Name: プラスミドDNAの組換えインフルエンザウイルスの生成 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-08-03T17:10:00.000+00:00
Duration: 11 min 31 s
Description: 学ぶプラスミドDNAから組換えインフルエンザウイルスを生成する方法。293TとMDCK細胞へのトランスフェクション、鶏胚培養による増幅、HAアッセイによるウイルス確認の技術を習得できます。

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著者らは、インフルエンザの逆遺伝学技術とプラスミドの開発のためのアドルフォガルシア、サストレとピーターPaleseの研究室で過去と現在のメンバーに感謝したいと思います。 AG - Sの研究室で研究の一部は手足の不自由な人、インフルエンザの研究と監視のための優秀NIAID資金によるセンター（HHSN266200700010C）によっておよび大学評価学位授与機構の助成金R01AI046954、U01AI070469とP01AI058113によって賄われています。 LM - Sのラボの研究は、部分的にNIAIDの助成金RO1AI077719によって運営されている。

1。インフルエンザウイルスの救助のトランスフェクションインフルエンザウイルスは、負の鎖RNAエンベロープウイルスのオルトミクソウイルス科のファミリーに属する。インフルエンザは、ウイルスゲノムは、少なくとも、11のウイルスタンパク質（図1）4をエンコードする負極性の8種類のRNAの遺伝子で構成されています。我々は（8インフルエンザA/PR/8/34ウイルスのセグメントを含むambisenseプラスミド（PDZ）を使用して最も一般的な実験室株、インフルエンザA/PR/8/34、5のうちの1つの救助に、このレポートでは、焦点を当てる図2）。 プラスミドDNAから組換えインフルエンザウイルスの救助のために、我々は、それぞれの組換えウイルスごとに3つの独立したトランスフェクションをお勧めします。複数の組換えウイルスの救助が試みられると、救出されるウイルスの数に一致して、次の手順を拡張する。以下のトランスフェクションと感染のプロトコルは、6ウェルプレートのために確立されます。プロトコルの概略図を図3に示します。 <ol><li> OPTIMEM -リポフェクタミン2000（LPF2000）混合：OPTIMEMのメディアとトランスフェクションあたりLPF2000の6-8μlを250μlを準備。室温（RT）で5〜10分間インキュベートする。一方、プラスミドトランスフェクション混合物を準備する。 </li><li>プラスミドのトランスフェクション混合物：OPTIMEMメディアの50μlのプラスミドトランスフェクションのカクテルを準備。我々は通常、救助あたりのプラスミドを各インフルエンザのDNAの1μgを使用してください。 OPTIMEMメディア50μlを含むチューブに1 PDZプラスミドの溶液（1μg/μLの時）PB2、PB1、PA、HA、NP、NA、M、およびNSを追加。 </li><li> OPTIMEM - LPF2000 - DNAプラスミド混合物：インフルエンザのDNAプラスミドのトランスフェクション混合液（ステップ1.2）に、ステップ1.1から250μlを追加する。室温で20-30分のためにこの混合物をインキュベートする。一方、トランスフェクションのための293TとMDCK細胞の懸濁液を準備する。 </li><li> 293T/MDCK共培養の準備：開始する前に、37にPBS 1X、DMEM 10％FBS 1パーセントPSメディア、およびEDTA -トリプシンの混合物をもたらす℃に細胞の密度は80〜90％コンフルエントでトランスフェクションの日でなければなりません。通常は、293TとMDCK細胞の一つコンフルエント100 mmディッシュの一つコンフルエントな100 mmディッシュは、救助10月12日に使用することができます。私たちは、ウェルあたりの細胞の250μlを使用するつもりです。両方の細胞株をDMEM 10％FBS 1パーセントPSの3mlの合計に再懸濁される。 <ul><li>慎重に15 mlの遠心チューブでDMEM 10％FBS 1パーセントPSの10mlにそれぞれの細胞株を懸濁します。あなたは、293T細胞およびMDCK細胞用のチューブ用の管を持つこ​​とになります。 </li><li> DMEM 10％FBS 1パーセントPS 3mlに293T細胞を再懸濁し、再懸とき、それらの細胞を再懸濁するために、MDCK細胞に3 mlを実現。これは、あなたの共培養に使用される293TとMDCK細胞の混合物を与える。 </li><li>ウェルあたり293T/MDCK細胞（10-12 6ウェルウェル）250μlを添加する。 </li></ul></li><li> RTのインキュベーション（ステップ1.3）20〜30分後、OPTIMEM - LPF2000 -インフルエンザのDNAプラスミド混合液にDMEM 10％FBS 1パーセントPSの1 mlを加える。 </li><li> 293T/MDCK細胞を250μl（ステップ1.4）でウェルに1.3ミリリットル（ステップ1.5）を追加します。 </li><li>穏やかに6ウェルプレートを振とうし、℃、5％CO 2で37インキュベーターで一晩トランスフェクションインキュベートする（ON）ができます。 </li><li>翌日、約16-24時間後にトランスフェクションは、トランスフェクションのメディアを変更し、48時間TPCK -トリプシンのの1μg/ mlを含むPS DMEM 0.3％BAに1％をトランスフェクションされた細胞をインキュベートする。 </li><li>メディアを変えるの48時間後に、マイクロ遠心チューブにトランスフェクションした細胞の上清を移す。 </li><li> 1〜2分、13,000 rpmの遠心で組織培養上清を遠心してください。 </li><li> 6ウェルプレート（前日に播種）またはステップ1.10〜遠心組織培養上清の200μlの10日齢の鶏孵化卵に新鮮なMDCK細胞に感染。 2〜3日で37細胞および/または卵° Cをインキュベートする。 <ol><li> 10日齢の鶏孵化卵の感染：鶏孵化卵に感染するすべての手順は、無菌条件下で行われる。 <ol><li>気嚢と尿膜腔の間のインタフェースを確認するためにライトキャンドルボックスを使用して、10日齢の卵キャンドル。インタフェースの境界上で鉛筆のマークを付けます。 </li><li> 5 mlの注射針で卵殻に穴を開ける。 </li><li> 1mlのシリンジで、ステップ1.10〜組織培養上清の200μlで各卵に感染する。 </li><li>綿棒を使用して、溶けたワックスと卵殻に穴をカバーする。 </li><li> 2〜3日間37οCで感染した卵をインキュベートする。 </li></ol></li><li>新鮮なMDCK細胞の感染：通過前日293T/MDCK共培養から組織培養上清、事前に皮をむくMDCK細胞を6ウェルプレートの料理翌日80-90％コンフルエントに到達する。通常、コンフルエントな100 mm組織培養プレートは6〜8ウェルに分割することができます。細胞を洗浄、二回、PBS 1Xで、トリプシン処理し、6ウェルプレートを準備。静かに細胞の均一な分布を持つために手でプレートを振る。文化のセル、ON、37℃インキュベーター、5％CO 2。感染する前に、単分子層を確認するために顕微鏡下で細胞をオンにし、感染を続行して下さい： <ul><li> PBS 1X 1mlで、二回、細胞を洗浄。 </li><li>室温で1時間遠心分離した組織培養上清の200μlで感染する。細胞は乾燥させないでください。 6ウェルプレート10分ごとに揺らし。 </li><li>ウイルス性吸収の1時間後、MDCK細胞から感染の媒体を削除し、TPCK -トリプシンのの1μg/ mlを含むPS DMEM 0.3％BA 1％2 mlを加える。 </li><li>通過後48〜72時間で、トランスフェクション効率とウイルスの負荷に応じて、細胞変性効果（CPE）はMDCK感染細胞で観察される。 CPEは、成功した救助を示唆している。しかし、HAアッセイ（セクション2）が依然として組織培養上清中のウイルスの存在を確認するために実行する必要があります。 </li></ul></li></ol></li><li>感染した鶏の孵化卵から収穫尿膜液：感染した卵から尿膜液を採取するすべての手順は、無菌条件下で行われる。尿膜腔液の約8〜12ミリリットルは、それぞれの10日齢に感染した卵から収穫することができる。尿膜液を採取する前に、℃でニワトリ胚を殺すと血液を凝固するために4で2時間（またはON）のために鶏の卵をインキュベートする。 <ul><li>無菌状態を確立するために70％エタノールで卵の殻を洗ってください。 </li><li>スプーンで軽くたたくことによって空気の空洞を介して、慎重に、卵を開きます。鉗子の助けを借りて、壊れた卵の殻を外します。 </li><li> 1mlの針で、卵の黄身を壊すことなく、尿膜を取り除く。 </li><li>あなたが尿膜液に10 mlのピ​​ペットをガイドとしてスパチュラでニワトリ胚を安定させます。壊したり、卵の卵黄のいずれかを収集せずに、氷のバケツに氷の上に15 mlの遠心管に、できるだけ多くの尿膜液として収集する。それぞれの卵のための15 ml遠心チューブを使用してください。 </li><li> 4℃で5分間遠心し℃、新鮮な15 ml遠心管に尿膜腔液を（ペレット化赤血球を服用せずに）転送する。 </li><li>それらは赤血球凝集（HA）アッセイによる救出、ウイルスの有無をチェックされるまで、4℃で遠心分離した尿膜液を含むチューブ℃で保管してください。 </li></ul></li></ol> 2。組換えインフルエンザウイルスの救助を確認するために、HAアッセイ赤血球凝集アッセイ（HA）は、日常的にMDCK細胞培養上清及び/または収穫卵の尿膜腔液の救出、ウイルスの存在を検出するために使用されます。また、免疫蛍光アッセイ（IFA）も行うことができます。アッセイは、救出のウイルスの存在を識別する一度、ウイルスをプラーク精製されるべきであり、ウイルスの遺伝的組成は、RT - PCRおよび配列決定によって確認されます。 MDCK細胞の培養上清及び/または感染した卵から尿膜液中のウイルスの存在は、肉眼的に鶏のHA（または別のソース）赤血球（RBC）を用いて決定することができる。ウイルスの不在は、ウェルの底に赤ペレット（図4）の形成を可能にしながら、ウイルスの存在は、RBCの赤血球凝集を誘導する。インフルエンザウイルスの場合には、それは約10 3 -10 4プラーク形成単位（PFU）は、HAのアッセイで陽性信号を与えるために必要とされると考えられているので、IFAは、確認のため、HAアッセイと並行して行うことができます。真の陰性結果。未満103から104のウイルスはこの手法で検出できるので、一次抗インフルエンザ抗体を用いたIFAは、HAアッセイよりも感度が高いです。それはIFAで陽性のHA陰性である上清あるいは尿液より可能です。この場合、ウイルスはMDCK細胞で、卵で、再び、継代によって増幅されるべきである。第2流路から尿膜液および/または組織培養上清は、現在、HAアッセイで明らかな陽性でなければなりません。 HAアッセイは、V底96ウェルプレートで実施されています。負（例えば、PBS 1X）と正（組織培養上清及び/またはインフルエンザウイルスの感染から尿膜腔液）コントロールのサンプルは、常にそれを検証するために、任意のHAアッセイに含まれるべきです。 <ul><li> V底96ウェルプレートの各ウェルにPBS 1Xの50μlを分注する。 </li><li> 50μlを加え感染した最初のウェルに卵と、からMDCK細胞の培養上清および/または尿膜液は、以下の井戸を2倍希釈系列を作る。最後のウェルからの余分な50μlを捨てる。 </li><li>各ウェルに0.5％-1.0％ニワトリ赤血球（PBS 1Xで調製）を50μlを追加。 </li><li>氷上で30-45分（赤い点は、陰性コントロールのPBS試料の底部に見えるようになるまで）のためのV底96ウェルプレートをインキュベートします。図4に示される結果を読んで、interpretate。 </li></ul> 3。組織培養上清のパッセージ HAアッセイで陰性の結果は、組織培養上清および/または尿膜液中のウイルスという存在の低水準と低いトランスフェクション効率の結果である可能性があります。新鮮なMDCKおよび/または孵化卵におけるこれらのサンプルの通過は、感染症は、以前は次のセクション1.11.2で説明したように実行されます（図3に示される）ウイルスの増幅が可能になります。 4。代表的な結果成功したインフルエンザウイルスの救助は、正のHAアッセイ（図4）の存在によって確認される。さらに、組織培養上清、または卵から尿膜液と感染細胞におけるCPEの存在は肯定的なウイルスの救助を提案します。 <img src="/files/ftp_upload/2057/2057fig1.jpg" alt="図1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図1"> 図1。