Name: Telomere G - 오버행 구조의 시험 Trypanosoma brucei /em (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-01-26T17:00:00.000+00:00
Duration: 15 min 25 s
Description: 학습하세요 Trypanosoma brucei의 텔로미어 G-오버행 구조 분석 방법을 배우세요. 네이티브 인-겔 하이브리다이제이션과 리게이션 매개 프라이머 확장 기법을 활용하여 염색체 안정성과 텔로머레이스 기능을 연구합니다.

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우리는 과학적인 토론과 통찰력 제안에 대한 박사 캐롤린 가격 감사드립니다. 이 작품은 NIH 부여 AI066095 (비보 리튬 PI)에 의해 지원됩니다.

<ol><li>Munoz-Jordan, J. L., Cross, G. A., de Lange, T., Griffith, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((t-loops+at+trypanosome+telomeres%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">t-loops at trypanosome telomeres.</a> EMBO J. 20, 579-588 (2001).</li>
<li>Li, B., Espinal, A., Cross, G. A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trypanosome+telomeres+are+protected+by+a+homologue+of+mammalian+TRF2%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Trypanosome telomeres are protected by a homologue of mammalian TRF2.</a> Mol Cell Biol. 25, 5011-5021 (2005).</li>
<li>Wellinger, R. J., Wolf, A. J., Zakian, V. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Saccharomyces+telomeres+acquire+single-strand+TG1-3+tails+late+in+S+phase%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Saccharomyces telomeres acquire single-strand TG1-3 tails late in S phase.</a> Cell. 72, 51-60 (1993).</li>
<li>McElligott, R., Wellinger, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+terminal+DNA+structure+of+mammalian+chromosomes%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">The terminal DNA structure of mammalian chromosomes.</a> EMBO J. 16, 3705-3714 (1997).</li>
<li>Harrington, L. A., Greider, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Telomerase+primer+specificity+and+chromosome+healing%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Telomerase primer specificity and chromosome healing.</a> Nature. 353, 451-454 (1991).</li>
<li>Jacob, N. K., Skopp, R., Price, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((G-overhang+dynamics+at+Tetrahymena+telomeres%5BTitle%5D)+AND+%22Embo+J%22%5BJournal%5D)">G-overhang dynamics at Tetrahymena telomeres.</a> Embo J. 20, 4299-4308 (2001).</li>
<li>Barry, J. D., McCulloch, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antigenic+variation+in+trypanosomes%3A+enhanced+phenotypic+variation+in+a+eukaryotic+parasite%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Parasitol%22%5BJournal%5D)">Antigenic variation in trypanosomes: enhanced phenotypic variation in a eukaryotic parasite.</a> Adv Parasitol. 49, 1-70 (2001).</li>
<li>Yang, X., Figueiredo, L. M., Espinal, A., Okubo, E., Li, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RAP1+is+essential+for+silencing+telomeric+variant+surface+glycoprotein+genes+in+Trypanosoma+brucei%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">RAP1 is essential for silencing telomeric variant surface glycoprotein genes in Trypanosoma brucei.</a> Cell. 137, 99-109 (2009).</li>
</ol>

관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.

Trypanosoma brucei은 인간의 질병을 자고됩니다. 이 질병은 치료 왼쪽면, 필연적으로 치명적이다. T는 포유류의 호스트에서 brucei 전지는 정기적으로 너무 호스트의 면역 공격 7 피하기 위해 같은 antigenic 변화을 받고있다. 따라서 그것은 T.을 제거하는 것은 매우 어렵습니다 감염되면 brucei 세포가 설정됩니다. 우리는 최근 telomeres가 T.의 표현 규제에 중요한 역할을 것을 증명하고있다 brucei 표면 항원 유전자 8. 따라서, 더 T.의 telomere 유지 보수에 대한 telomeres과 메커니즘의 기능을 이해하는 것이 중요합니다 brucei 세포. telomere G - 오버행 구조는 telomerase 중재 telomere 유지 보수 5</s...

