Name: 핵산의 NanoDrop Microvolume의 Quantitation (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-11-22T17:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 28 s
Description: 배우세요 NanoDrop 마이크로볼륨 분광광도계를 활용한 핵산 정량화 방법을. NanoDrop 2000C와 3300을 사용하여 소량 샘플로 정확한 농도 측정과 순도 분석을 수행하는 실험 기법을 익히세요.

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리처드 W. 베린저와 데이비드 L. 애쉬, 기술 지원 및 촬영에 대한 응용 과학자, 써모 사이 언티픽 NanoDrop 제품.

1. NanoDrop 2000c 분광을 사용 Microvolume 핵산 부량 <ol><li> 시작하려면 아래 광학 표면에 깨끗한 탈이온수 2 ~ 3 μL를 pipetting하여 microvolume 분광 광도계 샘플 유지 시스템의 위턱과 아래턱에 광학 표면을 청소하십시오. </li><li> 상단 받침대는 탈이온수 접촉 들어오는 있도록, 레버 암을 닫습니다. 레버 암을 들어 깨끗하고, 건조, 보푸라기가없는 실험실 닦아와 함께 광학 표면을 모두 닦아. </li><li> NanoDrop 소프트웨어를 열고 핵산 응용 프로그램을 선택합니다. 낮은 광학 표면에 버퍼 1 μL를 분배하여 빈 측정을 수행하는 작은 볼륨 보정 pipettor을 사용하십시오. 레버 암을 절감하고 핵산 응용 프로그램에서 "공백"을 선택하십시오. </li><li> 일단 빈 측정이 완료되면, 깨끗하고, 건조, 보푸라기가없는 실험실 닦아와 함께 광학 표면 모두를 청소하십시오. </li><li> 측정되어야하는 예제에 해당하는 상수를 선택합니다. <table border="1"><tbody><tr><td> 샘플 유형 </td><td> 옵션 선택 </td><td> 농도를 계산하는 데 사용 상수 </td></tr><tr><td> dsDNA </td><td> DNA - 50 </td><td> 50 </td></tr><tr><td> ssDNA </td><td> DNA - 33 </td><td> 33 </td></tr><tr><td> RNA </td><td> RNA - 40 </td><td> 40 </td></tr><tr><td> Oligo </td><td> 사용자 정의 </td><td> 15-150 </td></tr></tbody></table> 표 1. NanoDrop microvolume 분광 광도계, TrayCell microcell 쿠베트와 함께 사용 전통 쿠베트 기반 분광 광도계 및 PicoGreen 분석과 함께 microvolume의 NanoDrop의 fluorospectrometer를 사용하여 직접 A280 흡광도 측정에 대한 일반적인 핵산 농도 범위. </li><li> 낮은 광학 받침대에 핵산 샘플의 1 μL를 분배하고 레버 암을 닫습니다. 측정 독립적인 볼륨이기 때문에 예제는 만들 수있는 측정을위한 두 광학 표면 사이의 격차에 다리를 놓으려고해야합니다. </li><li> 어플 리케이션 소프트웨어에서 "법안"를 선택하십시오. 소프트웨어는 자동 핵산 농도 및 순도 비율을 계산합니다. 샘플 측정에 따라, 스펙트럼 출력을 검토합니다. </li><li> 소프트웨어는 자동 핵산 농도 및 순도 비율을 계산합니다. 샘플 측정에 따라 샘플의 품질을 평가하기 위해 스펙트럼 이미지를 검토합니다. </li><li> 전형적인 핵산 샘플은 매우 특징적인 프로필을 것입니다. <img src="/files/ftp_upload/2565/2565fig1.jpg" alt="그림 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 1"> 그림 1. 전형적인 핵산 샘플은 매우 독특한 프로필을 것입니다. </li><li> 특정 핵산 분리 기술과 관련된 오염 물질의 일반적인 소스는 페놀 / Trizol 및 열 추출을 포함합니다. 페놀 / Trizol 추출의 경우, 잔여 시약의 오염은 220-240 nm의 사이에 비정상적인 스펙트럼에 의해뿐만 아니라 260-280 nm의 영역에 교대로 표시됩니다. 반대로 열 추출에서 잔여 구아니딘 230 nm의 근처에 최대 230 nm의 약 240 nm의에 여물 변화에 기여할 수 있습니다. <img src="/files/ftp_upload/2565/2565fig2.jpg" alt="그림 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 2"> 그림 2. 샘플 B와 C의 봉우리와 골짜기에있는 교대는이 오염 물질은 핵산 샘플의 스펙트럼에 영향을 미칠 수있는 방법을 설명 샘플을 비교했다. </li><li> 정확하게 샘플의 품질을 평가하기 위해, 280분의 260 또는 230분의 260 비율이 전체 스펙트럼 품질와 함께 분석해야합니다. 순수한 핵산은 일반적으로 각각 ~ 1.8 280분의 260 비율과 DNA와 RNA에 대한 ~ 2.0 280분의 260 비율을 얻을 수 있습니다. 