Name: フローサイトメトリーで固定し、生細胞におけるカルパイン活性の測定 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-07-08T17:15:00.000+00:00
Duration: 11 min 37 s
Description: 学ぶフローサイトメトリーによる固定細胞と生細胞におけるカルパイン活性測定法。蛍光基質BUC-LMC-MACを用いて白血球やリンパ腫細胞のプロテアーゼ活性を解析し、疾患研究に応用する。

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保健研究、カナダの白血病とリンパ腫協会とカナダのリンパ腫財団のカナダの協会からの補助金によって支え。

試薬を準備する注：すべてのPBSは、Ca 2 +およびMg 2を含む+ <ol><li>検出試薬 室温のPBSに20μM7 - アミノ-4 - クロロメチルクマリン、T - BOC -ロイシン - メチオニンアミド（BOC - LM - CMAC）を追加します。各細胞懸濁液は、2mLの検出試薬が必要になります。 </li><li> 1％パラホルムアルデヒド（固定セル） 室温のPBS中4％パラホルムアルデヒドのストック溶液を希釈する。各FACSチューブへ分注し1mLの1％パラホルムアルデヒド。三FACSチューブは、各実験条件（例：32Dkit、32Dkit + PD150606、32Dkit + PD98059必要性9 FACSチューブ）のために必要です。 </li><li> PD150606（カルパイン阻害剤） 100mmの最終濃度にDMSOで再構成PD150606。この試薬と、この実験の期間中、軽いからそれで処理するすべてのセルを保護する。 </li><li> PD98059（MEK1阻害剤） 50mmの最終濃度にDMSOで再構成PD98059。 </li></ol>セルを準備する<ol><li> IL - 3（またはIL - 3などのための他のソースのソースとして5％ウシ胎児血清、WEHI - 3上清を添加したのOpti - MEM培地中でmL当たり5 × 10 5〜1 × 10 6細胞で32Dkit細胞を成長させる組換えタンパク質として）、0.1％2 - メルカプトエタノール及び抗生物質。 </li><li> three 15mlのファルコンチューブ（試験管当たり4 × 10 6細胞）に12 × 10 6 32Dkit細胞を集めます。 </li><li> 15℃5分間1000rpmでペレットは、細胞を℃に</li><li>上清を吸引除去する。 2mLの室温のPBSで細胞を再懸濁します。 </li><li> 50μMPD150606で一つの細胞懸濁液を扱います。サンプルをアルミ箔でファルコンチューブを被覆して光から保護されていることを確認します。ボルテックスは簡潔にして暗所で室温で20分から30分インキュベートする。 </li><li> 20μMPD98059と第二の細胞懸濁液を扱います。板37で2時間35ミリメートル組織培養皿とインキュベートにおける細胞℃に</li></ol>固定化細胞におけるカルパインのアッセイ<ol><li>サンプルはPD150606と共にインキュベートされているが、未処理の試料でカルパインアッセイを開始します。各細胞懸濁液に2mLの検出試薬を追加することから始めます。直ちに1％パラホルムアルデヒド（0分の時点）で事前に準備されたFACSチューブに細胞懸濁液/検出試薬の混合液1mLを加える。 </li><li>室温で5分間検出試薬で細胞懸濁液をインキュベートする。次に1mLの1％パラホルムアルデヒドでFACSチューブに細胞懸濁液1mLを加える。 </li><li>室温でさらに5分間検出混合物を用いて細胞懸濁液をインキュベート続ける。次に1mLの1％パラホルムアルデヒドでFACSチューブに細胞懸濁液1mLを加える。 </li><li>阻害剤で治療されている32Dkit細胞のカルパインのアッセイを繰り返します。 </li><li> 4℃で暗所で一晩細胞を固定℃に</li><li>翌日ペレット15℃、5分間1800rpmで細胞を℃に</li><li>上清を吸引除去する。 750uL PBSで細胞を再懸濁します。氷の上に細胞を配置し、暗所で保管。 </li></ol>固定セルのデータを取得する<ol><li> LSR II（BDバイオサイエンス）を用いて細胞を分析する。フィルタは、光Xcyte（UV）レーザー、励起線波長355nm、レーザーパワー25mWを、それぞれ基板と製品の405と450nmの発光のために設定されています。基質と生成物のためのバンドパスフィルタは、20分の405と50分の450です。基質と生成物のためのロングパスフィルターは、405と450です。 PMT電圧は、製品の基板のための350から375と325から350に設定されました。 </li><li> 、側方散乱光、インド - 1ブルー（ログ）、インド- 1バイオレット（ログ）前方散乱：次のパラメータを持つBD FACSDiva実験アップを設定します。前方散乱対生きた細胞でのゲート（図1a）、インド- 1ブルーヒストグラム、インド- 1バイオレットのヒストグラム、インド - 1ブルー対インド- 1バイオレットと側方散乱ドットプロット：ワークシートに以下のグラフを設定するドットプロット。 </li><li> AlignFlowとAlignFlowプラス蛍光ビーズ（Invitrogen）でLSR IIを校正します。 PMT電圧は前の実験ごとに同じチャンネルでビーズ蛍光ヒストグラムのピークを配置するために調整する必要があります。 </li><li> 0分の時点で32Dkitセルを使用してデータの取得を開始。必要に応じて、パラメータの電圧を調整します。サンプル10,000個のイベントを取得し、記録する。 </li><li>各チューブの間にFACSバッファーでマシンをすすぎ、各サンプルのために買収を繰り返します。 </li><li>データをエクスポートします。 LSR IIは、研究所のガイドラインにしたがって洗浄されていることを確認します。 </li></ol>生細胞におけるカルパインのアッセイ<ol><li>ないPD150606と、上記のように細胞懸濁液を準備する。 LSR IIにサンプルを持参し、上記のようにフィルタとパラメータを設定します。上記のようにワークシートを設定します。インド- 1ブルー対時間を示す大規模なドットプロットが含まれています。最大numを取得するプログラムを設定するイベントのBER（無停止のゲート）。 </li><li> 32Dkit細胞の50μMPD150606 1つの細胞懸濁液を追加します。暗闇の中でサンプルを保ち、20〜30分室温でインキュベートする。 </li><li>ないPD150606と32D​​kit細胞懸濁液上にデータの取得を開始。毎秒200から300までのイベントの低流量を使用してください。 30秒から1分後にマシンからチューブを取り外します。細胞に20μMBOC - LM - CMACを追加。ボルテックスは簡潔にしてデータを取得し続けます。 </li><li> 10-20分間、またはカルパイン活性がプラトーになるまでデータを取得する。 </li><li> PD150606で処理32Dkit細胞と、手順3と4を繰り返します。 </li><li>データをエクスポートします。 LSR IIは、研究所のガイドラインにしたがって洗浄されていることを確認します。 </li></ol>コンプレックス（混合）細胞集団におけるカルパインのアッセイ *この実験は、マウスの脾臓から採取した細胞懸濁液に32Dkit細胞を識別します。 <ol><li>各マウスから脾臓を回収する。室温で10分間、NH 4 Clで赤血球を溶解する。 </li><li> 2mLのPBSで単一の細胞懸濁液を準備します。 </li><li>二つに各細胞懸濁液を分ける。暗所で室温で20〜30分間、50μMPD150606 1細胞懸濁液を扱います。 </li><li>固定化細胞におけるカルパインアッセイ（ステップ1-6）のために上記のように進んでください</li><li>上清を吸引除去する。 500μLのPBSで細胞を洗浄。上清を吸引除去する。 </li><li> 2％BSAを200μL染色バッファーで細胞を再懸濁します。室温で15分間インキュベートする。 </li><li>一次抗体（FITC抗マウスCD117）を準備する。抗体は、バッファを染色で1:200希釈で使用してください。抗体は暗所で保管されていることを確認します。 </li><li>細胞に200μL一次抗体を追加。暗所で室温で30分間インキュベートする。 </li><li>フローサイトメトリー用のボリュームを増加させる400μLPBSを追加。氷の上に細胞を配置し、暗所で保管。 </li><li>固定セルのデータを取得で説明されている手順に進みます。パラメータにFITC追加し、ワークシート上にFITCのヒストグラムが含まれています。 </li></ol>分析と代表の結果<ol><li> FlowJo（Treestar）を使用してデータを分析する。前方および側方散乱プロファイル（図1a）に基づいて、生細胞でのゲート。生細胞のゲート（図1b）からインドブルーの平均蛍光を決定します。 </li><li>混合細胞集団の場合） <ul><li> 32Dkit人口を識別するために、ヒストグラム、ドットプロットにFITCの蛍光を使用してください</li><li> 32Dkitの人口のインド - ブルーの平均蛍光を決定する</li></ul></li><li>平均蛍光（図2a）は、グラフにMicrosoft Excelを使用してください。 5〜10分の間の直線の傾きを計算する。グラフの傾き（図2b）細胞におけるカルパインの活性を決定するために棒グラフとして。 </li></ol><img src="/files/ftp_upload/2050/2050fig1a.jpg" alt="図1a" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図1a"> 図1a。前方および側方散乱プロファイルに基づいて生細胞を決定する。 <img src="/files/ftp_upload/2050/2050fig1b.jpg" alt="図1b" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図1b"> 図1bは、10分の時間経過とともに蛍光変化を平均。 <img src="/files/ftp_upload/2050/2050fig2a.jpg" alt="図2a" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図2a"> 図2a。平均蛍光の代表グラフ。 <img src="/files/ftp_upload/2050/2050fig2b.jpg" alt="図2b" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図2b"> インヒビターを有する32Dkit細胞における図2b。カルパイン活性。

