Name: Chemotactische respons van mariene micro-organismen aan Micro-Scale voedingsstoffen Lagen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2007-05-28T00:00:00.000+00:00
Duration: 22 min 38 s
Description: Leer hoe microfluidische kanalen worden gefabriceerd om chemotactisch foerageergedrag van mariene micro-organismen te bestuderen. Deze methode onthult bacteriële zwempatronen in schuifstroming en nutriëntdynamiek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

We willen graag Microsystems Technology Laboratories bij MIT bedanken voor het toestaan ​​van ons om film deel uit van deze video in de clean room faciliteit.

Voorbereiding 1. Maak een masker <blockquote> Met behulp van een CAD-software, het ontwerp van het kanaal voor hoge resolutie afdrukken op een transparantie. Dit zal de &quot;masker&quot; te zijn. </blockquote> In de clean room: 2. Schoon en bak de wafer De eerste, spuiten de wafer met aceton, dan snel met methanol, daarna met isopropanol. Tot slot, droog de wafer met behulp van stikstof. Bak de wafer in de oven (130 ° C) gedurende 5 minuten. 3. Coaten van de wafer Plaats de wafer in het midden van de spin-coating machine. Giet fotolak (SU-8) uit de fles op de wafer. Laat de SU-8 flow en te ontspannen voor ~ 10 s. Zet de spin-coater en de helling zijn snelheid tot 0 tot 500 tpm meer dan 5 s; te houden bij 500 rpm gedurende 10 s, oprit tot aan de uiteindelijke snelheid van meer dan 10 s en te handhaven op eindsnelheid voor 30 s. De uiteindelijke snelheid is afhankelijk van de beoogde coating dikte en de SU-8 gebruikt. De details zijn te vinden op <a href="http://www.microchem.com/">http://www.microchem.com/</a> 4. Soft-bakken Na het coaten van de wafer, bak het eerst bij 65 ° C en vervolgens bij 95 ° C. De baktijd varieert met gerichte dikte en het type van de fotolak wordt gebruikt. Vervolgens laat de wafer op kamertemperatuur zitten voor ten minste 5 minuten. 5. Blootstelling Plaats het masker op de top van de wafer en bloot de wafer aan UV-licht voor de tijd aanbevolen in de SU-8 handleiding. 6. Post-exposure bakken Bak de wafer bij 65 ° C en vervolgens 95 ° C naar aanleiding van de SU-8 handleiding de instructies. 7. Ontwikkeling van de wafer aan de &quot;master&quot; (mal) te verkrijgen Bereid een beker gevuld met de ontwikkelaar (PMMA). Dompel de wafer in de beker, terwijl heel voorzichtig oscillerende de beker tot de niet-belichte deel van de fotoresist is weggespoeld. In ons lab: 8. Bereid PDMS en giet het op de wafer Meng de PDMS met de verharder in de 10:01-verhouding in een beker. Roer en meng het homogeen: dit zal genereren veel belletjes en maak het mengsel ondoorzichtige look. Giet het mengsel op de &quot;master&quot;. 9. De-bubble in vacuümkamer Voor het verwijderen van de belletjes, plaatste de meester en PDMS mengsel dat het over in een vacuümkamer totdat alle luchtbellen verdwenen zijn. 10. Bakken in de oven Bak gedurende minstens 12 uur in een oven op 65 ° C te harden van de PDMS. 11. Gaatjes Verwijder de PDMS van de meester en punch gaten voor inlaten en uitlaten van de kanalen. In cleanroom (niet afgebeeld) 12. Plasma bonding Kanalen worden gebonden aan een glaasje na het behandelen van zowel de PDMS-laag en het glazen schuif met zuurstof plasma gedurende 1 minuut. Experimenten: Exp # 1: Onderzoek naar de chemotactische respons van mariene microben op micro-schaal voedingsstoffen lagen 1) Het opzetten van het experiment <ol><li> Voeg organismen en substraten op glas spuiten </li><li> Plaats microfluïdische kanaal op microscoop podium en hechten leidingen de juiste in-en uitgangen </li><li> Sluit de slang aan op reservoir afval. Zorg ervoor dat buizen is volledig ondergedompeld in de vloeistof in het afval reservoir om drukschommelingen te vermijden </li><li> Plaats de spuiten op spuitpomp en verbinding maken met kleppen en buizen </li><li> Stel microscoop: lichtomstandigheden, vergroting, etc. </li><li> Focus op juiste positie in het kanaal </li><li> De-bubble kanaal met grotere injectiespuit gevuld met kunstmatig zeewater </li><li> Stel juiste debiet op de injectiepomp. In dit geval 2 ml / min, wat tot een gemiddelde stroomsnelheid van 220 micrometer s -1 overeenkomt met het kanaal </li></ol> 2) Het uitvoeren van de experiment <ol><li> Start spuit pomp naar een voedingsstof gradiënt in het kanaal tot stand </li><li> Zodra stroom heeft gestabiliseerd en een band van voedingsstoffen heeft ontwikkeld, stop de doorstroming op de spuit pomp en begint op te nemen tijd vanaf dit punt </li><li> Voedingsstoffen band begint te zijwaarts diffuse </li><li> Op regelmatige tijdstippen gebruik beeldanalyse software om sequenties van frames record &#39;films&#39; te creëren </li><li> Discrimineren zwemmen organismen door het nemen van time-beelden verschil tussen twee opeenvolgende frames, zodat alleen bewegende objecten nu zichtbaar zijn, waardoor we beweeglijke cellen te onderscheiden van niet-bewegende deeltjes en achtergrondruis </li><li> Neem de films tot posities van cellen in het kanaal aan de hand te bepalen van de pSTANDPUNT van de nutriënt patch </li><li> Films opnemen op regelmatige tijdstippen gedurende 10-20 min om de posities en zwemmen patronen van organismen te analyseren </li><li> Door het gebruik van de beeldanalyse software om de posities van de organismen in verschillende frames (toekennen aan elke pixel de maximale lichtintensiteit opgenomen in die pixel over de duur van de film) over elkaar, kunnen wij traject informatie te verkrijgen om in te zwemmen cellen </li></ol> Exp # 2: Onderzoek naar de effecten van de afschuiving op mariene bacteriën zwemmen in een vortexZ <ol><li> Met behulp van verschillende kanalen geometrie, kunnen we observeren het gedrag van bacteriën zwemmen in een draaikolk bij verschillende afschuifsnelheden </li></ol>

