Name: Lisolement des cellules souches rétiniennes de lOeil de la souris (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-09-11T17:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 22 s
Description: Découvrez l'isolement des cellules souches rétiniennes de l'épithélium ciliaire de l'œil de souris. Cette méthode permet de former des sphères clonales et d'étudier leurs propriétés d'auto-renouvellement pour la recherche en médecine régénérative.

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Nous remercions Laura Clarke pour son aide inestimable. Ce travail est soutenu par des RCE: Réseau de cellules souches, les IRSC et les NIH.

1. Préparer les solutions de dissection et de solutions enzymatiques <ol><li> Faites le liquide céphalo-rachidien artificiel (ACSF) et les médias sans sérum à l'avance et réfrigérer. </li><li> Peser l'acide kynurénique (0,2 mg / ml) et dissoudre dans 10 ml de hilo ACSF au bain-marie à 37 ° C à l'avance car il ne se dissolvent pas facilement. </li><li> Peser la trypsine (1,33 mg / mL) et de hyaluronidase (0,67 mg / mL) et le lieu dans un tube de 15 ml et le conserver à -20 ° C jusqu'à ce que nécessaire. Ajouter la solution d'acide Kynurenic à ce tube et le filtre à l'aide d'un filtre 22 um seringue juste avant l'utilisation. </li><li> Peser inhibiteur de la trypsine (Ovamucoid: 1 mg / mL) et dissoudre dans chaude milieu sans sérum et le filtre en utilisant un filtre seringue 22μm. </li><li> Faire les médias placage: un milieu sans sérum contenant FGF2 (10 ng / ml) et l'héparine (2 pg / ml). </li></ol> 2. Isoler des cellules souches rétiniennes de l'Oeil de la souris <ol><li> L'isolement des cellules souches rétiniennes est effectuée dans un local spécifique dédié aux expériences stériles culture primaire. Avant de commencer cette procédure, mis en place le microscope à dissection froide et source de lumière, puis disposer les instruments stériles dissection. Chaque hotte est un stérilisateur à chaud de perles pour stériliser les instruments entre les étapes. </li><li> Nous allons isoler les cellules souches rétiniennes dans les yeux qui ont été immédiatement placés dans une boîte de Pétri stérile contenant artificielle liquide céphalo-rachidien (ACSF) après leur retrait de souris sacrifiées en fonction de protocoles approuvés éthique animale. </li><li> Sous la loupe binoculaire, nettoyer l'œil avec une pince: se débarrasser de la chevelure et le tissu conjonctif qui est attaché à la cornée / frontière scléral. Puis transfert à l'œil d'un nouveau plat avec l'ACSF. </li><li> Tout en douceur en maintenant l'œil fixe avec des pinces dentelées, l'utilisation de micro-dissection angle de ciseaux pour retirer les muscles oculaires. Retirez le nerf optique ainsi si elle est toujours attachée à l'œil. Essayez de ne pas écraser l'œil au cours de ce processus. Transfert yeux pour un nouveau plat avec l'ACSF. </li><li> Suivant l'utilisation de micro-dissection courbes des ciseaux pour couper l'œil dans la moitié: commencer au nerf optique et couper par le milieu de la cornée, réunion de retour au nerf optique où la coupe a été lancé. Il est idéal si les deux morceaux de l'œil sont à peu près équivalente en taille car cela rendra plus facile la prochaine étape. </li><li> Tenir les cornées l'aide de deux pinces, retirez délicatement l'œil les deux moitiés de l'autre. Retirez et jetez les lentilles, les viscères, et la rétine neurale à partir de coquilles oeil. Transférer les coquilles dans un plat avec les nouveaux ACSF. </li><li> Maintenant nous sommes prêts à isoler l'épithélium ciliaire. Pour commencer, orienter la coquille des yeux afin que la cornée est sur votre droite et l'épithélium pigmentaire rétinien (EPR) est sur la gauche. Délicatement la coquille broches oeil vers le bas avec une pince sur le côté droit du