<ol><li>Goll, D. E., Thompson, V. F., Li, H., Wei, W., Cong, J. The Calpain System. Physiol. Rev. 83, 731-801 (2003).</li>
<li>Niapour, M., Berger, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+Cytometric+Measurement+of+Calpain+Activity+in+Living+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+A%22%5BJournal%5D)">Flow Cytometric Measurement of Calpain Activity in Living Cells.</a> Cytometry A. 71A, 475-485 (2007).</li>
<li>Leloup, L., Daury, L., Mazéres, G., Cottin, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Involvement+of+the+ERK%2FMAP+kinase+signalling+pathway+in+milli-calpain+activation+and+myogenic+cell+migration%5BTitle%5D)+AND+%22The+International+Journal+of+Biochemistry+and+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Involvement of the ERK/MAP kinase signalling pathway in milli-calpain activation and myogenic cell migration.</a> The International Journal of Biochemistry and Cell Biology. 39, 1177-1189 (2007).</li>
</ol>

利害の衝突は宣言されません。

固定と生活32Dkit細胞におけるカルパイン活性はこのビデオのプロトコルで決定されている。カルパイン阻害剤PD150606を有する細胞系の治療は、細胞内のカルパイン活性の完全な阻害をもたらした。さらに、MEK1阻害剤PD98059による治療は、細胞内のカルパイン活性の完全な阻害をもたらした。 ERKは、カルパイン- 2 3の主要な活性剤です。これらの結果は、カルパイン- 2活性が32Dkit細胞で優勢であることを示唆している。我々の研究室の現在の仕事は、増加したカルパイン活性の結果と白血病におけるカルパイン- 1とカルパイン- 2の貢献を検討しています。 このプロトコルの詳細は固定と生きた細胞におけるカルパイン活性レベルを測定するために最初のフローサイトメトリーベースのアッセイとは、カルパイン規制と無傷の細胞を用いて病理学的プロセスにおけるその役割のメカニズムを理解するために使用することができます。 このプロトコルは、カルパインの活性に対する阻害剤や遺伝子操作の影響を検討するように変更することができます。...

