></tr><tr><td>Kit QIAquick per la rimozione di nucleotidi</td><td>Qiagen</td><td>28304</td><td></td></tr></tbody></table>

l&#39;esame dei telomeri g-struttura in aggetto trypanosoma brucei</em

Examination of the Telomere G-overhang Structure in Trypanosoma brucei

Il G-sbalzo struttura dei telomeri è stato identificato negli eucarioti tra cui lievito, vertebrati, e Trypanosoma brucei. Esso funge da substrato per la telomerasi per de novo sintesi del DNA dei telomeri e quindi è importante per il mantenimento dei telomeri. T. brucei è un protozoo parassita che causa la malattia del sonno negli esseri umani e nagana nei bovini. Una volta infettato dei mammiferi, T. cellula brucei interruttori regolarmente il suo antigene di superficie di eludere attacco immunitario dell&#39;ospite. Abbiamo recentemente dimostrato che il T. brucei struttura dei telomeri svolge un ruolo essenziale nella regolazione dell&#39;espressione genica antigene di superficie, che è critica per T. brucei patogenesi. Tuttavia, T. brucei struttura dei telomeri non è stata ampiamente studiata a causa delle limitazioni dei metodi per l&#39;analisi di questa struttura specializzata. Ora abbiamo adottato con successo il nativo in gel ibridazione e ligation-mediata metodi fondo estensione per l&#39;esame del telomero G-sbalzo struttura e un metodo di legatura adattatore per la determinazione del terminale dei telomeri nucleotide in T. brucei cellule. Qui, verranno descritti i protocolli in dettaglio e confrontare i loro diversi vantaggi e limitazioni.

I telomeri sono essenziali per la stabilità dei telomeri dei cromosomi e la G-sbalzo struttura è essenziale per la telomerasi mediato conservazione dei telomeri. Abbiamo recentemente adottato due metodi per individuare i telomeri G-sbalzo struttura<em&gt; Trypanosoma brucei</em&gt;, Che sono nativi in ​​gel di ibridazione e ligation-mediata primer extension, che saranno descritti.

L&#39;esame dei telomeri G-Struttura in aggetto Trypanosoma brucei</em

La struttura a sbalzo G del telomero è stata identificata in molti eucarioti, tra cui lieviti, vertebrati e Trypanosoma brucei. Essa funge da substrato...

L'obiettivo generale del seguente esperimento è esaminare la struttura del G-overhang telomerico nelle cellule di *trap brucei*. L'ibridazione nativa in gel utilizza una sonda oligonucleotidica specifica per ibridarsi alla regione a singolo filamento del telomero in condizioni native.Questa regione a singolo filamento corrisponde alla zona di sporgenza G del telomero e pertanto la quantità di sonda oligo ibridata rappresenta la lunghezza dell'adattatore. La ligazione permette di determinare la sequenza terminale della sporgenza G del telomero quando l'oligo unico è marcato. Questo metodo prevede la ligazione di un adattatore specifico per la sequenza alla fine della struttura della sporgenza G del telomero, per il saggio di estensione primaria mediato da ligazione.L'oligo guida è marcato alle estremità e complementare all'oligo unico prima di essere ligato alle estremità cromosomiche. Dopo la ligazione, si esegue l'estensione primaria utilizzando la DNA polimerasi T4. La lunghezza del G overhang può quindi essere determinata poiché il prodotto è lungo n meno sei nucleotidi rispetto al G overhang reale, dove N rappresenta la lunghezza dell'oligo guida nell'adattatore.Ciao, sono Bo B

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Research

Ricerca

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia e Infezioni

Le dinamiche dei glicosomi nei tripanosomi africani sono difficili da studiare con le tradizionali tecniche di biologia cellulare come la microscopia elettronica e a fluorescenza.  Come mezzo per osservare il comportamento dinamico degli organelli, un sistema reporter di organelli fluorescenti è stato utilizzato in combinazione con la citometria a flusso per monitorare la dinamica del glicosoma in tempo reale nei parassiti vivi.

Utilizzo di proteine ​​fluorescenti per monitorare Glycosome Dynamics in Tripanosoma africano

Riportiamo una procedura concisa di ibridazione fluorescente in situ (FISH) nella gonade e negli embrioni di Caenorhabditis elegans per osservare e quantificare sequenze ripetitive. Abbiamo osservato e quantificato con successo due diverse sequenze ripetitive, le ripetizioni dei telomeri e il modello di allungamento alternativo dei telomeri (TALT).