RPP. </li><li> Ensuite, utiliser un scalpel pour couper la cornée et l'iris loin de l'épithélium ciliaire de l'œil en appuyant doucement sur le bistouri plutôt que d'utiliser mouvements de sciage. </li><li> Après cela, couper l'épithélium ciliaire loin de l'EPR. Utilisez une pince non dentelé de transférer la bande de l'épithélium ciliaire à une nouvelle de 35 mm plat contenant ACSF. </li><li> De la même façon, isoler l'épithélium ciliaire de la coquille autre œil. </li><li> Une fois les deux bandes ciliaires épithéliales ont été recueillies, le transfert des bandes dans un plat de 35 mm contenant 2 ml de dispase. Placer le plat avec les bandes dans un incubateur à 37 ° C pendant 10 minutes. </li><li> Après 10 minutes, transférer les bandes de la dispase dans un plat contenant 2 ml de trypsine filtré, hyaluronidase, et l'acide kynurénique. Placer le plat à 37 ° C pendant 10 minutes. </li><li> Revenez maintenant à la loupe binoculaire. Tout en tenant le bas de la sclère avec une pince droite, utiliser le bas de la incurvé non dentelé des forceps pour gratter délicatement l'épithélium ciliaire loin de la sclérotique. </li><li> Retirer la sclérotique de l'antenne. Tout ce qui doit être laissé dans le plat sont maintenant les cellules d'intérêt et de la solution enzymatique. </li><li> Utiliser un feu poli coton branchée pipette, transférer cette solution dans un tube de 14 ml. Triturer cette solution 30 fois pour briser les cellules épithéliales en douceur forçant la solution dans et hors de la pipette. </li><li> Centrifuger le tube pendant 5 minutes à 1500 RPM. Lorsque la centrifugation est terminée, retirer le tube de la centrifugeuse avec soin, car les cellules sont enclins à se détacher du fond du tube à ce stade. </li><li> Doucement aspirer la majorité des surnageant avec une pipette polie au feu, puis ajoutez 1 ml d'inhibiteur de la trypsine dans un milieu sans sérum pour les cellules. Utilisez un petit coton branchée forage pipette de triturer l'échantillon d'environ 50 fois jusqu'à ce qu'elle soit une suspension à cellule unique. </li><li> Centrifuger le tube à nouveau pendant 5 minutes à 1500 RPM. </li><li> Enlever le surnageant et le remplacer par 1 mL de votre milieu d'étalement. Triturer doucement à l'aide d'une pipette en verre poli au feu pour remettre les CELLS. </li><li> Après comptage des cellules, plaque eux à la densité désirée dans une plaque de 24 puits. En général, nous plaque 10 cellules / uL en remplissant chaque puits d'abord avec support et en ajoutant ensuite la suspension de cellules pour obtenir un volume final de 500 pl de médias. </li><li> Placer la plaque dans un 37 ° C CO 2 incubateur où il ne sera pas déplacé jusqu'à ce que vous comptez les sphères qui surviennent après 7 jours. </li></ol> 3. Résultats pour isoler des cellules souches rétiniennes <ol><li> Lorsque cette procédure est effectuée avec succès, le disséqué ciliaire des cellules épithéliales devrait ressembler à ceci après avoir été dissocié et étalées à faible densité (figure 1). </li><li> Après 7 jours de culture, les sphères de cellules souches rétiniennes qui se posent sont comptés. Une sphère doit être plus de 75 um de diamètre et flottant à être compté comme une cellule souche dérivée sphère. (Figure 2). Toutefois, certaines cellules ont limité la prolifération et la forme de sphéroïdes qui ne satisfait pas au critère de taille et ne seront pas comptés comme des sphères de cellules souches dérivées; un exemple d'un tel sphéroïde est montré ici (figure 2). </li></ol> 4. Les résultats représentatifs <img src="/files/ftp_upload/2209/2209fig1.jpg" alt="Figure 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 1"> Figure 1. <img src="/files/ftp_upload/2209/2209fig2.jpg" alt="Figure 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 2"> Figure 2.