<table><tbody><tr><td>PBS
BOC-LM-CMAC
4%パラホルムアルデヒド</td><td>Invitrogen</td><td></td><td>&lt;br/&gt;&lt;br/&gt;4gのパラホルムアルデヒドを100mLのPBSに溶解させる。ドラフトチャンバー内で、溶液が透明になるまで撹拌しながら加熱する。&lt;br/&gt;冷却後、4℃で保存する。&amp;#x00B0;C</td></tr><tr><td>PD150606</td><td>Invitrogen</td><td></td><td>カルパインの阻害効果を最大にするため、調製直後のPD150606を使用してください。</td></tr><tr><td>PD98059</td><td>Cell Signaling Technology</td><td></td><td></td></tr><tr><td>AlignFlow、AlignFlow プラス蛍光ビーズ FACSチューブ</td><td>Invitrogen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>LSR II</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td>&lt;br/&gt;これらの実験では、WEHI-3細胞の上清をIL-3の供給源として使用する。WEHI-3上清を回収するたびに、32Dkit細胞の増殖に用いる最適濃度を決定するためのタイトレーションを行う。 </td></tr></tbody></table>

フローサイトメトリーで固定し、生細胞におけるカルパイン活性の測定

Measuring Calpain Activity in Fixed and Living Cells by Flow Cytometry

カルパインは、ユビキタス細胞、カルシウム感受性、中立的なシステインプロテアーゼです。<sup&gt; 1</sup&gt;。カルパインは、シグナル伝達、細胞骨格のリモデリング、遺伝子発現の調節、アポトーシスや細胞周期の進行を含め、多くの生理学的プロセスにおいて重要な役割を果たす<sup&gt; 1</sup&gt;。カルパインは、筋ジストロフィー、癌、糖尿病、アルツハイマー病や多発性硬化症を含む多くの病理に関与している<sup&gt; 1</sup&gt;。カルパイン規制は複雑で、完全には理解です。 mRNAおよびタンパク質レベルでは、カルパイン活性を測定するための遺伝子またはタンパク質の発現技術の使用を制限し、活動にあまり相関しない。このビデオのプロトコルの詳細については、固定および生細胞中のカルパイン活性を測定するための我々の研究室では、フローサイトメトリーアッセイを開発した。このメソッドは、カルパインにより特異的に切断される蛍光基質BOC - LM - CMACは、、カルパイン活性を測定するために使用します。<sup&gt; 2</sup&gt;このビデオでは、固定および生体マウス32Dkitの白血病細胞、単独で、または脾細胞集団の一部としてのカルパイン活性はLSRII（BDバイオサイエンス）を用いて測定されます。 32Dkit細胞は、正常脾細胞と比較して上昇活性を有することが示されている。

この記事では、フローサイトメトリーを用いて固定し、生きた細胞内のカルパイン活性を測定するための詳細プロトコルを務める。

カルパインは、至る所に存在する細胞内カルシウム感受性の中性システインプロテアーゼである1。カルパインは多くの生理学的プロセスにおいて重要な役割を担っており、...

