Name: Resposta quimiotática de microorganismos marinhos para Micro-Escala de Camadas de nutrientes (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2007-05-28T00:00:00.000+00:00
Duration: 22 min 38 s
Description: Aprenda a fabricar canais microfluídicos para estudar a quimiotaxia de microrganismos marinhos e o comportamento de natação bacteriana em fluxo de cisalhamento. Esta técnica permite visualizar dinâmicas microbianas em gradientes de nutrientes.

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Gostaríamos de agradecer Microsystems Technology Laboratories no MIT por nos permitir filme parte deste vídeo na instalação de sala limpa.

Preparação 1. Crie uma Máscara <blockquote> Usando um software CAD, design do canal de alta resolução de impressão em uma transparência. Esta será a &quot;máscara&quot;. </blockquote> Na sala limpa: 2. Limpe e coza a bolacha Primeiro, o wafer esguicho com acetona, em seguida, rapidamente, com metanol, em seguida, com Isopropanol. Por fim, seque o wafer usando nitrogênio. Asse o wafer no forno (130 ° C) por 5 min. 3. Revestimento do wafer Coloque a bolacha no centro da máquina de spin-coating. Despeje fotorresiste (SU-8) da garrafa para o wafer. Permitir o fluxo de SU-8 e relaxar por ~ 10 s. Ligue o spin-coater e rampa a sua velocidade até 0-500 rpm por 5 s; manter a 500 rpm por 10 s; rampa até a velocidade final de mais de 10 s e manter a velocidade final de 30 s. A velocidade final depende da espessura do revestimento alvo e os SU-8 usada. Os detalhes podem ser encontrados em <a href="http://www.microchem.com/">http://www.microchem.com/</a> 4. Soft-bake Após o revestimento do wafer, cozê-lo primeiro em 65 ° C e depois a 95 ° C. O tempo de cozimento varia de acordo com a espessura alvo e tipo de fotorresiste utilizado. Então, deixe o wafer sentar-se à temperatura ambiente por pelo menos 5 min. 5. Exposição Colocar a máscara em cima do wafer e expor a hóstia à luz UV durante o tempo recomendado no manual do SU-8. 6. Pós-exposição bake Asse o wafer de 65 ° C e 95 ° C, em seguida, após o SU-8 manual de instruções. 7. Desenvolvimento do wafer para obter o &quot;master&quot; (molde) Prepare um copo cheio do desenvolvedor (PMMA). Mergulhar a bolacha no copo, enquanto muito gentilmente oscilando o copo até que a parte não exposta do fotorresiste é lavado. Em nosso laboratório: 8. Prepare PDMS e derramá-lo sobre o wafer Misture o PDMS com seu agente de cura em razão de 10:1 em um copo. Mexa e misture de forma homogênea: isso vai gerar muitas bolhas e fazer a mistura olhar opaco. Despeje a mistura sobre o &quot;mestre&quot;. 9. De-bolha no vácuo da câmara Para remover as bolhas, colocou a mistura mestre e PDMS que está cobrindo-o em uma câmara de vácuo até que todas as bolhas se foram. 10. Assando no forno Leve ao forno por, pelo menos, 12 horas em estufa a 65 ° C para endurecer o PDMS. 11. Furos Retire a PDMS do mestre e furos para entradas e saídas dos canais. Em salas limpas (não mostrado) 12. Plasma de ligação Canais são ligados a uma lâmina de vidro após o tratamento tanto a camada de PDMS e lâmina de vidro com plasma de oxigênio por 1 min. Experimentos: Exp # 1: Investigar a resposta quimiotática de micróbios marinhos para micro-escala camadas de nutrientes 1) Configurando o experimento <ol><li> Adicionar organismos e substratos para seringas de vidro </li><li> Lugar canal microfluídicos para o palco microscópio e anexar tubulação para entradas e saídas apropriadas </li><li> Conecte a tubulação de resíduos do reservatório. Certifique-se de tubulação é totalmente submersos no fluido no reservatório de resíduos para evitar oscilações de pressão </li><li> Seringas lugar em bomba de seringa e conecte-se válvulas e tubulação </li><li> Configurar microscópio: condições de iluminação, ampliação, etc </li><li> Concentre-se em posição apropriada no canal </li><li> De-bolha canal usando seringa maior cheia com água do mar artificial </li><li> Defina a taxa de fluxo apropriado em bomba de seringa. Neste caso, 2 ml / min, que corresponde a uma velocidade de fluxo médio de 220 ​​mm s -1 no canal </li></ol> 2) A execução do experimento <ol><li> Iniciar bomba de seringa para estabelecer um gradiente de nutrientes no canal </li><li> Quando o fluxo se estabilizou, e uma banda de nutrientes tem desenvolvido, interromper o fluxo da bomba de seringa e começar a gravar o tempo a partir deste ponto </li><li> Banda de nutrientes começa a se difundir lateralmente </li><li> Em intervalos regulares de tempo, use o software de análise de imagem para gravar sequências de frames para criar &quot;filmes&quot; </li><li> Discriminar os organismos de natação, tendo tempo de diferença entre duas imagens quadros subseqüentes, de modo que somente objetos em movimento agora são visualizadas, permitindo-nos diferenciar células móveis de não-movimento de partículas e de ruído de fundo </li><li> Fazer filmes para determinar posições de células do canal com referência ao pOSIÇÃO do patch de nutrientes </li><li> Gravar filmes em intervalos regulares por 10-20 min para analisar as posições e padrões de natação de organismos </li><li> Usando o software de análise de imagem para sobrepor as posições de organismos em diferentes quadros (atribuindo a cada pixel a intensidade de luz máxima registrada naquele pixel ao longo da duração do filme), podemos obter informações trajetória para as células de natação </li></ol> Exp # 2: Investigar os efeitos de cisalhamento em bactérias marinhas nadando em um vortexZ <ol><li> Usando a geometria canal diferente, podemos observar o comportamento das bactérias nadando em um vórtice em diferentes taxas de cisalhamento </li></ol>