<ol><li>Tropepe, V., Coles, B. L., Chiasson, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retinal+stem+cells+in+the+adult+mammalian+eye%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Retinal stem cells in the adult mammalian eye.</a> Science. 287, 2032-2036 (2000).</li>
<li>Ahmad, I., Tang, L., Pham, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+neural+progenitors+in+the+adult+mammalian+eye%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Biophys+Res+Commun%22%5BJournal%5D)">Identification of neural progenitors in the adult mammalian eye.</a> Biochem Biophys Res Commun. 270, 517-521 (2000).</li>
<li>Coles, B. L., Angenieux, B., Inoue, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Facile+isolation+and+the+characterization+of+human+retinal+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Facile isolation and the characterization of human retinal stem cells.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 101, 15772-15777 (2004).</li>
<li>Cicero, S. A., Johnson, D., Reyntjens, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cells+previously+identified+as+retinal+stem+cells+are+pigmented+ciliary+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Cells previously identified as retinal stem cells are pigmented ciliary epithelial cells.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 106, 6685-6690 (2009).</li>
<li>Lamba, D., Karl, M., Reh, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+regeneration+and+cell+replacement%3A+a+view+from+the+eye%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Neural regeneration and cell replacement: a view from the eye.</a> Cell Stem Cell. 2 (6), 538-549 (2008).</li>
<li>Coles, B. L., Horsford, D. J., McInnes, R. R., van der Kooy, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loss+of+retinal+progenitor+cells+leads+to+an+increase+in+the+retinal+stem+cell+population+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Loss of retinal progenitor cells leads to an increase in the retinal stem cell population in vivo.</a> Eur J Neurosci. 23, 75-82 (2006).</li>
<li>Angénieux, B., Schorderet, F. D., Arsenijevic, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epidermal+growth+factor+is+a+neuronal+differentiation+factor+for+retinal+stem+cells+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Epidermal growth factor is a neuronal differentiation factor for retinal stem cells in vitro.</a> Stem Cells. 24 (3), 696-706 (2006).</li>
<li>Xu, S., Sunderland, M. E., Coles, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+proliferation+and+expansion+of+retinal+stem+cells+require+functional+Pax6%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">The proliferation and expansion of retinal stem cells require functional Pax6.</a> Dev Biol. 304, 713-721 (2007).</li>
<li>Canola, K., Angénieux, B., Tekaya, M., Quiambao, A., Naash, M. I., Munier, F. L., Schorderet, D. F., Arsenijevic, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retinal+stem+cells+transplanted+into+models+of+late+stages+of+retinitis+pigmentosa+preferentially+adopt+a+glial+or+a+retinal+ganglion+cell+fate%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Ophthalmol+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">Retinal stem cells transplanted into models of late stages of retinitis pigmentosa preferentially adopt a glial or a retinal ganglion cell fate.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 48 (1), 446-4454 (2007).</li>
<li>Canola, K., Arsenijevic, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+cells+committed+towards+the+photoreceptor+fate+for+retinal+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroreport%22%5BJournal%5D)">Generation of cells committed towards the photoreceptor fate for retinal transplantation.</a> Neuroreport. 18 (9), 851-855 (2007).</li>
<li>Djojosubroto, M. W., Arsenijevic, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retinal+stem+cells%3A+promising+candidates+for+retina+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Tissue+Res%22%5BJournal%5D)">Retinal stem cells: promising candidates for retina transplantation.</a> Cell Tissue Res. 331 (1), 347-357 (2008).</li>
<li>Inoue, T., Coles, B. L., Dorval, K., Bremner, R., Bessho, Y., Kageyama, R., Hino, S., Matsuoka, M., Craft, C. M., McInnes, R. R., Tremblay, F., Prusky, G. T., van der Kooy, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maximizing+functional+photoreceptor+differentiation+from+adult+human+retinal+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Maximizing functional photoreceptor differentiation from adult human retinal stem cells.</a> Stem Cells. 28 (3), 489-500 (2010).</li>
<li>Tropepe, V., Sibilia, M., Ciruna, B. G., Rossant, J., Wagner, E. F., Kooy, D. vander <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+neural+stem+cells+proliferate+in+response+to+EGF+and+FGF+in+the+developing+mouse+telencephalon.+Dev+Biol%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Distinct neural stem cells proliferate in response to EGF and FGF in the developing mouse telencephalon. Dev Biol.</a> , 208-201 (1999).</li>
<li>Coles-Takabe, B. L., Brain, I., Purpura, K. A., Karpowicz, P., Zandstra, P. W., Morshead, C. M., van der Kooy, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Don%27t+look%3A+growing+clonal+versus+nonclonal+neural+stem+cell+colonies%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Don't look: growing clonal versus nonclonal neural stem cell colonies.</a> Stem Cells. 26 (11), 2938-2944 (2008).</li>
</ol>

