Microinjeção de Células enfermeiras Drosophila: Um Método de Parto Intracelular

- Coloque uma mancha de cobertura com câmaras de ovos dissecadas no estágio do microscópio. Localize uma câmara de ovo do estágio de desenvolvimento apropriado e orientação para microinjeção. Câmaras de ovos de médio a final têm uma grande gema oócida visível, e aquelas na orientação correta estão com seu eixo perpendicular anterior-posterior à direção da injeção.

As células nervosas de Drosophila são um grupo de 15 células dentro da câmara de óvulos responsáveis por depositar nutrientes e biomoléculas maternamente derivados no oócito em desenvolvimento. Configure o sistema microinjetor para a injeção adequada e pressão de compensação para garantir o volume de injeção consistente e o fluxo externo.

Certifique-se de que não há ar preso na ponta do capilar e que há um fluxo contínuo da solução. Em seguida, ajuste a posição Z do objetivo de focar na membrana que separa as células folículos das células enfermeiras, insira a agulha em uma célula enfermeira e realize a injeção.

O protocolo a seguir demonstra microinjeção de células enfermeiras Drosophila com sondas oligonucleotídeos fluorescentes, chamadas de sinalizadores moleculares, contra transcrições de mRNA contribuidas maternamente para imagens de células vivas.

- Para a microinjeção do farol molecular, selecione o objetivo do óleo de 40x e monte um deslizamento de cobertura com a câmara de ovo dissecada no estágio do microscópio. Localize uma câmara de ovo no estágio de desenvolvimento médio e tardio que seja adequadamente orientada para a microinjeção, em seguida, configure um microinjetor com as pressões de injeção e compensação apropriadas.

Usando o joystick micromanipulador, baixe suavemente uma agulha carregada com um microliter de solução de farol molecular na gota de óleo. Coloque a ponta em foco para a periferia do campo de visão. Faça uma função limpa para remover o ar da ponta da agulha e garantir que haja fluxo da agulha, e leve a agulha para a posição de casa.

Concentre-se na câmara de ovo para ser microinjetada, e leve a agulha de volta ao foco perto da borda da câmara de ovos. Realize um ajuste fino da posição Z do objetivo de modo que a membrana que separa as células folículos das células enfermeiras esteja em foco.

- Para garantir o sucesso da microinjeção reprodutível, concentre-se cuidadosamente na membrana que separa as células folículos e nas células enfermeiras que serão injetadas, ao mesmo tempo em que coloca a ponta da agulha em foco com o micromanipulador.

- Quando todos os faróis moleculares tiverem sido injetados, remova suavemente a agulha e retraia-a para a posição de casa. Altere o objetivo para a ampliação desejada para aquisição de imagem, em seguida, concentre-se na câmara de ovos sob o novo objetivo e inicie a aquisição da imagem.