<ol><li>Azam, F., Malfatti, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microbial+structuring+of+marine+ecosystems%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Microbial structuring of marine ecosystems.</a> Nature Reviews Microbiology. 5, 782-791 (2007).</li>
<li>Blackburn, N., Azam, F., Hagstrom, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatially+explicit+simulations+of+a+microbial+food+web.+%5BTitle%5D)+AND+%22Limnology+and+Oceanography%22%5BJournal%5D)">Spatially explicit simulations of a microbial food web. </a> Limnology and Oceanography. 42, 613-622 (1997).</li>
<li>Blackburn, N., Fenchel, T., Mitchell, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microscale+nutrient+patches+in+plankton+habitats+shown+by+chemotactic+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Microscale nutrient patches in plankton habitats shown by chemotactic bacteria.</a> Science. 282, 2254-2256 (1998).</li>
<li>Keymer, J. E., Galajda, P., Muldoon, C., Park, S., Austin, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+metapopulations+in+nanofabricated+landscapes%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Science%22%5BJournal%5D)">Bacterial metapopulations in nanofabricated landscapes.</a> Proceedings of the National Academy of Science. 103, 17290-17295 (2006).</li>
<li>Mao, H., Cremer, P. S., Manson, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+sensitive%2C+versatile+microfluidic+assay+for+bacterial+chemotaxis%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Science%22%5BJournal%5D)">A sensitive, versatile microfluidic assay for bacterial chemotaxis.</a> Proceedings of the National Academy of Science. 100, 5449-5454 (2003).</li>
<li>Marcos,, Stocker, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microorganisms+in+vortices%3A+a+microfluidic+setup%5BTitle%5D)+AND+%22Limnology+and+Oceanography%3A+Methods%22%5BJournal%5D)">Microorganisms in vortices: a microfluidic setup.</a> Limnology and Oceanography: Methods. 4, 392-398 (2006).</li>
<li>Park, S., Wolanin, P. M., Yuzbahyan, E. A., Lin, H., Darnton, N. C., Stock, J. B., Silberzan, P., Austin, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influence+of+topology+on+bacterial+social+interaction%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Influence of topology on bacterial social interaction.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 100, 13910-13915 (2003).</li>
<li>Whitesides, G. M., Ostuni, E., Takayama, S., Jiang, X., Ingber, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Soft+lithography+in+biology+and+biochemistry%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Biomedical+Engineering%22%5BJournal%5D)">Soft lithography in biology and biochemistry.</a> Annual Review of Biomedical Engineering. 3, 335-373 (2001).</li>
</ol>

Uma compreensão de como micróbios marinhos interagem com seus química local e ambiente físico é imprescindível para uma percepção mais completa e precisa do papel de microorganismos planctônicos na nutrientes e carbono oceanos ciclos (Azam e Malfatti 2007). No entanto, devido à pequena escala (mm &lt;) sobre o qual muitas interações microbiana importante ter lugar, as limitações técnicas impediram exames detalhados do comportamento microbiano na paisagem bio-físico-químicas heterogêneas previsto para ser experimentado por micróbios nadar no...