Ce protocole décrit comment isoler des cellules souches rétiniennes de l&#39;épithélium ciliaire de l&#39;oeil de souris 1-3. La méthodologie utilisée pour isoler les bandes de l&#39;épithélium ciliaire peut varier, cependant les enzymes et la méthodologie permettant d&#39;atteindre une suspension à cellule unique ont été optimisés dans ce protocole. Il est également important que les bandes de l&#39;épithélium ciliaire qui ont été isolés ne contiennent de grandes quantités de RPE ou cornée puisque ceux-ci semblent avoir un impact négatif sur le nombre total des sphères qui peuvent être isolés de chaque œil. En outre, les milieux sans sérum que nous faisons qui a été initialement formulé pour le cerveau neurosphères 13, est idéal pour la culture de cellules souches rétiniennes sphères. On devrait également s&#39;assurer que les cellules ne sont pas perturbés après avoir été plaqué et placés dans l&#39;incubateur afin que les sphères de plus en plus ne s&#39;agrègent pas ainsi 14. Une fois les cellules souches rétiniennes ont formé des sphères clonale, elles peuvent être comptées pour obtenir un nombre potentiel de cellules souches par œil. Les sphères, puis peuvent ensuite être dissociés en cellules individuelles et passages pour vérifier les capacités d&#39;auto-renouvellement ou différenciée selon les types de cellules différentes de la rétine neuronale et RPE en utilisant différentes combinaisons de facteurs de croissance et / ou des protéines.

<table><tbody><tr><td>Microscope Stemi 2000</td><td>Carl Zeiss, Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Source de lumière froide</td><td>Carl Zeiss, Inc.</td><td>KL1500</td><td>lumière optique à double bras</td></tr><tr><td>Ciseaux mini Vannas courbés</td><td>Fine Science Tools</td><td>15000-10</td><td></td></tr><tr><td>Ciseaux Vannas angulés</td><td>Fine Science Tools</td><td>15005-08</td><td></td></tr><tr><td>Pince #7 Dumont</td><td>Fine Science Tools</td><td>11272-30</td><td>non crantée</td></tr><tr><td>Pince #5 Dumont</td><td>Fine Science Tools</td><td>11251-10</td><td>droite</td></tr><tr><td>Pince fine</td><td>Fine Science Tools</td><td>11051-10</td><td>courbée crantée</td></tr><tr><td>Manche de scalpel #3</td><td>Almedic</td><td>2586-M36-10</td><td></td></tr><tr><td>Lames de scalpel #10</td><td>Almedic</td><td>2580-M90-10</td><td></td></tr><tr><td>Stérilisateur à billes chauffantes</td><td>Fine Science Tools</td><td>18000-45</td><td></td></tr><tr><td>Dispase</td><td>VWR international</td><td>CACB354235</td><td></td></tr><tr><td>Tripsine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T1005</td><td></td></tr><tr><td>Hyaluronidase</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H6254</td><td></td></tr><tr><td>Acide kynurénique</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>K3375</td><td>1000 UI</td></tr><tr><td>Inhibiteur de la trypsine</td><td>Roche Group</td><td>10109878001</td><td></td></tr><tr><td>Plaques de 35 mm</td><td>VWR international</td><td>CA354235</td><td></td></tr><tr><td>Plaque 24 puits</td><td>VWR international</td><td>CA73521-004</td><td></td></tr><tr><td>Pipettes munies de bourre de coton</td><td>VWR international</td><td>14672-400</td><td>poli à la flamme</td></tr><tr><td>Tubes de 14 mL</td><td>Falcon BD</td><td>352057</td><td>Polystyrène</td></tr><tr><td>Milieu sans sérum</td><td></td><td></td><td>Réf# 13 pour la formulation</td></tr><tr><td>FGF2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F0291</td><td></td></tr><tr><td>Héparine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3149</td><td>100 UI</td></tr></tbody></table>