<table><tbody><tr><td>SeaKem LE Agarose</td><td>Lonza Inc.</td><td>50004</td><td></td></tr><tr><td>Agarose Type VII (저융점 아가로스)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A4018</td><td></td></tr><tr><td>Proteinase K, 재조합, PCR 등급</td><td>Roche Group</td><td>03 115801001</td><td></td></tr><tr><td>Exo I</td><td>New England Biolabs</td><td>M0293</td><td></td></tr><tr><td>Exo T</td><td>New England Biolabs</td><td>M0265</td><td></td></tr><tr><td>T7 exonuclease</td><td>New England Biolabs</td><td>M0263</td><td></td></tr><tr><td>T4 DNA polymerase</td><td>New England Biolabs</td><td>M0203</td><td></td></tr><tr><td>QIAquick 뉴클레오타이드 제거 키트</td><td>Qiagen</td><td>28304</td><td></td></tr></tbody></table>

telomere g - 오버행 구조의 시험 trypanosoma brucei</em

Examination of the Telomere G-overhang Structure in Trypanosoma brucei

telomere G - 오버행 구조는 효모, 척추 동물, 그리고 Trypanosoma brucei 등 많은 eukaryotes에서 발견되었습니다. 그것은 드 노보 telomere DNA 합성에 대한 telomerase를위한 기판 역할 및 telomere 유지 보수에 대한 것이 중요합니다. T는 brucei은 가축의 인간과 nagana에 수면병 일으키는 protozoan 기생충이다. 일단 감염된 포유류의 호스트, T. brucei 세포 정기적으로 숙주의 면역 공격을 회피하기 위해 표면 항원을 전환됩니다. 우리는 최근에 보여준 그 T. brucei telomere 구조 T.에 대한 중요 표면 항원 유전자 발현의 조절에 중요한 역할을 brucei의 pathogenesis. 그러나, T. brucei telomere 구조는 광범위이 전문 구조 분석 방법의 한계로 인해 연구되지 않았습니다. 우리는 이제 성공적으로 하이브리드화 및 telomere G - 오버행 구조의 심사 T.의 뉴클레오 티드 telomere 터미널의 결정을위한 어댑터 내고 방법에 대한 결합 - 중재 뇌관 확장 방법 - 겔의 기본을 채택했습니다 brucei 세포. 여기서는 자세하게 프로토콜을 설명하고 그들의 다양한 장점과 한계를 비교합니다.

Telomeres는 염색체의 안정성을 위해 필수이며 telomere G - 오버행 구조는 telomerase - 중재 telomere의 유지 보수를 위해 필수적입니다. 우리는 최근 telomere G - 오버행 구조의 검출을위한 두 가지 방법을 채택했습니다<em&gt; Trypanosoma brucei</em&gt; 이는 인 겔 하이브 리다이 제이션 및 설명됩니다 내고 - 중재 뇌관 확장, 기본 있습니다.

Telomere G - 오버행 구조의 시험 Trypanosoma brucei</em

텔로미어 G-오버행(G-overhang) 구조는 효모, 척추동물 및 Trypanosoma brucei를 포함한 많은 진핵생물에서 확인되었습니다. 이는 ...의 기질로 작용합니다.