<table><tbody><tr><td>PDMS, Sylgard 184</td><td>Kit de Elastômero de Silicone</td><td>Dow Corning</td><td></td><td>http://www.ellsworth.com/sylgard.html</td></tr><tr><td>SU8-2100</td><td>Fotolito</td><td>MicroChem Corp.</td><td></td><td>www.microchem.com</td></tr><tr><td>Nikon Eclipse TE2000-E microscópio invertido</td><td>Microscópio</td><td>Nikon Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tubo de PEEK (0,762 mm de diâmetro interno, 1,59 mm de diâmetro externo)</td><td>Ferramenta</td><td>Upchurch Scientific</td><td></td><td>www.upchurch.com</td></tr><tr><td>Seringas (ponta Luer-Lok)</td><td>Ferramenta</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Conector Parte P-704-01</td><td>Ferramenta</td><td>Upchurch Scientific</td><td></td><td>Para conectar tubos a seringas com ponta Luer-Lok</td></tr><tr><td>Bomba de Seringa (PHD 2000 Programável)</td><td>Equipamento</td><td>Harvard Apparatus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Câmera CCD (PCO 1600)</td><td>Equipamento</td><td>Cook</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

resposta quimiotática de microorganismos marinhos para micro-escala de camadas de nutrientes

Chemotactic Response of Marine Micro-Organisms to Micro-Scale Nutrient Layers

O grau em que os micróbios podem explorar planktonic manchas de recursos microescala terá implicações consideráveis ​​para trophodynamics oceânicas e de fluxo biogeoquímicos. No entanto, para tirar proveito de patches de nutrientes no oceano, os micróbios natação deve superar as influências de forças físicas incluindo a difusão molecular e turbulenta de cisalhamento, o que limitará a disponibilidade de patches e a capacidade das bactérias para localizá-los. Até recentemente, as limitações metodológicas têm impedido exames direta do comportamento microbiano dentro de habitats irregular e condições realistas de pequena escala de fluxo. Assim, muito do nosso conhecimento atual em relação ao comportamento microbiano no oceano foi obtida a partir de previsões teóricas. Para obter novas informações sobre o comportamento de forrageamento microbiana no oceano temos aplicado suave técnicas de fabricação litográfica para desenvolver dois dispositivos microfluídicos, que temos usado para criar (i) micro nutrientes manchas com dimensões e características difusivos relevantes para processos oceânicos e (ii) microescala vórtices, com taxas de cisalhamento correspondente aos esperados no oceano. Estes dispositivos microfluídicos têm permitido um primeiro exame direto de natação microbiana e comportamento quimiotáticos dentro de um seascape heterogêneo e dinâmico. O uso combinado de epifluorescência e microscopia de contraste de fase permitem exames diretos das dimensões físicas e as características difusivo de patches de nutrientes, enquanto observa a resposta agregativa em nível de população, além do comportamento de natação de micróbios individuais. Esses experimentos revelaram que algumas espécies de fitoplâncton, bactérias heterotróficas e protistas phagotrophic são peritos em localizar e explorar difusão manchas de recursos microescala em prazos muito curtos. Também mostramos que até moderada taxas de cisalhamento, bactérias marinhas são capazes de lutar contra o fluxo e nadar através de seu ambiente de sua própria vontade. No entanto, além de um nível de cisalhamento alto limiar, bactérias estão alinhados no fluxo de cisalhamento e são menos capazes de nadar sem perturbação do fluxo. Microfluídica representa uma nova abordagem e barato para estudar a ecologia microbiana aquática, e devido a sua aptidão para a criação de campos de fluxo com precisão realista e gradientes de substrato em microescala, é idealmente aplicável aos exames de comportamento microbiana nas menores escalas de interação. Assim, sugerimos que a microfluídica representa uma valiosa ferramenta para a obtenção de uma melhor compreensão da ecologia de microrganismos no oceano.

A fabricação de canais microfluídicos ea sua aplicação em experimentos para estudar o comportamento de forrageamento quimiotática de micróbios marinhos de uma seascape irregular de nutrientes eo comportamento de natação de bactérias dentro do fluxo de cisalhamento são descritos.