이 비율은 산도와 빈과 샘플 측정하기 위해 사용되는 버퍼의 이온 강도에 따라 좌우됩니다. 기본 솔루션이 0.2-0.3의 비율을 통해 - 대표되지만 산성 솔루션은 0.2-0.3의 비율을 세 이하 대표 것입니다. 크게 다른 순도 비율 280 nm의 또는 근처에 강하게 흡수 단백질, 페놀 또는 기타 오염 물질의 존재를 나타낼 수 있습니다. 230분의 260 순도 비율은 1.8-2.2의 범위에서 일반적으로 "순수"핵산의 산성에 대한 값으로 DNA 순도의 두 번째 측정하기위한 한 방법입니다. 예상 값보다 훨씬 낮은 순도의 비율이 사용되는 절연 기술 추가 최적화가 필요할 수 있습니다 나타낼 수 있습니다. </li><li> NanoDrop spectrophotometers도 직접 흡광도를 사용하여 단백질이나 단백질 colorimetric assays로를 계량하는 데 사용할 수 있습니다. 적절한 열 형성과 재현성을 보장하기 위해, 2 μl 샘플은 단백질 샘플하시기 바랍니다. 다음 조브 비디오를 참조하십시오 NanoDrop 분광 사용 Microvolume 단백질 농도 결정 <a href="https://www.jove.com/index/Details.stp?ID=1610">https://www.jove.com/index/Details.stp?ID=1610을</a> </li></ol><ol><li> NanoDrop 3300을 사용하여 높은 감도 microvolume 핵산 quantitation을 발휘하려면 PicoGreen 형광 키트가 사용됩니다. 시작하려면, 상온에 키트 표준 및 모든 핵산 샘플을 평형. 형광 샘플 빛을 민감한 있으며 황색 또는 알루미늄 포장 튜브에 보관해야합니다. </li><li> 필요하게 될 PicoGreen 작업 솔루션을뿐만 아니라 측정하는 모든 표준 및 샘플에 대한 충분한 1X TE 버퍼를 준비합니다. 제조 업체의 절차에 따라 nuclease 무료 물을 제공 20x TE 버퍼를 diluting하여 1xTE 버퍼를 준비합니다. 반응 볼륨은 200 μL로부터 거의 10 UL 범위 수 있습니다. 이 예제에서, 10 μL 반응 볼륨이 준비됩니다. </li><li> nuclease 무료 튜브 또는 튜브에 배 최종 원하는 농도에 순차적으로 희석 dsDNA 표준을 준비합니다. nuclease 무료 호박이나 박 덮인 튜브 라벨 개별로 희석 dsDNA 기준의 각 5 μL를 전송합니다. </li><li> 적절하게 표시 nuclease - 무료 호박이나 박 덮인 튜브에 관심 각각의 dsDNA 샘플의 나누어지는 5 μL. </li><li> 제조 업체의 프로토콜에 따라 PicoGreen 작업 솔루션을 준비합니다. 관심의 표준 또는 샘플 (이 예에서는 5 μL) 중 하나를 포함하는 각각의 튜브에 PicoGreen 작업 솔루션의 동일한 볼륨을 전송합니다. </li><li> 참조 솔루션으로 제공하는 대조군을 준비하는 1X TE 버퍼와 PicoGreen 작업 솔루션의 동등 권을 결합합니다. </li><li> 부드러운 pipetting에 의해 철저하게 각각의 반응 관의 내용을 섞어 5 분 실온에서 반응을 품어. 형광 신호가 온도의 영향으로 모든 기준과 샘플을 측정하기 전에 동일한 온도 equilibrated해야합니다. </li><li> 악기를 준비하고 측정을 수행하려면 먼저 샘플 유지 시스템의 낮은과 상부 표면을 청소하십시오. 낮은 광학 표면에 탈이온수의 Pipet 2-3 μL가 가까이 후 레버 팔을 열고 깨끗하고 보푸라기가 무료로 상단과 하단 받침대를 얼룩, 연구실 닦으십시오. 표면은 보풀이 여기 소스의 존재에 형광 전시하고 측정을 방해할 수로 진행하기 전에 보푸라기가 무료입니다 보장합니다. </li><li> , 악기 소프트웨어를 열고 "핵산"응용 프로그램을 선택하고 "PicoGreen - dsDNA"옵션을 선택합니다. </li><li> 악기를 공백으로, 하단 받침대에 1X TE 2 μL를 추가 팔을 가까이하고 악기 소프트웨어 분야에서 "공백"을 선택하십시오. 일단 비어가 완료, 샘플 유지 시스템의 두 표면에서 빈 솔루션을 얼룩. </li><li> 부드러운 pipetting하여 레퍼런스 솔루션을 섞는다. 하단 받침대에 낮은 유지 팁, 피펫 2 μL를 사용하고 팔을 닫습니다. </li><li> 측정 타입의 "참조"를 선택하고 원하는 단위를 선택합니다. 측정주기를 시작하려면 "법안"을 클릭하십시오. </li><li> 측정주기가 완료되면, 팔을 열고 철저하게 샘플 보존 시스템 표면을 얼룩. 다섯 최대 측정하면 각 복제에 대한 새로운 나누어지는을 사용하여 참조 복제합니다. </li><li> 표준 곡선을 구축하기 위해 추가적인 표준 프로세스를 반복합니다. 최대 일곱 기준은 사용할 수 있습니다. 소프트웨어는 5 각 표준에 대한 복제를 저장할 수 있도록 설계되었습니다. 표준의 복제는 샘플 농도가 자동으로 결정되는에서 표준 곡선을 생성하기 위해 평균입니다. </li><li> 표준 곡선이 완료되면, "샘플"탭을 선택하고 각각의 샘플 ID 정보를 입력하고 각각의 미지의 샘플을 측정합니다. </li></ol>