<ol><li>Azam, F., Malfatti, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microbial+structuring+of+marine+ecosystems%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Microbial structuring of marine ecosystems.</a> Nature Reviews Microbiology. 5, 782-791 (2007).</li>
<li>Blackburn, N., Azam, F., Hagstrom, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatially+explicit+simulations+of+a+microbial+food+web.+%5BTitle%5D)+AND+%22Limnology+and+Oceanography%22%5BJournal%5D)">Spatially explicit simulations of a microbial food web. </a> Limnology and Oceanography. 42, 613-622 (1997).</li>
<li>Blackburn, N., Fenchel, T., Mitchell, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microscale+nutrient+patches+in+plankton+habitats+shown+by+chemotactic+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Microscale nutrient patches in plankton habitats shown by chemotactic bacteria.</a> Science. 282, 2254-2256 (1998).</li>
<li>Keymer, J. E., Galajda, P., Muldoon, C., Park, S., Austin, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+metapopulations+in+nanofabricated+landscapes%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Science%22%5BJournal%5D)">Bacterial metapopulations in nanofabricated landscapes.</a> Proceedings of the National Academy of Science. 103, 17290-17295 (2006).</li>
<li>Mao, H., Cremer, P. S., Manson, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+sensitive%2C+versatile+microfluidic+assay+for+bacterial+chemotaxis%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Science%22%5BJournal%5D)">A sensitive, versatile microfluidic assay for bacterial chemotaxis.</a> Proceedings of the National Academy of Science. 100, 5449-5454 (2003).</li>
<li>Marcos,, Stocker, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microorganisms+in+vortices%3A+a+microfluidic+setup%5BTitle%5D)+AND+%22Limnology+and+Oceanography%3A+Methods%22%5BJournal%5D)">Microorganisms in vortices: a microfluidic setup.</a> Limnology and Oceanography: Methods. 4, 392-398 (2006).</li>
<li>Park, S., Wolanin, P. M., Yuzbahyan, E. A., Lin, H., Darnton, N. C., Stock, J. B., Silberzan, P., Austin, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influence+of+topology+on+bacterial+social+interaction%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Influence of topology on bacterial social interaction.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 100, 13910-13915 (2003).</li>
<li>Whitesides, G. M., Ostuni, E., Takayama, S., Jiang, X., Ingber, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Soft+lithography+in+biology+and+biochemistry%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Biomedical+Engineering%22%5BJournal%5D)">Soft lithography in biology and biochemistry.</a> Annual Review of Biomedical Engineering. 3, 335-373 (2001).</li>
</ol>