Osservazione e quantificazione dei telomeri e sequenze ripetitive Usando fluorescenza<em&gt; In Situ</em&gt; Ibridazione (FISH) con sonde PNA in<em&gt; Caenorhabditis elegans</em

L'aggiunta di un tag a una proteina è un modo potente per ottenere informazioni sulla sua funzione. Qui, descriviamo un protocollo per marcare endogenamente centinaia di proteine di Trypanosoma brucei in parallelo in modo che sia possibile etichettare la scala del genoma.

High-throughput di Gene Tagging in<em&gt; Trypanosoma brucei</em

I tripanosomi africani cresciuti in vitro subiscono variazioni antigeniche a un tasso basso, in modo tale che le popolazioni sono costituite da parassiti che esprimono una variante dominante di tipo glicoproteina di superficie (VSG) e una piccola popolazione di varianti "commutate".  Questo protocollo descrive un metodo rapido per rilevare e quantificare queste popolazioni.

rilevamento di<em&gt; Trypanosoma brucei</em&gt; Switching Variante superficie glicoproteina da magnetico cellulare Attivato Ordinamento e citometria a flusso

Questo rapporto descrive un protocollo di preparazione del campione e condizioni di imaging specifiche per eseguire la tomografia elettronica a scansione di trasmissione di campioni biologici spessi.

Preparazione e di osservazione di campioni biologici spessi da Scanning Transmission Electron Tomografia

In questo articolo viene descritto un protocollo dettagliato per quantificare la lunghezza del telomere utilizzando un'analisi del frammento di restrizione terminale modificata che fornisce una misurazione diretta veloce ed efficiente della lunghezza del telomere. Questa tecnica può essere applicata a una varietà di fonti cellulari di DNA per quantificare la lunghezza del telomere.

Analisi di frammento di restrizione terminale modificata per quantificare la lunghezza di telomere utilizzando l&#39;ibridazione in gel

L'agente di Trypanosoma cruzi di malattia di Chagas produce infezioni asintomatiche di lunga durata che improvvisamente trasformarsi in patologia clinicamente riconosciuta. Il seguente protocollo di ricerca descrive uno studio epidemiologico a breve termine basati sulla famiglia per svelare il T. cruzi infezione sessualmente trasmessa dal padre alla progenie.

Trasmissione sessuale dell'americano Trypanosomes da maschi e femmine ai compagni di Naive

Questo metodo di separazione Tripanosoma dal sangue dipende dalla loro carica superficiale essendo meno negativo rispetto a cellule del sangue dei mammiferi. Sangue infetto è collocato e trattati su una colonna di scambiatore di anioni. Questo metodo, più il montaggio diagnostico per la tripanosomiasi africana, fornisce parassiti purificati per indagini immunologiche, biologiche, biochimiche, farmaceutiche e biologia molecolare.

Purificazione dei tripanosomi extracellulare, tra cui africana, dal sangue mediante scambiatori di anioni (colonne Diethylaminoethyl-cellulosa)

Fine Needle Aspiration è una tecnica, per cui le cellule sono ottenute da una lesione o un organo utilizzando un ago sottile. Il materiale aspirato viene spalmato, colorato ed esaminato al microscopio per la diagnosi o utilizzato per la biologia molecolare, la citometria o l'analisi in vitro. È economico, semplice, veloce e provoca un trauma minimo.

Rilevamento di parassiti di Trypanosoma Extravascolari da parte dell'aspirazione dell'ago fine

Questo studio mostra un protocollo dettagliato per eseguire la microscopia ad espansione ultrastrutturale in tre fasi del ciclo di vita in vitro di Trypanosoma cruzi, il patogeno responsabile della malattia di Chagas. Includiamo la tecnica ottimizzata per le proteine del citoscheletro e la marcatura del pan-proteoma.

Microscopia ad espansione ultrastrutturale in tre fasi del ciclo di vita in vitro di Trypanosoma cruzi

Questo protocollo dimostra l'utilizzo di pinzette magnetiche a singola molecola per studiare le interazioni tra le proteine telomeriche leganti il DNA (Telomere Repeat-binding Factor 1 [TRF1] e TRF2) e i lunghi telomeri estratti da cellule umane. Descrive le fasi preparatorie per i telomeri e i fattori di legame ripetuto telomerico, l'esecuzione di esperimenti su singole molecole e i metodi di raccolta e analisi dei dati.

Analisi delle interazioni proteina-DNA telomerico utilizzando pinzette magnetiche a singola molecola

Scopri l'analisi della struttura G-overhang dei telomeri in Trypanosoma brucei mediante ibridazione in gel nativo ed estensione mediata da ligazione. Questi metodi permettono di determinare la lunghezza e la sequenza terminale dei telomeri.

L'esame dei telomeri G-Struttura in aggetto Trypanosoma brucei

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