インフルエンザウイルスの構造：インフルエンザウイルスは、2つのウイルス糖タンパク質（HA、NA）と、また、イオンチャネル蛋白質、M2を含む脂質二重層に囲まれています。 HAは、シアル酸含有受容体に結合することの責任のウイルス付着タンパク質、です。 NAは、宿主細胞からのウイルスのリリースを担当しています。脂質二重層の下、ビリオンアセンブリと出芽およびウイルスribonucleocapsidsの核外輸送に必要な核輸出タンパク質（NEP）、の役割を果たしている内面のエンベロープのマトリックスタンパク質1、M1、から構成される蛋白質の層です。ウイルスのコアは、ウイルスの核タンパク質、NPでcapsidに包まれた8つのシングル鎖陰性RNAウイルスの遺伝子で構成される、リボ核タンパク質（RNP）複合体で作られています。 RNP複合体に関連付けられているウイルスRNA依存性RNAポリメラーゼサブユニットPA、PB1、PB2となります。非構造タンパク質NS1およびRNAのセグメントNSとPB1にコードされるPB1 - F2は、それぞれ、ビリオンの構造の一部ではありません。 <img src="/files/ftp_upload/2057/2057fig2.jpg" alt="図2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図2"> 図2。インフルエンザウイルスのレスキュープラスミド：8インフルエンザウイルスの遺伝子ambisenseプラスミドPDZにクローニングされたが示されている。 pCAGGs 7プラスミドタンパク質の発現から得られるプラスミドPDZ 6は 、ヒトのRNAポリメラーゼIはプロモーターと負のセンスのゲノムRNAをコードするマウスターミネーター配列との双方向のプラスミドベクターであり、逆方向に私が団結ポリメラーゼに、ポリメラーゼII転写カセット（ニワトリβ-アクチンプロモーターとポリA）は、同じウイルスの遺伝子からウイルスタンパク質をコードしている。各ウイルスのセグメントからのcDNAは、SAPIの制限エンドヌクレアーゼ部位と各セグメントの非翻訳領域を含むフォワードプライマーとリバースプライマーを用いたRT - PCR（ウイルス遺伝子の端にある黒色のボックス）によって生成されます。 PCR産物は、SAP - Iで消化PDZにクローニングされています。 <img src="/files/ftp_upload/2057/2057fig3.jpg" alt="図3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図3"> 図3。八プラスミドベースのインフルエンザのレ ​​スキューシステム：8インフルエンザウイルスの遺伝子を含むPDZプラスミドを293T - MDCK細胞共培養（1日目）で、懸濁液に、同時トランスフェクトされています。二十四時間トランスフェクション後、FBSのないメディアがTPCK /トリプシンを含むが（2日目）に置き換えられます。四十八時間のメディアを変更した後、組織培養上清を回収し、MDCKまたは10日齢発育鶏卵を（4日目）に感染するために使用されます。 48〜72時間後の増幅、卵からMDCK感染細胞や尿膜腔液から組織培養上清は、HA（6日）で採取し、ウイルスの存在についてアッセイする。ウイルスが検出されない場合は、同じ上清および/または尿液は、新鮮なMDCK細胞および/または孵化卵に再継代することができます。 <img src="/files/ftp_upload/2057/2057fig4.jpg" alt="図4" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図4"> 図4。赤血球凝集素分析（HA）：ウイルス粒子によるRBCの凝集は、肉眼で見えるであり、組織培養上清または/および尿液にウイルス粒子を検出するための基礎です。 HAアッセイは、ウイルス感染性粒子と劣化したと細胞に感染することはもはやできる粒子を区別しませんが、アッセイは、サンプル中のウイルスの存在の良い指標です。 A）生物学的サンプル中のウイルスの存在の不在（上）（下）は、プレートの底部におけるRBCの存在や彼らの不在、RESPによって決定されます。ectively。 B）HAのウイルスの検出可能なレベルの分析（上）またはウイルスの存在（下）から代表的な結果が示されています。