Een inzicht in hoe mariene microben interactie met hun lokale chemische en fysieke omgeving is noodzakelijk voor een meer volledige en nauwkeurige perceptie van de rol van de planktonische micro-organismen in de oceanen voedingsstoffen en koolstof cycli (Azam en Malfatti 2007). Echter, vanwege de kleine schaal (&lt;mm) waarover veel belangrijke microbiële interacties plaatsvinden, technische beperkingen hebben verhinderd gedetailleerd onderzoek van microbiële gedrag binnen de heterogene bio-fysisch-chemische landschap voorspeld worden ervar...

<table><tbody><tr><td>PDMS, Sylgard 184</td><td>Siliconen elastomeer kit</td><td>Dow Corning</td><td></td><td>http://www.ellsworth.com/sylgard.html</td></tr><tr><td>SU8-2100</td><td>Fotolak</td><td>MicroChem Corp.</td><td></td><td>www.microchem.com</td></tr><tr><td>Nikon Eclipse TE2000-E omgekeerde microscoop</td><td>Microscoop</td><td>Nikon Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PEEK-slangen (0,762 mm ID, 1,59 mm OD)</td><td>Hulpmiddel</td><td>Upchurch Scientific</td><td></td><td>www.upchurch.com</td></tr><tr><td>Spuiten (Luer-Lok tip)</td><td>Hulpmiddel</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Koppelstuk onderdeel P-704-01</td><td>Hulpmiddel</td><td>Upchurch Scientific</td><td></td><td>Om slangen aan Luer-Lok tip spuiten te verbinden</td></tr><tr><td>Spuitpomp (PHD 2000 Programmeerbaar)</td><td>Apparatuur</td><td>Harvard Apparatus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CCD-camera (PCO 1600)</td><td>Apparatuur</td><td>Cook</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

chemotactische respons van mariene micro-organismen aan micro-scale voedingsstoffen lagen