l&#39;isolement des cellules souches rétiniennes de l&#39;oeil de la souris

Isolation of Retinal Stem Cells from the Mouse Eye

Les souches de souris adultes des cellules rétiniennes (RSC) est une cellule quiescente rares trouvées dans l&#39;épithélium ciliaire (CE) de l&#39;œil des mammifères 1,2,3. Le CE est composé de non-pigmentées intérieure et pigmentées des couches externes des cellules, et les colonies clonales SRC qui découlent d&#39;une seule cellule pigmentée de la CE sont constitués de deux cellules pigmentées et non pigmentées qui peuvent être différenciés pour former tous les types de cellules de la rétine neuronale et le RPP. Il ya une certaine controverse quant à savoir si toutes les cellules au sein des sphères contiennent tous au moins quelques pigments 4, mais les cellules sont encore susceptibles de former les différents types de cellules trouvées au sein de la rétine neurale 1-3. Chez certaines espèces, comme les amphibiens et les poissons, leurs yeux sont capables de régénération après une blessure 5, toutefois, les yeux des mammifères montre pas de telles propriétés régénératrices. Nous cherchons à identifier les cellules souches in vivo et de comprendre les mécanismes qui maintiennent les cellules souches rétiniennes de mammifères repos 6-8, même après des blessures ainsi que de les utiliser comme une source potentielle de cellules pour aider à la réparation des modèles physiques ou génétiques des lésions oculaires par la transplantation 9-12. Nous décrivons ici comment isoler les cellules épithéliales ciliaires de l&#39;oeil de la souris et les faire grandir dans la culture afin de former la rétine sphères clonale de cellules souches. Comme il n&#39;existe pas de marqueurs connus de la cellule souche in vivo, ces sphères sont le seul moyen connu d&#39;identification prospective de la population de cellules souches au sein de l&#39;épithélium ciliaire de l&#39;œil.

Dans cette vidéo, nous allons démontrer comment isoler des cellules souches rétiniennes de l&#39;épithélium ciliaire de l&#39;oeil de la souris et les faire grandir dans la culture pour former clonale sphères de la rétine. Les sphères qui sont isolées possèdent les propriétés cardinales des cellules souches: l&#39;auto-renouvellement et multipotentiality.

L&#39;isolement des cellules souches rétiniennes de l&#39;Oeil de la souris

La cellule souche rétinienne (CSR) adulte de la souris est une cellule quiescente rare située au sein de l'épithélium ciliaire (EC) de l'œil des mammifères1,2,3. L'EC est composé de...