カルパインは、シグナル伝達、細胞骨格の再構築、遺伝子発現の調節、アポトーシス、細胞周期の進行など、多くの生理学的プロセスにおいて重要な役割を果たす、遍在的な細胞内カルシウム感受性中性システインプロテアーゼです。固定細胞および生細胞におけるカルパイン活性を測定するために、蛍光基質であるBUC-LMC-MACを添加します。BUC-LMC-MACはカルパインによって特異的に切断され、その結果、蛍光が増加します。この蛍光変化をフローサイトメトリーでモニタリングすることで、正常細胞と比較して30 2D kit細胞においてカルパイン活性が上昇していることが明らかになります。こんにちは。トロント大学免疫学部およびUniversity Health NetworkのStewart Berger博士の研究室のChristina Farrです。本日は、フローサイトメトリーを用いたアッセイにより、固定細胞および生細胞におけるカルパイン活性を測定する方法をご紹介します。私たちの研究室では、このアッセイを白血病およびリンパ腫細胞のカルパイン活性の解析に使用しています。それでは始めていきましょう。実験を開始する前に、検出試薬である1%パラホルムアルデヒド、calpain阻害剤PD 150606、およびMEK1阻害剤PD 98059を含む必要な試薬を準備します。これらの試薬の調製に関する詳細は、付属の書面プロトコルを参照してください。各ファルコンチューブに1%パラホルムアルデヒドを1 mL注入します。このビデオで示す固定細胞について、各実験条件につき3本のfaxチューブが必要です。3つの条件をテストするため、計9本のfaxチューブが必要となります。まず、最適培地で培養した、1 mLあたり0.5～1 × 10⁶個の32 dki細胞を用意します。胎児牛血清、IL-3、Tumor Necrosis Factor（TNF）、エタノールおよび抗生物質を添加します。4 × 10⁶ 個の細胞を3本の15 mLファルコンチューブにそれぞれ分注します。チューブを遠心分離機にかけ、15 °Cで225 Gsにて5分間遠心して細胞をペレット化します。遠心分離後、上清を吸引し、細胞を2 mLの室温PBSで再懸濁します。細胞懸濁液の一部に、50 µMのカルパイン阻害剤PD 150606を添加します。チューブをアルミホイルで覆い、サンプルを遮光してください。短時間ボルテックスした後、室温の暗所で20〜30分間インキュベートします。2番目の細胞懸濁液を20 µMのMEK阻害剤PD 98059で処理します。細胞を35 mm組織培養ディッシュに播種し、サンプルのインキュベーションの間、37 °Cで2時間インキュベートします。未処理のサンプルでCalpainアッセイを開始します。まず、細胞懸濁液に検出試薬を2 mL加えます。直ちに、細胞懸濁液と検出試薬の混合液を1 mL、あらかじめ準備しておいたfaxチューブに加え、T=0のサンプルを作成します。検出試薬を加えた細胞懸濁液を5分間インキュベートします。室温にて、細胞懸濁液検出試薬混合液1 mLを、あらかじめ1%パラホルムアルデヒド1 mLを入れた FACSチューブに加え、T=5のサンプルを作成します。残りの細胞懸濁液を検出混合液とともに、室温でさらに5分間インキュベートし続けます。5分後、細胞懸濁液のさらに1 mLを、1%パラホルムアルデヒド1 mLを入れた別のFACSチューブに移します。これはT = 10分の時点です。次に、阻害剤で処理した30個の2Dキット細胞でカルパインアッセイを繰り返します。ラックをアルミホイルで覆います。細胞を4°Cの暗所で一晩固定し、翌日に処理を行います。細胞を15°Cで725 Gs、5分間遠心分離してペレット化します。遠心後、上清を吸引し、細胞を750 µLのPBSに再懸濁します。細胞を氷上に置き、フローサイトメトリーを行うまで暗所に保存します。ここでは、固定細胞を用いたデータ収集について示します。LSR IIを用いてフローサイトメトリーを実施してください。光波励起またはUVレーザー励起ラインのフィルターを355 nanometersに、レーザー出力を25 milliwattsに設定し、基質および生成物の放出波長をそれぞれ405および450 nanometersに設定します。基質および生成物に使用するBAMパスフィルターは、405/20および450/50とする必要があります。基質および生成物用のロングパスフィルターは、405および450とする必要があります。PMT電圧を、基質については350〜375、産物については325〜350に設定します。以下のパラメータでBD FACSDivaの実験を設定してください。前方散乱光（Forward scatter）、側方散乱光（side scatter）、Indo 1 blue（ログスケールを使用）、および1つのバイオレット（violet）です。また、ワークシートで対数スケールを使用します。以下のグラフを作成してください。生細胞にゲートを設定した、前方散乱光（forward scatter）対側方散乱光（side scatter）のプロットです。