<ol><li>Wilfinger, W. W., Mackey, K., Chomczynski, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+pH+and+Ionic+Strength+on+the+Spectrophotometric+Assessment+of+Nucleic+Acid+Purity%5BTitle%5D)+AND+%22BioTechniques%22%5BJournal%5D)">Effect of pH and Ionic Strength on the Spectrophotometric Assessment of Nucleic Acid Purity.</a> BioTechniques. 22, 474-481 (1997).</li>
<li>Voolstra, C., Jungnickel, A., Borrmann, L., Kirchner, R., Huber, A. Spectrophotometric Quantification of Nucleic Acids: LabelGuard enables photometric quantification of submicroliter samples using a standard photometer. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aVoolstra%2C+C+%22Implen+Applications+Note%22">Implen Applications Note</a>. , Munich, Germany. (2006).</li>
<li>Jr, I. ngle, D, J., Crouch, S. R. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aJr%2C+Ingle+%22Spectrochemical+analysis%22">Spectrochemical analysis</a>. , Prentice Hall. Englewood Cliffs, NJ. XV-590 (1988).</li>
<li>Van Lancker, M., Gheyssens, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comparison+of+four+frequently+used+assays+for+quantitative+determination+of+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Lett%22%5BJournal%5D)">A comparison of four frequently used assays for quantitative determination of DNA.</a> Anal. Lett. 19, 615-623 (1986).</li>
</ol>

필립 데자르뎅와 데브라 콘클린이 문서에서 사용되는 악기를 생산 써모 과학 NanoDrop 제품, 병원에서 근무하고 있습니다.