<ol><li>Neumann, G., Watanabe, T., Ito, H., Watanabe, S., Goto, H., Gao, P., Hughes, M., Perez, D. R., Donis, R., Hoffmann, E., Hobom, G., Kawaoka, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+influenza+A+viruses+entirely+from+cloned+cDNAs%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Generation of influenza A viruses entirely from cloned cDNAs.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 96, 9345-9350 (1999).</li>
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<li>Niwa, H., Yamamura, K., Miyazaki, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+selection+for+high-expression+transfectants+with+a+novel+eukaryotic+vector%5BTitle%5D)+AND+%22Gene%22%5BJournal%5D)">Efficient selection for high-expression transfectants with a novel eukaryotic vector.</a> Gene. 108, 193-199 (1991).</li>
</ol>

マウントサイナイ医科大学では、組換えインフルエンザウイルスの分野で知的所有権を有し、およびAG - Sは、この知的財産の発明者です。

プラスミドDNAから組換えインフルエンザウイルスの救助は、プロトコルが日常的に実験室で実施されると、シンプルかつ簡単なプロセスですが、初めに、複数の物事が間違って行くことができます。それは、ウイルスを生成するために適切なプラスミド調製を持つことが不可欠です。細胞株（293TとMDCK）の適切な維持管理が成功したウイルスの救助のための非常に重要です。伝統的に、遺伝タグはサイレント突然変異誘発によって、インフルエンザ遺伝子エンコーディングプラスミドに挿入されます。このサイレント変異（複数可）との創造の導入は、例えば、新たな制限酵素部位は、酵素消化により、野生型および組換えインフルエンザウイルスを区別するために使用されます。したがって、組換えウイルスをプラーク精製の増幅の後、RT - PCRおよびシークエンシングのアプローチは、救出、ウイルスの性質を検証するために実行する必要があります。これらの逆遺伝学技術とプラスミドから遺伝子組換えインフルエンザウイルスの成功救助の開発では、ウイルスの生物学に関する特定の質問に答えることができるようになります。