L'objectif général de cette procédure est d'isoler des cellules souches rétiniennes à partir de l'épithélium ciliaire de l'œil. Cette étape est réalisée en nettoyant d'abord l'œil et en le coupant en deux parties, en partant du nerf optique, en coupant à travers la cornée, puis en revenant au nerf optique, puis en retirant la rétine nerveuse et le cristallin. La deuxième étape de la procédure consiste à découper l'épithélium ciliaire en sectionnant la cornée, l'iris et l'épithélium pigmenté de la rétine.La troisième étape de la procédure consiste à traiter enzymatiquement l'épithélium ciliaire, à retirer la sclérotique et à dissocier mécaniquement l'épithélium en cellules individuelles. La dernière étape de la procédure consiste à resuspendre les cellules dans un milieu sans sérum et à les ensemencer dans des plaques de culture tissulaire contenant un milieu sans sérum enrichi en facteurs de croissance. En fin de compte, des résultats peuvent être obtenus qui indiquent de façon prospective le nombre de cellules souches présentes dans l'épithélium ciliaire de l'œil, grâce à la formation in vitro de sphéroïdes clonogéniques.Bonjour, je m'appelle Brenda Coles. Notre laboratoire a mis au point cette méthode pour la première fois lorsque nous étions en train d'étudier des articles scientifiques sur les capacités régénératives des amphibiens et des poissons au niveau de leurs yeux, et nous avons émis l'hypothèse qu'il existait peut-être une cellule dans l'œil des mammifères possédant les mêmes capacités. L'isolement des cellules souches rétiniennes est effectué dans une pièce stérile spécifique dédiée aux expériences de culture primaire.Avant de commencer cette procédure, installez le microscope stéréoscopique et la source de lumière froide, puis disposez les instruments de dissection stériles. Chaque hotte est équipée d’un stérilisateur à lame chauffante permettant de stériliser les instruments entre chaque étape. Nous isolerons des cellules souches rétiniennes à partir d’yeux immédiatement placés dans une boîte de Pétri stérile contenant du liquide céphalorachidien artificiel après prélèvement sur des souris sacrifiées conformément aux protocoles approuvés d’éthique animale. L’aspect le plus délicat de cette procédure consiste à disséquer un objet rond sous le microscope.Il faut faire très attention afin de ne pas endommager le tissu d'intérêt. Sous le microscope stéréoscopique, nettoyez l'œil à l’aide de pinces. Éliminez les poils et les tissus connectifs attachés à la limite cornéo-sclérale. Puis transférez l'œil dans un nouveau plat contenant du LCR tout en maintenant l'œil immobile à l’aide de pinces crantées.Utilisez des ciseaux microchirurgicaux angulaires pour retirer les muscles oculaires. Retirez également le nerf optique s'il est encore attaché à l'œil, en veillant à ne pas écraser l'œil pendant cette manipulation. Transférez les yeux dans un nouveau plat contenant un LCR.Ensuite, utilisez des ciseaux courbes de microdissection pour couper l'œil en deux moitiés. Commencez au niveau du nerf optique et coupez à travers le milieu de la cornée, en revenant au point de départ au niveau du nerf optique. Il est idéal que les deux morceaux d’œil soient à peu près équivalents en taille, car cela facilitera l’étape suivante.En tenant les cornées à l'aide de deux pincettes, séparez délicatement les deux moitiés de l'œil. Retirez et jetez les viscères du cristallin et la rétine nerveuse des coquilles oculaires. Transférez les coquilles dans un nouveau plat contenant un liquide céphalorachidien artificiel (A CSF).Nous sommes maintenant prêts à isoler l'épithélium ciliaire. Commencez par orienter la capsule oculaire de manière à ce que la cornée soit à votre droite et l'épithélium pigmenté de la rétine soit à votre gauche. Fixez délicatement la capsule oculaire à l’aide de pinces droites sur le côté de l’EPR.Ensuite, utilisez le scalpel pour