다음 실험의 전반적인 목표는 trap brucey 세포의 텔로미어 G 오버행 구조를 조사하는 것입니다. 네이티브 겔 하이브리다이제이션은 시퀀스 특이적 올리고 프로브를 사용하여 네이티브 조건에서 텔로미어의 단일 가닥 영역에 하이브리다이즈시키는 방법입니다.이 단일 가닥 영역은 텔로미어 G 오버행 영역이며, 따라서 하이브리드화된 올리고 프로브의 양은 해당 길이 어댑터를 나타냅니다. 고유한 올리고가 표지되면 라이게이션을 통해 텔로미어 G 오버행의 말단 서열을 결정할 수 있습니다. 이 방법은 라이게이션 매개 일차 신장 분석을 위해 텔로미어 G 오버행 구조의 말단에 서열 특이적 어댑터를 라이게이션하는 과정을 포함합니다.가이드 올리고는 염색체 말단에 라이게이션되기 전에 말단 표지 및 분석(anal) 작업을 거칩니다. 라이게이션 후, T four DNA polymerase를 사용하여 1차 신장 반응을 수행합니다. G 오버행의 길이는 생성물이 실제 G 오버행보다 n minus six 뉴클레오타이드만큼 더 길다는 점을 통해 결정할 수 있으며, 여기서 N은 어댑터 내 가이드 올리고의 길이를 나타냅니다.안녕하세요, 저는 클리블랜드 주립대학교 생물, 지질 및 환경 과학과의 조교수 Bo입니다. 안녕하세요, 저는 Lee 박사님 연구실의 대학원생 Gio입니다. 오늘은 geo hank 구조를 분석하는 절차를 보여드리겠습니다.우리는 방사성 물질을 사용하여 Trapasso의 텔로미어 구조와 기능을 연구하기 위해 이 절차를 사용합니다. 본 실험과 마찬가지로 적절한 안전 예방 조치를 취하는 것이 필수적입니다. 이를 시도하기 전에 기관의 환경 보건 및 안전 부서와 상의해야 합니다.이 영상에서는 시연 목적상 일부 전구체들이 생략되었습니다. 그럼 시작해 보겠습니다. 이 절차 단계의 원리는 천연 조건 하에서, C-C-C-T-A가 4회 반복되는 서열로 구성된 표지되지 않은 tell C 프로브를 사용하는 것입니다.올리고뉴클레오타이드는 단일 가닥 텔로미어 G 오버행 영역에만 하이브리드화될 수 있습니다. 따라서 하이브리드화 강도는 오버행의 길이에 비례합니다. 변성과 중화 과정을 거치면 동일한 프로브가 텔로미어 전체 영역에 하이브리드화될 수 있습니다.이 하이브리드화의 강도는 텔로미어 DNA의 총량을 나타내며 로딩 컨트롤로 사용됩니다. 이후 native 하이브리드화 신호를 변성 후 얻은 신호로 나누어 최종 G 오버행 수준을 계산할 수 있습니다. 이 절차는 펄스장 겔

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Research

연구

JoVE Journal

Immunology and Infection

면역학 및 감염학

아프리카 트리파노좀의 글리코솜 역학은 전자 및 형광 현미경과 같은 전통적인 세포 생물학 기술로는 연구하기 어렵습니다.  동적 소기관 거동을 관찰하는 수단으로, 형광 소기관 리포터 시스템이 유세포 분석법과 함께 사용되어 살아있는 기생충의 실시간 배당체 역학을 모니터링했습니다.

형광 단백질을 사용하면 아프리카 Trypanosome에서 Glycosome 역학을 모니터링하려면

우리는 반복적인 염기서열을 관찰하고 정량화하기 위해 예쁜꼬마선충의 생식선과 배아에서 형광 현장 교잡화(FISH)의 간결한 절차를 보고합니다. 우리는 두 가지 다른 반복 서열, 즉 텔로미어 반복과 텔로미어의 대체 연장(TALT) 템플릿을 성공적으로 관찰하고 정량화했습니다.

관측 및 텔로미어의 정량 및 반복 시퀀스 사용하여 형광<em&gt; 현장에서</emPNA 프로브에와&gt; 하이브리드 (FISH)<em&gt; 예쁜 꼬마 선충</em

단백질에 태그를 추가하는 것은 단백질의 기능에 대한 통찰력을 얻는 강력한 방법입니다. 여기에서는 게놈 규모 태깅이 가능하도록 수백 개의 Trypanosoma brucei 단백질을 병렬로 내인성으로 라벨링하는 프로토콜에 대해 설명합니다.

높은 처리량 유전자 태그에<em&gt; 트리파노소마 (Trypanosoma) brucei</em

in vitro에서 성장한 아프리카 트리파노좀은 낮은 비율로 항원 변이를 겪으며, 개체군은 우성 변이 표면 당단백질(VSG) 유형을 발현하는 기생충과 "전환된" 변이체의 작은 집단으로 구성됩니다.  이 프로토콜은 이러한 개체군을 검출하고 정량화하는 빠른 방법을 설명합니다.