細胞株 293T（カタログ番号CRL - 11268）およびMDCK（カタログ番号CCL - 34）の細胞株をDMEM 10％FBS、1％PSで、5％CO 2で37℃のインキュベーター中で維持されます。細胞は、アメリカンタイプカルチャーコレクション（ATCC、10801ユニバーシティブールバード、マナッサス、バージニア州。20110〜2209、アメリカ）利用可能なフォームです。 孵化鶏卵孵化10日齢の鶏の卵は、チャールズリバー研究所、特定の病原体手数料鳥サプライ（SPAFAS）鳥製品とサービスから得ることができる。フランクリンコモンズ、106ルート32、ノースフランクリン、CT 06254、米国。卵は、° C前後のウイルス感染後に37℃でインキュベートする。ウイルス感染前と後、卵は、胚の生存性を決定するためにcandledされています。それは、ウイルス感染前と後に死んだ卵を探すことが非常に重要です。感染する前に死んだ卵は、簡単に血管の欠如だけでなく、胚の移動性の欠如を見破ることができます。 candledときは、ライブ胚が移動する。ウイルス感染後に死んだ卵は、（おそらくインフルエンザウイルスの感染に関係する）簡単に尿膜腔液の小さい方と流血の量によって見られるように卵の外観不良が発見されます。感染の卵は、二重オートクレーブバッグに破棄され、標準的な手順は、次のオートクレーブ処理されています。 ニワトリ赤血球（RBC） ニワトリ赤血球はTruslowファーム、201バレーロード、チェスター、MD 21620から購入することができます。 4℃で保存します。 HAアッセイのために、50 ml遠心チューブにPBS 1X 45mlのチキンRBC 5 mlを洗う。 1000年のrpm、室温で5分間、遠心します。注意深く上清を捨て、PBS 1Xでペレット化RBC（0.5-1.0％RBCの最終濃度）の1:1000希釈を使用してください。 組織培養上清や尿液 、組織培養上清や尿液の両方を4℃で短期間保存することができる。ウイルスの救助を確認した後、細胞上清や尿膜液からのウイルスは、-80℃で保存されていますプラスミドすべてのプラスミドは、メーカーの推奨に従ってプラスミドマキシキットを用いて調製されています。すべてのプラスミドは、のddH 2 Oで1μg/ mlの濃度で分注しており、-20℃で保存短期記憶のために、プラスミドは4で維持することができます℃を精製プラスミドDNAの濃度は純度が260:280 nmの比を用いて推定されていると、260 nmでの分光光度法により決定されます。 1.8から2.0 260:280 nmの比率を持つ準備がウイルスの救助の目的のために充当とみなされます。さらに、プラスミド濃度および純度は、アガロースゲルクロマトグラフィーで確認してください。 Ambisense PDZプラスミド（6）8つのインフルエンザA/PR/8/34ウイルス遺伝子（7）を含む、図2に示します。 ウイルスインフルエンザA/PR/8/34を救出するために記述されているプロトコルは、バイオセーフティーレベル（BSL）2の条件下で行うことができます。組織培養上清および孵化卵を含む汚染物質は、廃棄前に滅菌する必要があります。他のインフルエンザウイルスの救助は、より高いBSL条件を必要とし、従って、特別な条件/セキュリティ測定が続いする必要があります。 組織培養培地およびソリューション DMEM 10％FBS 1パーセントPS：445ミリリットルダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）、ウシ胎児血清（FBS）を50ml、および100Xペニシリン/ストレプトマイシン（PS）5mlの。 4℃で保存します。このメディアは、トランスフェクションのためだけでなく、293TとMDCK細胞を維持するために使用されます。 DMEM 0.3％BA 1パーセントPS：DMEMの495.7ミリリットル、35％ウシアルブミン（BA）の4.3ミリリットル。 4℃で保存します。使用直前に、1μg/ mlの終濃度にTPCK処理されたトリプシンを追加する。感染媒体。 塩化ナトリウム80gの、塩化カリウム2gを、のNa 2 HPO 4 · 7H 2 O、KH 2 2gのPO 4の11.5グラム：10Xリン酸緩衝食塩水（PBS）。最大1リットルのddH 2 Oを追加。 7.3にpHを調整する。オートクレーブで滅菌。室温で保管してください。 1X PBS：のddH 2 Oで希釈し、10 × PBS午前1時10分室温でオートクレーブや店舗によって滅菌する。

プラスミドdnaの組換えインフルエンザウイルスの生成

Generation of Recombinant Influenza Virus from Plasmid DNA

インフルエンザ研究グループの数による努力はインフルエンザウイルスの逆遺伝学の発展と向上に極めて重要なされている。もともと1999年に設立さ<sup&gt; 1,2</sup具体的な質問は、遺伝子組み換え、感染症、組換えインフルエンザウイルスによって応答されているため、組換えウイルスを生成するために&gt;プラスミドベースの逆遺伝学的手法では、インフルエンザの研究分野に革命をもたらしています。このような研究は、ウイルス複製、ウイルスタンパク質の機能、ウイルスの複製および/または病原性のウイルスタンパク質に特異的変異の寄与と、また、外来タンパク質を発現する組換えインフルエンザウイルスを用いてウイルスベクターが含まれています<sup&gt; 3</sup&gt;。