Chemotactic Response of Marine Micro-Organisms to Micro-Scale Nutrient Layers

De mate waarin planktonische micro-organismen kunnen exploiteren microschaal bron patches zullen aanzienlijke gevolgen hebben voor oceanische trophodynamics en biogeochemische flux. Echter, om te profiteren van voedingsstoffen plekken in de oceaan, zwemmen microben moeten de invloeden van de fysieke krachten waaronder moleculaire diffusie en turbulente shear, die de beschikbaarheid van patches en het vermogen van bacteriën om ze op te sporen zullen beperken overwinnen. Tot voor kort waren de methodologische beperkingen uitgesloten direct onderzoeken van de microbiële gedrag binnen fragmentarisch habitats en realistische kleinschalige stromingscondities. Vandaar, heeft veel van onze huidige kennis over het gedrag van micro-organismen in de oceaan is verkregen van de theoretische voorspellingen. Om nieuwe informatie op de microbiële foerageergedrag te verkrijgen in de oceaan we hebben toegepast zachte lithografische fabricagetechnieken tot en met 2 microfluïdische apparaten, die we hebben gebruikt voor het maken (i) microschaal voedingsstoffen patches met afmetingen en diffusieve eigenschappen die relevant zijn voor oceanische processen en (ii) microschaal te ontwikkelen draaikolken, met afschuifsnelheden die overeenkomen met de verwachting in de oceaan. Deze microfluïdische apparaten hebben toegestaan ​​een eerste directe onderzoek van microbiële zwemmen en chemotactische gedrag binnen een heterogene en dynamische zeegezicht. Het gecombineerde gebruik van epifluorescentie-en fase-contrast-microscopie mogelijk direct onderzoeken van de fysieke afmetingen en diffusieve kenmerken van voedingsstoffen patches, met inachtneming van de populatie-niveau aggregatieve respons, in aanvulling op het zwembad gedrag van individuele microben. Deze experimenten is gebleken dat sommige soorten fytoplankton, heterotrofe bacteriën en phagotrophic protisten zijn bedreven in het opsporen en de exploitatie van verspreiden microschaal bron vlekken binnen zeer korte tijd frames. We hebben ook aangetoond dat tot afschuifsnelheden matig, mariene bacteriën zijn in staat om de stroming en zwemmen door hun omgeving te vechten op hun eigen beweging. Echter, boven een drempel hoge afschuiving niveau, zijn bacteriën uitgelijnd in de afschuiving stroom en zijn minder in staat om te zwemmen zonder verstoring van de stroom. Microfluidics is een nieuwe en goedkope aanpak voor het bestuderen van levende microbiële ecologie, en door zijn geschiktheid om nauwkeurig het creëren van realistische stroming velden en substraat gradiënten op de microschaal, is ideaal voor de examens van microbieel gedrag op de kleinste schalen van interactie. Wij stellen daarom voor dat microfluidics een waardevol instrument voor het verkrijgen van een beter begrip van de ecologie van micro-organismen in de oceaan vertegenwoordigt.

De fabricage van microfluïdische kanalen en de uitvoering daarvan in experimenten voor het bestuderen van de chemotactische foerageergedrag van mariene microben in een fragmentarische voedingsstof zeegezicht en het zwemgedrag van de bacteriën in shear stroming worden beschreven.

Chemotactische respons van mariene micro-organismen aan Micro-Scale voedingsstoffen Lagen

De mate waarin planktonische microben micro-schaal resourcepatches kunnen benutten, zal aanzienlijke implicaties hebben voor de oceanische trofodynamica en ...

Hoi, mijn naam is Marcos. Ik werk samen met professor Roman Stalker bij Civil Environmental Engineering aan MIT en ik zal u laten zien hoe u een microkanaal maakt met behulp van de zelf-fotografietechniek. Om te beginnen moeten we een masker ontwerpen.Dit is het masker, wat in feite het uiteindelijke ontwerp is van het microkanaal dat we willen maken. Dit is het ontwerp van een injector, waarmee we een dunne laag voedingsstoffen kunnen creëren waarin we micro-organismen laten zwemmen om te zien hoe de chemotaxis werkt, en dit is een kanaal met een zijholte om een microvortex in de holte te genereren; hiervan volgt later in de video een demonstratie. Nadat we het masker hebben verkregen, nemen we de wafers mee naar de cleanroom en plaatsen we deze in de petrischaal. We gaan nu naar de cleanroom.Nu het masker is geprint en gereed, bevinden we ons in de cleanroom voor de eigenlijke microfabricage. Wat ik nu ga doen, is een stuk van de schone wafer nemen dat ik zojuist heb aangeschaft; ik wil er zeker van zijn dat deze extra schoon is door de volgende drie oplosmiddelen te gebruiken. De eerste stap is reinigen met aceton en vervolgens direct met methanol.Vervolgens is de laatste stap i

chemotactic-response-marine-micro-organisms-to-micro-scale-nutrient

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Studies van Bacteriële Chemotaxis gebruik Microfluidics - Interview

Dit protocol beschrijft de ontwikkeling van een microfluïdische apparaat voor het onderzoeken van bacteriële chemotaxis in stabiele concentratiegradiënten van chemoeffectors.