Indo 1 blueのヒストグラム、Indo 1 violetのヒストグラム、およびIndo 1 blue対Indo 1 violetのドットプロットを用いて、LineFlowおよびLineFlow Plus蛍光ビーズでLSR IIのキャリブレーションを行います。実験のたびに、ビーズの蛍光ヒストグラムのピークが同一のチャンネルに配置されるようにPMT電圧を調整してください。0分時点での30 2D kit細胞を用いてデータ収集を開始します。必要に応じてパラメータ電圧を調整します。サンプルあたり10,000イベントを収集し、記録します。装置をfaxバッファーで洗浄し、各サンプルについて収集を繰り返します。データ収集後、データをエクスポートします。LSR IIが施設のガイドラインに従って洗浄されていることを確認してください。検出試薬およびカルパイン阻害剤を添加せずに、前述と同様に細胞懸濁液を調製します。サンプルをLSR IIにセットし、フィルターとパラメーターを以前と同様に設定します。ワークシートを以前と同様に設定します。Indo 1 blue対時間の大きなドットプロットを含めてください。最大数のイベント数を取得するようにプログラムを設定します。ストップゲートは設定しないでください。32 Gキット細胞の細胞懸濁液1つに、50 µMのカルパイン阻害剤を添加します。細胞をインキュベートしている間、サンプルを遮光し、室温で20〜30分間インキュベートします。cal pain阻害剤を含まない30 2Dキット細胞懸濁液のデータ取得を開始します。流速は200〜300 events/secondの低速に設定してください。30秒から1分後、チューブを装置から取り出します。細胞に20 micromolarのBach LMC macを添加します。これが検出試薬となります。これはカルパインによって特異的に切断され、その切断により基質の蛍光が増加します。軽くボルテックスした後、データの取得を継続します。10〜20分間、またはカルパイン活性がプラトーに達するまでデータを取得します。次に、カルパイン阻害剤で処理した32 gki細胞を用いて、同様にデータ取得を繰り返します。完了後、解析のためにデータをエクスポートしてください。マウス脾臓から調製した細胞懸濁液を用いて、混合細胞アッセイを開始します。各細胞懸濁液を2等分します。一方の細胞懸濁液に50 µMのcalpain阻害剤を添加し、アルミホイルで遮光して室温の暗所で20〜30分間インキュベートします。固定細胞を用いて既述のcalpainアッセイを実施した後、チューブをアルミホイルで覆い、4°Cの暗所で一晩インキュベートします。翌日、15°Cで725 Gsにて5分間遠心分離します。上清を吸引して取り除き、500 µLのPBSで細胞を洗浄し、再度上清を吸引します。その後、2%BSAを含む200 µLの染色バッファーで細胞を再懸濁し、室温で15分間インキュベートします。次に、一次抗体（ここではZI anti-US）を調製します。CD17を染色バッファーで希釈し、最終希釈倍率を1:200にして調製します。抗体は遮光して保存してください。細胞に一次抗体200 µLを加え、室温・遮光条件下で30分間インキュベートします。次に、フローサイトメトリー用に液量を増やすため、PBSを400 µL加えます。細胞を氷上に置き、遮光保存します。固定細胞で示したものと同じフローサイトメトリーの手順を用いてデータを取得します。フローサイトメーターでのデータ取得後、パラメータにZIを追加し、ワークシートにZIのヒストグラムを含めます。前方散乱光および側方散乱光のプロファイルに基づき、生存細胞をゲートしてFlowJoで解析します。生存細胞ゲートからIndo Blueの平均蛍光強度を算出します。このプロットにおいて、赤線は0分時点での平均基質蛍光を示し、青線と緑線は5分および10分時点での平均基質蛍光を示しています。混合細胞集団については、ヒストグラムとドットプロット上のFXI蛍光を用いて30 2D kip集団を特定してください。30 2D kip集団のendo blueの平均蛍光値を決定します。最後に、Microsoft Excelを使用して平均蛍光強度のグラフを作成します。5分から10分の間の直線の傾きを算出してください。その傾きを棒グラフとして描き、細胞内におけるcal pain活性を決定します。ここに示されたデータは、30個の2D細胞において高いカルパイン活性が認められること、およびカルパイン活性がMEK阻害剤によって抑制され得ることを示しています。固定細胞および生細胞におけるカルパイン活性の測定方法について説明しました。この手法を実施する際は、LSR IIを正しくセットアップし、蛍光ビーズを用いて装置のキャリブレーションを行うことが重要です。以上です。ご視聴ありがとうございました。皆様の実験の成功をお祈りしております。

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