여기에 제시 quantitation 프로토콜은 가장 널리 인정 microvolume 시스템을 기반으로합니다. 이러한 시스템은 큰 샘플 볼륨 억제 장치의 사용에 의존하는 전통적인 핵산 quantitation 방법론에 대한 실질적인 대안을 제공합니다. NanoDrop microvolume 기술은 액체 칼럼을 형성 측정되는 시료의 표면 장력 특성에 의존 샘플 보존 시스템을 사용합니다. 이것은 예제는 적절한 열 형성을위한 상위 및 하위 광학 측정 표면과 접촉을하게되는 중요합니다. 측정 결과가 부정확하거나 재현할 수없는 것 어떤 시점에서면, 그것은 대부분 샘플 이질이나 액체 열 파손의 결과입니다. 세제 및 이소 프로필 알코올은 그들이 클수록 측정 표면을 uncondition 수 있으므로 요원을 청소하지 않는 것이 좋습니다. 무조건 받침대는 샘플 비말의 평평화 그 결과, 받침대의 소수성 표면 특성이 손상되었을 경우에 발생합니다. 무조건 받침대는 측정하는 동안 액체 칼럼의 파손으로 이어질 수 있습니다. <img src="/files/ftp_upload/2565/2565fig3.jpg" alt="그림 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 3"> 그림 3. 무조건 표면은 물의 비말의 평평화이 특징입니다. Uncondtioned 페데 스탈의 표면은 NanoDrop 받침대 Reconditioning 컴파 운드 (PR - 1, 써모 과학 NanoDrop 제품)를 사용 reconditioned 수 있습니다. reconditioning 화합물의 얇은 레이어 ~ 30 초 동안 건조 허용 상단 및 하단 받침대 표면에 적용되는 다음, 깨끗하고, 건조, 보푸라기가없는 실험실을 사용하여 닦아에서 문질러서. 성공적으로 reconditioned 상태는 바닥 받침대 표면에 적용할 때 구슬 세공 물 비말에 의해 특징입니다. <img src="/files/ftp_upload/2565/2565fig4.jpg" alt="그림 4" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="그림 4"> 그림 4. reconditioned 표면은 물의 비말 최대 구슬 장식이 특징입니다. Microvolume의 quantitation 시스템은 크게 샘플 소비를 줄이고보다 전통적인 부량 시스템에 비해 급격하게 농도 범위를 향상시킬 수 있습니다. microvolume의 quantitation는 종종 제한된 세포 바늘 biopsies 및 레이저 캡처 microdissection 같은 대량의 효율성과 편의의 사용이 방법론은 만들었습니다 그것 널리 인정하는 대신 전통적인 핵산 quantitation 방법에 관련된 상황에 대한 사용 기술되어 있지만도 샘플 풍부한 경우.

<table><tbody><tr><td>NanoDrop 2000c</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>ND-2000C</td><td></td></tr><tr><td>NanoDrop 3300</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>ND-3300</td><td></td></tr></tbody></table>