Een microfluïdische apparaat voor het kwantificeren van Bacteriële Chemotaxis in stabiele concentratiegradiënten

Hier presenteren we een uitgebreid protocol om de beschikbaarheid van organische en anorganische voedingsstoffen en de abundantie en structuur van microbiële en virale gemeenschappen in afgelegen mariene omgevingen te beoordelen.

Het ontrafelen van de Unseen Spelers in de Oceaan - A Field Guide to Water chemie en Mariene Microbiologie

Hier beschrijven we methoden voor de beoordeling van de cellulaire reactie op acute mechanische stimulatie. In de microscopie gebaseerde assay onderzoeken we lokalisatie van fluorescently-geëtiketteerden biosensoren na korte stimulatie met schuintrekken stroom. We testen ook activering van verschillende eiwitten van belang in reactie op acute mechanische stimulatie biochemically.

Beoordeling van Dictyostelium discoideum reactie op Acute mechanische stimulatie

Een protocol voor de generatie van dynamische chemische landschappen door fotolyse binnen microfluïde en millifluïde opstellingen wordt gepresenteerd. Deze methodologie is geschikt om diverse biologische processen te bestuderen, waaronder het motile gedrag, de opname van voedingsstoffen of aanpassing aan chemische stoffen van micro-organismen, zowel op eencellig als populatieniveau.

Het genereren van gecontroleerde, dynamische chemische landschappen om microbieel gedrag te bestuderen

Hier gepresenteerd is het protocol voor een in situ chemotaxis test, een recent ontwikkeld microfluïdisch apparaat dat studies van microbiële gedrag direct in de omgeving mogelijk maakt.

In Situ Chemotaxis Assay to Examine Microbial Behavior in Aquatic Ecosystems

We presenteren een protocol voor het millifluidische continue kweekapparaat (MCCD), waarmee bacteriële populaties onder constante omstandigheden met weinig nutriënten (tot honderden nanomolaire concentraties) of temporele nutriëntenfluctuaties op een minimale tijdschaal kunnen worden gekweekt.

Een continu kweek millifluidisch apparaat voor de studie van Escherichia coli onder lage en fluctuerende voedingsomstandigheden

Jared Leadbetter neemt ons mee voor een wandeling in de natuur door de diversiteit van het leven woonachtig zijn in de termiet einddarm - een micro-omgeving met daarin 250 verschillende soorten die nergens anders op aarde. Jared blijkt dat de symbiose vertoond door dit systeem is multi-layered en omvat niet alleen een relatie tussen de termiet en zijn darmen inwoners, maar ook betrekking heeft op een complex web van symbiose tussen de darm microben zelf.

Lagen van Symbiose - Het visualiseren van de Termite einddarm microbiële gemeenschap

Micro-scale Engineering voor Celbiologie

We presenteren een methode voor het genereren van cDNA van milieu-mRNA. In het algemeen, totaal RNA eerste is verzameld uit de omgeving, is rRNA selectief verwijderd, mRNA wordt selectief versterkt, en cDNA gesynthetiseerd uit de verrijkte mRNA zwembad is gesequenced. Herstelde sequenties kunnen worden geannoteerd met behulp van standaard bioinformatica technieken om de uitdrukking genen te identificeren.

Het analyseren van genexpressie van Marine microbiële gemeenschappen met behulp van het milieu transcriptomics

Leer hoe microfluidische kanalen worden gefabriceerd om chemotactisch foerageergedrag van mariene micro-organismen te bestuderen. Deze methode onthult bacteriële zwempatronen in schuifstroming en nutriëntdynamiek.

Chemotactische respons van mariene micro-organismen aan Micro-Scale voedingsstoffen Lagen

Meer video's verkennen