détacher la cornée et l’iris de l’épithélium ciliaire de l’œil en appuyant doucement vers le bas sur le scalpel, plutôt qu’en effectuant des mouvements de scie. Puis, découpez l’épithélium ciliaire pour le séparer de l’épithélium pigmentaire de la rétine (RPE). Utilisez une pince non cannelée pour transférer la bande d’épithélium ciliaire vers une nouvelle boîte de 35 millimètres contenant un liquide céphalorachidien artificiel (A CSF).De la même manière, isolez l'épithélium ciliaire de la coquille de l'autre œil. Une fois que les lambeaux d'épithélium ciliaire ont été collectés, transférez-les dans une boîte de 35 millimètres contenant deux millilitres de dis space. Placez la boîte avec les lambeaux dans un incubateur à 37 degrés Celsius pendant 10 minutes.Après 10 minutes, transférez les lambeaux du disque dans une boîte contenant deux millilitres de gouttes filtrées dans l'acide hallé ur haase et kind reic. Placez la boîte à 37 degrés Celsius pendant 10 minutes. Revenez maintenant au microscope stéréoscopique tout en maintenant la sclérotique vers le bas à l’aide de pinces droites.Utilisez la partie inférieure incurvée de la pince non graduée pour gratter délicatement l'épithélium ciliaire de la sclérotique. Retirez la sclérotique du plat. Tout ce qui doit rester dans le plat.Voici maintenant les cellules d'intérêt et la solution enzymatique. À l’aide d’une pipette munie d’un embout en coton et polie à la flamme, transférez la solution dans un tube de 14 litres. Agitez cette solution 30 fois afin de dissocier les cellules épithéliales en faisant doucement passer la solution à l’intérieur et à l’extérieur de la pipette, puis centrifugez le tube pendant cinq minutes à 1500 tr/min.Lorsque la centrifugation est terminée, retirez délicatement le tube de la centrifugeuse. Étant donné que les cellules ont tendance à se détacher du fond du tube, aspirez doucement la majeure partie du surnageant à l’aide d’une pipette à embout arrondi, puis ajoutez un millilitre d’inhibiteur de trypsine dans un milieu sans sérum aux cellules.Utilisez une pipette munie d'un embout en coton à petit orifice pour trier l'échantillon environ 50 fois jusqu'à obtention d'une suspension monocellulaire. Centrifugez à nouveau le tube pendant cinq minutes. À 1500 tr/min, retirez le surnageant et remplacez-le par un millilitre de votre milieu de culture.Refroidir doucement le milieu en utilisant une pipette en verre polie à la flamme pour remettre les cellules en suspension. Après avoir dénombré les cellules, les ensemencer à la densité souhaitée. Dans une plaque de 24 puits, nous ensemenchons généralement 10 cellules par microlitre en remplissant d'abord chaque puits avec du milieu, puis en ajoutant la suspension cellulaire pour obtenir un volume final de 500 microlitres de milieu.Placer la plaque dans un incubateur à 37 degrés Celsius avec du dioxyde de carbone, à un endroit où elle ne sera pas déplacée, jusqu'à ce que vous comptiez les sphères apparues après sept jours, lorsque cette procédure est réalisée avec succès. Les cellules épithéliales ciliées dissociées doivent présenter cet aspect après dissociation et ensemencement à faible densité. Après sept jours de culture, on dénombre les sphères de cellules souches rétiniennes formées.Une sphère doit avoir un diamètre supérieur à 75 micromètres et être libre en suspension pour être comptabilisée comme une sphère dérivée de cellules souches. Toutefois, certaines cellules présenteront une prolifération limitée et formeront des EHP ne répondant pas au critère de taille, et ne seront donc pas comptabilisées comme des sphères dérivées de cellules souches. Un exemple d’un tel astéroïde est montré ici après son développement.Cette technique a ouvert la voie aux chercheurs dans le domaine des sciences de la vision pour explorer la possibilité d'utiliser des cellules souches rétiniennes dans le traitement des maladies rétiniennes.