Resposta quimiotática de microorganismos marinhos para Micro-Escala de Camadas de nutrientes

A medida em que os micróbios planctônicos conseguem explorar manchas de recursos em microescala terá implicações consideráveis para a trofodinâmica oceânica e ...

Olá, meu nome é Marcos. Estou trabalhando com o Professor Roman Stalker no Departamento de Engenharia Civil e Ambiental do MIT e vou mostrar a vocês como fabricar um microcanal utilizando a técnica de auto-fotografia. E para começar, precisamos projetar uma máscara.Então, esta é a máscara, que é basicamente o design final do microcanal que pretendemos criar. Este é o projeto de um injetor, com o qual podemos produzir uma camada fina de nutriente onde colocamos microrganismos nadando ao redor, e observamos como ocorre o quimiotaxismo. Este é um canal com uma cavidade lateral para gerar um microvórtice dentro da cavidade. Haverá um vídeo demonstrando isso posteriormente. Após obter a máscara, levamos as pastilhas até a sala limpa e as colocamos na placa de Petri. E agora vamos para a sala limpa.Ok, então, após termos a nossa máscara impressa e pronta, agora estamos na sala limpa para realizar as microfabricações propriamente ditas. E o que vou fazer agora é pegar um pedaço da pastilha limpa que acabei de adquirir e quero apenas garantir que ela esteja extra limpa utilizando os seguintes três solventes. O primeiro passo é limpar com acetona e, em seguida, imediatamente com metanol.E e

chemotactic-response-marine-micro-organisms-to-micro-scale-nutrient

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Estudos de Quimiotaxia bacteriana Usando microfluídica - Entrevista

Este protocolo descreve o desenvolvimento de um dispositivo micro para investigar quimiotaxia bacteriana em gradientes de concentração estável de chemoeffectors.

Um dispositivo micro para Quantificar Quimiotaxia bacteriana em gradientes de concentração estável

Aqui, apresentamos um protocolo abrangente para avaliar a disponibilidade de nutrientes orgânicos e inorgânicos e a abundância e estrutura das comunidades microbianas e virais em ambientes marinhos remotos.

Desvendando os jogadores invisíveis no Oceano - Um Guia de Campo para Química da Água e Microbiologia Marinha

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Avaliação de Dictyostelium discoideum resposta à estimulação mecânica aguda

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Gerando paisagens químicas controladas e dinâmicas para estudar comportamento microbiano

Apresentado aqui está o protocolo para um ensaio in situ chemotaxis, um dispositivo microfluido recentemente desenvolvido que permite estudos de comportamento microbiano diretamente no ambiente.

In Situ Chemotaxis Assay para examinar o comportamento microbiano em ecossistemas aquáticos

Apresentamos um protocolo para o dispositivo de cultura contínua milifluida (MCCD), que permite o cultivo de populações bacterianas sob condições constantes de baixo teor de nutrientes (até centenas de concentrações nanomolares) ou flutuações temporais de nutrientes em uma escala de tempo minuciosa.

Um dispositivo milifluido contínuo para cultura para o estudo de Escherichia coli sob condições nutritivas baixas e flutuantes

Jared Leadbetter nos leva para um passeio pela natureza através da diversidade de vida residentes no intestino grosso de cupim - um microambiente contendo 250 espécies diferentes encontradas em nenhum outro lugar na Terra. Jared revela que a simbiose exibida por este sistema é multi-camadas e envolve não apenas uma relação entre os cupins e seus habitantes intestino, mas também envolve uma complexa rede de simbiose entre os micróbios do intestino si.

Camadas de Simbiose - Visualizando a térmita comunidade microbiana do intestino posterior

Micro-escala de Engenharia de Biologia Celular

Nós apresentamos um método para gerar cDNA de mRNA ambiental. Em geral, o total de RNA é a primeira coletados do ambiente, rRNA é seletivamente removido, mRNA é seletivamente amplificado, e cDNA sintetizado a partir do pool de mRNA enriquecido é seqüenciado. Seqüências recuperadas podem ser anotados usando técnicas padrão de bioinformática para identificar os genes expressos.

Analisando Expressão Gênica de comunidades microbianas Marinha usando transcriptômica Ambiental

Aprenda a fabricar canais microfluídicos para estudar a quimiotaxia de microrganismos marinhos e o comportamento de natação bacteriana em fluxo de cisalhamento. Esta técnica permite visualizar dinâmicas microbianas em gradientes de nutrientes.

Resposta quimiotática de microorganismos marinhos para Micro-Escala de Camadas de nutrientes

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