핵산의 nanodrop microvolume의 quantitation

NanoDrop Microvolume Quantitation of Nucleic Acids

Biomolecular의 assays은 지속적으로 자주 microvolume의 quantitation를 수행할 수있는 사람들을 위해 핵산 quantitation에 대한 기존 쿠베트 기반 악기의 사용을 precluding, 재료의 점차 작은 금액을 사용하는 것이 개발되고있다. NanoDrop microvolume 샘플 유지 시스템 (써모 사이 언티픽 NanoDrop 제품) 등 cuvettes이나 모세 혈관과 같은 전통적인 억제 장치의 독립적인 시료의 미세한을 캡처하고 유지하기 위해 광섬유 기술과 자연의 표면 장력 특성을 결합하여 기능을 수행합니다. 또한, 시스템은 본질적으로 dilutions을 수행하기 위해 필요가 없습니다. 짧은 경로 길이, 핵산 농도 측정의 광범위한 결과를, 고용 spectroscopic 분석에 필요한 샘플의 볼륨을 줄이면 또한, 많은 분자 흐름 전반에 걸쳐 추가적인 품질 관리 단계의 포함을 용이 효율성을 증가하고 궁극적으로 하류 결과에 큰 자신감을 선도. 제한된 질량 높은 감도 형광 분석을위한 필요는 또한 최근의 실험 발전과 함께 등장했습니다. 같은 microvolume 샘플 보존 기술을 사용하여 형광 측정은 형광 assays 볼륨 요구 사항이 대폭 줄일 수 있도록 재료의 2 μL을 수행할 수 있습니다. 10 μL 이하의 이러한 microreactions는 전용 microvolume의 fluorospectrometer를 사용하여 지금은 가능합니다. 두 microvolume 핵산 quantitation 프로토콜은 전통적인 쿠베트 기반 프로토콜에 실질적인 대안으로 통합 샘플 보존 시스템을 사용하는 것이 증명됩니다. 첫째, microvolume 분광 광도계를 사용하여 직접 A260 흡광도 방법을 설명합니다. 이 microvolume의 fluorospectrometer로 감소 볼륨 형광 반응을 사용할 수있는 형광 기반의 방법을 시범옵니다. 이 소설 기법은 1에서 PG / μL 시료의 최소한의 소비와 15,000 NG / μL까지 핵산 농도의 평가를 가능하게합니다.

전통적인 핵산 quantitation 방법론을 실천하고 효율적인 대안으로 NanoDrop microvolume 시스템의 사용은 두 microvolume 핵산 quantitation 프로토콜의 시범을 통해 설명합니다.

핵산의 NanoDrop Microvolume의 Quantitation

점점 더 적은 양의 시료를 사용하는 생체 분자 분석법이 지속적으로 개발되고 있으며, 이는 종종 기존의 ... 사용을 배제하게 합니다.