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Cette vidéo montre la procédure d’isolement des cellules ganglionnaires primaires de la rétine (CGR) murines à l’aide de la cytométrie en flux. Cette méthode permet l’étude future des CGR, dans le but de mieux comprendre le déclin majeur de l’acuité visuelle qui résulte de la perte des CGR fonctionnels dans les maladies neurodégénératives.

Isolement de cellules ganglionnaires rétiniennes murines à l’aide du tri cellulaire activé par fluorescence

Des millions de personnes souffrent de maladies dégénératives de la rétine qui entraînent une cécité irréversible. Un élément commun de nombreuses de ces maladies est la perte de cellules ganglionnaires de la rétine (RGC). Ce protocole détaillé décrit l'isolement des RGC murins primaires par sélection positive et négative avec cytométrie de flux.

Isolement des cellules de ganglion rétiniennes murines primaires (RGC) par cytométrie de flux

L’épithélium pigmentaire rétinien (RPE) est un épithélium multifonctionnel de le œil. Nous présentons ici un protocole visant à mettre en place des cultures de cellules primaires provenant de la RPE murine.

Cultures de cellules primaires de l’épithélium pigmentaire rétinien de souris

Le protocole décrit des explants organotypiques de la neurorétinede souris, cultivés avec son épithélium pigmentaire rétinien (RPE), en milieu défini R16, exempt de sérum et d’antibiotiques. Cette méthode est relativement simple à réaliser, moins coûteuse et prend beaucoup de temps par rapport aux expériences in vivo, et peut être adaptée à de nombreuses applications expérimentales.

Culture à long terme et sans sérum d’explants organotypiques de la rétine de souris avec un épithélium pigmentaire rétinien intact

Ce protocole présente deux techniques pour isoler les compartiments subcellulaires des photorécepteurs de bâtonnets murins pour l’analyse des protéines. La première méthode utilise de la rétine vivante et du papier filtre de cellulose pour séparer les segments extérieurs des tiges, tandis que la seconde utilise de la rétine lyophilisée et du ruban adhésif pour décoller les couches internes et externes des segments.

Deux méthodes de peeling pour l’isolement des compartiments des cellules photoréceptrices dans la rétine de la souris pour l’analyse des protéines

Ce protocole décrit une méthode d’isolement des cellules endothéliales rétiniennes postnatales murines optimisées pour le rendement, la pureté et la viabilité cellulaires. Ces cellules conviennent aux approches de séquençage de nouvelle génération.

Isolement de cellules endothéliales rétiniennes murines pour le séquençage de nouvelle génération

Ce manuscrit décrit un protocole simplifié pour l’isolement progressif des cellules de l’épithélium pigmenté rétinien (EPR) des yeux de souris. Le protocole comprend l’énucléation et la dissection des yeux de souris, suivies de l’isolement, de l’ensemencement et de la culture des cellules EPR.

Isolement de cellules épithéliales pigmentées rétiniennes primaires de souris

Les cultures primaires de glie de Müller obtenues à partir de rétines de souris représentent un outil très robuste et fiable pour étudier la conversion gliale en cellules progénitrices rétiniennes après un traitement par microARN. Des molécules uniques ou des combinaisons peuvent être testées avant leur application ultérieure d’approches in vivo .

Cultures cellulaires primaires pour étudier le potentiel de régénération de murin Müller Glia après un traitement par microARN

Nous décrivons une méthode simple et efficace pour isoler les cellules de l’épithélium pigmentaire rétinien (EPR) des yeux de jeunes cobayes pigmentés. Cette procédure permet des études de biologie moléculaire de suivi sur l’EPR isolé, y compris des analyses d’expression génique.

Isolement de cellules épithéliales pigmentaires rétiniennes à partir d’yeux de cobaye

Ce manuscrit décrit un protocole détaillé pour isoler les cellules gliales rétiniennes de Müller des yeux de souris. Le protocole commence par l’énucléation et la dissection des yeux de souris, suivies de l’isolement, de l’ensemencement et de la culture des cellules de Müller.

Isolement de cellules gliales gliales rétiniennes primaires de souris

L’épithélium pigmentaire rétinien (EPR) agit comme une barrière cruciale entre la choroïde et la rétine, favorisant la santé et la fonction des types de cellules rétiniennes, telles que les photorécepteurs. Nous décrivons ici un protocole simple et efficace pour isoler et cultiver l’EPR murin adulte.

Méthode simplifiée d’isolement et de culture de cellules épithéliales pigmentaires rétiniennes de souris adultes

Découvrez l'isolement des cellules souches rétiniennes de l'épithélium ciliaire de l'œil de souris. Cette méthode permet de former des sphères clonales et d'étudier leurs propriétés d'auto-renouvellement pour la recherche en médecine régénérative.

L'isolement des cellules souches rétiniennes de l'Oeil de la souris

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