UV-bestraling: een methode om extrachromosomale arrays te integreren

- Het creëren van extrachromosomale DNA-arrays door micro-injection-- de eenvoudigste methode om transgene wormstammen te genereren-- resulteert in genetische elementen die niet stabiel worden overgedragen tijdens celdeling en daarom variabele overervingspercentages en expressieniveaus vertonen. Het doel van het integreren van de array in een chromosoom is om deze genetische instabiliteit en variabiliteit te verminderen.

Om dit te doen, begin met een leeftijd-gesynchroniseerde populatie van L4 transgene wormen, die een extrachromosomale array eerder geïntroduceerd door micro-injection dragen en laat ze groeien tot gravid volwassenen. Breng deze volwassenen over naar nieuwe platen en laat ze eieren leggen totdat er ten minste 30 eieren op elk bord. Verwijder de volwassenen en laat de eieren groeien tot ze de L4-fase bereiken. Bestraal vervolgens de wormen met UV-licht. Dit veroorzaakt willekeurige dubbele strengbreuken in de genomic.

Tel na een nachtelijke herstelperiode het aantal overlevende wormen. Een klein percentage dode wormen duidt op efficiënte bestraling. Observeer volgende generaties om homozygote geïntegreerde transgene lijnen te isoleren. In het voorbeeldprotocol zullen we een extrachromosomale array met een hoge transmissiesnelheid integreren met een fluorescerende co-injectiemarker uitgedrukt in de farynx.

- Evalueer de transmissiesnelheid van de te integreren transgene lijn. Kies voor elke transgene lijn 10 fluorescerende gravid volwassenen op 10 afzonderlijke kweekplaten onder een fluorescerende stereoscope. Kweek de dieren in een wormincubator die is ingesteld op een temperatuur die daalt tot reproductie van de genetische achtergrond.

Bewaak het nageslacht elke dag om te evalueren in welke ontwikkelingsfase de co-injectiemarker wordt uitgedrukt en het best kan worden waargenomen. Evalueer met behulp van fluorescerende stereoscopie de transmissiesnelheid van het nageslacht door het percentage fluorescerend nageslacht te bepalen. Voor de transgene integratie selecteert u de transgene lijn met de hoogste transmissiesnelheid.

Verkrijg een populatie transgene dieren gesynchroniseerd in het L4 larvale stadium voor integratie. Pluk 30 fluorescerende gravid volwassenen op vijf kweekplaten. Nadat de wormen drie tot vier uur eieren hebben gelegd bij 15 graden Celsius, controleer je op de aanwezigheid van ten minste 30 eieren per plaat en verwijder je vervolgens de volwassenen van de platen.

Kweek de dieren in een worm incubator totdat het nageslacht het L4 larvale stadium bereikt. Plaats elke plaat met 15 tot 20 fluorescerende transgene L4 dieren in een UV crosslinker met de deksels verwijderd. Bestraal de wormen.

Voor herstel, incubeer de bestraalde wormen 's nachts bij 15 graden Celsius. Controleer op het aantal dieren dat leeft. In onze handen is een overlevingskans van ongeveer 80% tot 90% adaptief voor een efficiënte bestraling. Laat de bestraalde dieren groeien op 15 tot 25 graden Celsius totdat het nageslacht de ontwikkelingsfase heeft bereikt, waardoor de co-injectiemarkerexpressie kan worden waargenomen.