プラスミドDNAからのインフルエンザウイルスの救助は、インフルエンザの研究者がインフルエンザウイルスの生物学のさまざまな側面を研究するために組換えウイルスを生成するために、そして潜在的なベクトルまたはワクチンとして使用することを可能にする基本的かつ本質的な実験的な手法です。

プラスミドDNAの組換えインフルエンザウイルスの生成

多くのインフルエンザ研究グループによる取り組みが、A型インフルエンザウイルスのリバースジェネティクスの開発と改良において極めて重要な役割を果たしてきました。元来……

本実験の全体的な目的は、プラスミドDNAから組換えインフルエンザウイルスを作製することです。これは、Lipofectamine 2000を用いて、インフルエンザ遺伝子をコードする8つのDNAプラスミドを293T細胞とMDCK細胞の共培養系に導入することで達成されます。得られた組織培養上清を用いて、新鮮なMDCK細胞または10日齢の鶏胚に感染させ、導入細胞由来の上清に含まれるウイルスを増幅させます。次に、感染させた鶏胚接種卵から組織培養上清および液体allantoic fluidを回収します。HAアッセイを用いてウイルスの存在を確認し、凝集の有無に基づいてウイルスの存在を示す結果を得ます。こんにちは、ロチェスター大学微生物学・免疫学部のLuis Martinez Ritoです。本日は、プラスミドDNAから組換えインフルエンザウイルスをレスキューする方法をご紹介します。当研究室では、インフルエンザウイルスの生物学における多角的な研究や、潜在的なベクターおよびワクチンの開発にこの手法を用いています。それでは、始めていきましょう。トランスフェクションを開始する前に、1倍リン酸緩衝生理食塩水（PBSEDTA）、トリプシン、および10%胎児牛血清（FBS）と1%ペニシリン・ストレプトマイシン（PS）を添加したKO modified Eagle's medium（DMEM）などの細胞培養試薬を37 °Cに加温します。次に、トランスフェクション1回につき250 µLのOpti-MEM培地と6〜8 µLのLipofectamine 2000を準備し、室温で5〜10分間インキュベートします。50 µLのOpti-MEM培地を入れたチューブに1 µgのプラスミドDNAを加え、プラスミドトランスフェクション混合液を調製します。さらに、ウイルスセグメントを含む8種類のPDZプラスミドを各1 µgずつ添加します。PB two PB one pa ha np na m and N MS.室温のOpti-MEMにPF-2000を250 µL加え、インフルエンザDNAプラスミドのトランスフェクション混合液に加えて室温で20〜30分間インキュベートします。その間に、トランスフェクション用の293T細胞およびMDCK細胞の懸濁液を調製します。293T細胞およびMDCK細胞の密度は、コンフルエンスが80〜90%である必要があります。トランスフェクション当日、100 mmディッシュあたり約5×10⁶個の細胞を、標準的な細胞培養手法を用いて洗浄して剥離させ、遠心分離します。293T細胞を3 mLのDMEM-FBS-PSで再懸濁します。再懸濁後、この3 mLの懸濁液をMDCK細胞に加えて再懸濁させます。これにより、共培養に使用する2 9 3 T細胞とMDCK細胞の混合物が作成されます。6ウェルプレートの

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Immunology and Infection

免疫学と感染症

Source: Philip, A. A., et al. Simplified Reverse Genetics Method to Recover Recombinant Rotaviruses Expressing Reporter Proteins. J. Vis. Exp. (2020)This video demonstrates the recovery of recombinant rotavirus by transfecting plasmids encoding viral genome segments into hamster kidney cells, followed by amplification in monkey epithelial cells, enabling studies of rotavirus biology, replication, and vaccine development.