검출<em&gt; 트리파노소마 (Trypanosoma) brucei</em자기 활성 셀 정렬 및 유동 세포 계측법에 의해&gt; 변형 표면 당 단백질 전환

이 보고서는 두꺼운 생물학적 표본의 주사 투과 전자 단층 촬영을 수행하기 위한 샘플 준비 프로토콜과 특정 이미징 조건을 설명합니다.

주사 투과 전자 단층 촬영에 의해 준비 및 두꺼운 생물 샘플의 관측

이 기사에서는 텔로미어 길이의 신속하고 효율적인 직접 측정을 제공하는 수정 된 터미널 제한 단편 분석을 사용하여 텔로미어 길이를 정량화하기위한 자세한 프로토콜을 논의합니다. 이 기술은 텔로미어 길이를 정량화하기 위해 DNA의 다양한 세포 공급원에 적용될 수 있습니다.

In-gel Hybridization을 이용한 Telomere 길이 정량을위한 수정 된 terminal restriction fragment 분석

Chagas 질병의 Trypanosoma cruzi 에이전트 오랫동안 무 증상 감염 갑자기 인식된 임상 병리학으로 개발 생산. 다음 연구 프로토콜 설명 짧은 실행 가족 기반 역학 연구를 푸는 T. cruzi 감염 성적으로 부모 로부터 자손에 전달 합니다.

치 메이 트 남성 및 여성에서 미국의 Trypanosomes의 성적인 전송

혈액에서 trypanosome 분리의이 방법은 포유류 혈액 세포 보다 덜 부정 되 고 그들의 표면 충전에 따라 다릅니다. 감염 된 혈액은 놓이고 음이온 교환기 열에 치료. 이 방법, 아프리카 trypanosomiasis에 대 한 가장 피팅 진단 면역학, 생물학, 생화학, 제약 및 분자 생물학 수사에 대 한 정화 기생충을 제공합니다.

음이온 교환기 (Diethylaminoethyl-셀 루 로스 열)에 의해 혈액에서 아프리카를 포함 한 세포 외 Trypanosomes의 정화

미세 한 바늘 흡인 은 얇은 바늘을 사용하여 병변 이나 장기에서 세포를 수득 하는 기술이다. 흡인 물질은 진단을 위해 현미경으로 얼룩지고, 염색되고 검사되거나 분자 생물학, 세포 분석 또는 시험관 내 분석에 사용됩니다. 그것은 저렴하고 간단하며 빠르며 최소한의 외상을 일으킵니다.

미세 바늘 흡인에 의해 혈관 외 Trypanosoma 기생충의 검출

이 연구는 샤가스병의 원인이 되는 병원체인 트리파노소마 크루지(Trypanosoma cruzi)의 3가지 체외 수명 주기 단계에서 초구조 확장 현미경 검사를 수행하기 위한 상세한 프로토콜을 보여줍니다. 당사는 세포골격 단백질(cytoskeletal proteins) 및 범단백질체(pan-proteome) 라벨링에 최적화된 기술을 포함합니다.

Ultrastructural Expansion Microscopy in Three In Vitro Life Cycle Stages of Trypanosoma cruzi(트리파노소마 크루즈 의 3가지 체외 수명 주기 단계에서의 초구조 확장 현미경)

이 프로토콜은 단일 분자 자기 핀셋을 사용하여 텔로미어 DNA 결합 단백질(텔로미어 반복 결합 인자 1[TRF1] 및 TRF2)과 인간 세포에서 추출한 긴 텔로미어 간의 상호 작용을 연구하는 방법을 보여줍니다. 텔로미어 및 텔로메릭 반복 결합 인자에 대한 준비 단계, 단일 분자 실험의 실행, 데이터 수집 및 분석 방법에 대해 설명합니다.

Single-Molecule Magnetic Tweezers를 사용한 텔로머 단백질-DNA 상호 작용 분석

학습하세요 Trypanosoma brucei의 텔로미어 G-오버행 구조 분석 방법을 배우세요. 네이티브 인-겔 하이브리다이제이션과 리게이션 매개 프라이머 확장 기법을 활용하여 염색체 안정성과 텔로머레이스 기능을 연구합니다.

Telomere G - 오버행 구조의 시험 Trypanosoma brucei

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