Plasmid-Mediated Generation of Recombinant Rotavirus in Cultured Cells

このビデオは、哺乳類のシステムでインフルエンザウイルス様粒子(VLP)を生成する方法を示しています。3つの真核生物の発現ベクター(異なるウイルス構造タンパク質をコードする)を適切な哺乳類宿主細胞に発現させると、発現したウイルスタンパク質は宿主の原形質膜上でVLPに自己組織化し、細胞表面から出芽して放出されます。...

哺乳類系を介したインフルエンザウイルス様粒子の生成技術

このビデオでは、寒冷適応型組換えインフルエンザウイルスを作成する方法を紹介しています。これには、ヒト細胞に双方向プラスミドをトランスフェクションした後、低温でインキュベーションして、暖かい条件下での複製が減少するという特徴を持つワクチン製造に適したウイルスを生成するというものです。...

ワクチン用の組換え弱毒生インフルエンザウイルスの作製

ここでは、昆虫細胞中での新規な中国のH7N9ウイルス由来の正しく折り畳まれ、機能性インフルエンザウイルス表面抗原を発現する方法を記載している。技術は、任意のウイルスまたは細胞表面タンパク質の外部ドメインを発現するように適合させることができる。...

バキュロウイルス発現系を用いた新規H7N9インフルエンザウイルス由来の機能組換えヘマグルチニンとノイラミニダーゼタンパク質の発現

一過性の支配的選択の方法を使用して蛍光タグ付きタンパク質を同時に発現する組換えワクシニアウイルスの生成のための迅速かつモジュール的なプロトコルがここに記載されている。...

蛍光タグ付きワクシニアウイルスタンパク質の効率的な生成のための方法論

ワクチンがどのように機能するかについての知識は全体的に不足しています。ここでは、逆遺伝学と骨髄キメラマウスの併用を提案するとともに、樹状細胞とT細胞免疫に特に焦点を当てて、ワクチンに対する初期の宿主免疫応答についての洞察を得ることを提案します。...

キメラマウスモデルにおける組換えインフルエンザワクチンの鼻腔内投与は、粘膜免疫を研究するために、

ここでは、バキュロウイルスまたは哺乳動物発現系、および超遠心分離精製のいずれかを使用してウイルス様粒子を合成するためのプロトコルを提示します。この高度にカスタマイズ可能なアプローチは、安全かつ柔軟な方法で、ワクチン標的としてウイルス抗原を同定するために使用されます。...

ワクチン接種のための発現およびウイルス様粒子の精製

エスケープ中和抗体でインフルエンザ ウイルスの亜種の世代

このプロトコルは、2つのインフルエンザA株からエンベロープ糖タンパク質を有する高力性ウイルス性偽型粒子(pp)を生成する実験プロセスと、その感染性を決定する方法を記述する。このプロトコルは、異なるエンベロープ糖タンパク質を持つエンベロープウイルスの他のタイプのppsを開発するために非常に適応性があります。...

高病原性H5N1および鳥類H7N9ウイルス由来のエンベロープ糖タンパク質を用いた高力性インフルエンザ擬似型粒子の生産

プラスミドDNAからの組換えロタウイルスの生成は、ロタウイルス複製および病因の研究、およびロタウイルス発現ベクターおよびワクチンの開発に不可欠なツールを提供する。本明細書において、蛍光レポータータンパク質を発現する株を含む組換えロタウイルスを生成するための簡略な逆遺伝学アプローチについて述べる。...

レポータータンパク質を発現する組換えロタウイルスを回収する簡略逆遺伝学法

これは、組み換えウイルスの宿主範囲選択および視覚的同定を用いて「瘢痕のない」組換えワクシニアウイルスを生成する方法である。...

ホスト範囲と視覚選択を用いた組換えポックスウイルスの迅速かつシームレスな生成

学ぶプラスミドDNAから組換えインフルエンザウイルスを生成する方法。293TとMDCK細胞へのトランスフェクション、鶏胚培養による増幅、HAアッセイによるウイルス確認の技術を習得できます。

プラスミドDNAの組換えインフルエンザウイルスの生成

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