NanoDrop 샘플 유지 시스템은 액체 고유의 표면 장력을 이용하여 QTS나 모세관 없이 두 개의 광학 페데스탈 사이에 마이크로 볼륨 샘플을 유지하고 측정하는 혁신적인 기술입니다. 1 µL만큼 적은 양의 샘플을 하단 광학 표면 위에 직접 피펫팅합니다. 분광계 암을 닫으면 상단과 하단 광학 페데스탈 사이에 액체 기둥이 형성됩니다.표면 장력으로 수직 광학 경로가 형성되어, 측정 중에 수직 경로 길이가 실시간으로 자동 변경될 수 있습니다. 경로 길이를 단축함으로써 더 높은 농도의 측정이 가능해지며, 대부분의 핵산 샘플에 대해 희석 과정을 수행할 필요성을 효과적으로 제거합니다. 또한, 샘플 유지 시스템은 실험실용 와이프로 광학 표면을 단순히 닦아내는 빠른 세척 과정을 통해 실험 프로세스를 가속화합니다.오늘은 Thermo Scientific 마이크로 볼륨 장비를 사용하여 핵산 농도를 측정하는 두 가지 절차를 시연하겠습니다. 첫 번째 프로토콜은 NanoDrop 2000C 분광광도계를 이용한 직접적인 핵산 측정이며, 두 번째 프로토콜은 NanoDrop 3000 형광 분광광도계를 이용한 간접 형광 핵산 측정입니다.시작하려면, 깨끗한 탈이온수를 2~3 µL 파이펫팅하여 마이크로 볼륨 분광광도계 시료 유지 시스템의 하단 광학 표면에 떨어뜨려 상단 및 하단 광학 표면을 세척합니다. 레버 암을 닫아 상단 페데스탈이 탈이온수에 닿도록 합니다. 레버 암을 들어 올리고 깨끗하고 건조한 보풀 없는 실험용 와이프로 양쪽 광학 표면을 닦아냅니다.다음으로, NanoDrop 소프트웨어를 실행하고 핵산 애플리케이션을 선택하십시오. 소량 분주용 교정 피펫을 사용하여 1 µL의 버퍼를 하단 광학 표면에 분주하여 블랭크 측정을 수행합니다. 레버 암을 내리고 핵산 애플리케이션에서 blank를 선택하십시오.공시료 측정이 완료되면, 실험용 와이프로 양쪽 광학 표면을 닦아냅니다. 이전과 마찬가지로 측정할 시료에 적합한 상수를 선택하십시오. 다음으로, 1 µL의 핵산 시료를 하단 광학 페데스탈에 분주하고 레버 암을 닫습니다.측정이 부피와 무관하게 이루어지므로, 샘플은 두 광학 표면 사이의 간극을 메울 정도만 있으면 됩니다. 측정을 수행하려면 애플리케이션 소프트웨어에서 measure를 선택하십시오. 그러면 소프트웨어가 핵산 농도와 순도 비율을 자동으로 계산합니다. 샘플 측정 후 스펙트럼 결과물을 검토하십시오. 전형적인 핵산 샘플은 매우 특징적인 프로파일을 나타냅니다.품질이 낮은 시료의 스펙트럼 지표로는 베이스라인의 파형 및 260 nanometer 피크에서의 굴곡 등이 있습니다. 특정 핵산 분리 기술과 관련된 일반적인 오염원은 페놀, 트라이올 및 컬럼 추출 등이 있습니다. 페놀 트라이올 추출의 경우, 220에서 240 nanometer 사이의 비정상적인 스펙트럼과 260에서 280 nanometer 영역의 이동을 통해 잔류 시약 오염을 확인할 수 있습니다.반대로, 컬럼 추출 시 잔류한 구아니딘(guanidine)은 230nm 부근의 피크를 형성하거나, 저점(trough)을 230nm에서 약 240nm로 이동시키는 원인이 될 수 있습니다. 시료의 순도를 정확하게 평가하려면 260/280 및 260/230 비율을 전체적인 스펙트럼 품질과 함께 분석해야 합니다. 순수한 핵산의 경우, 260/280 비율은 일반적으로 DNA는 약 1.8, RNA는 약 2.0으로 나타납니다.이 비율은 블랭크 및 샘플 측정에 사용된 완충액의 pH와 이온 강도에 따라 달라집니다. Banana drop 3, 300 형광 분광계는 NanoDrop 2000 C 분광 광도계와 동일한 특허 받은 미량 샘플 유지 시스템을 채택하고 있습니다. 단 1 µL의 샘플만으로 형광 측정이 수행되며, 사용자는 샘플에 수평으로 조사되는 3가지 LED 중 하나를 여기 광원으로 선택합니다.그 후 샘플의 형광은 수직 90도 각도로 내부 분광계로 수집됩니다. NanoDrop 3, 300을 이용한 고감도 미량 핵산 정량을 시연하기 위해, PicoGreen 형광 키트를 사용하여 키트 표준물질과 모든 핵산 샘플을 실온으로 평형화하기 시작합니다. 형광 샘플은 빛에 민감하므로 갈색 튜브나 알루미늄 호일로 감싼 튜브에 보관해야 합니다.측정할 모든 표준물질과 샘플, 그리고 필요한 pico green 작업 용액에 충분한 양의 1X TE 완충액을 준비하십시오. 제조사의 프로토콜에 따라 제공된 20X TE 완충액을 nuclease-free water로 희석하여 1X TE 완충액을 준비하십시오. 반응 부피는 200 µL에서 최소 10 µL까지 조절 가능합니다.본 예제에서는 10 µL의 반응 부피를 준비하겠습니다. 다음으로, 미지의 DNA 샘플의 예상 농도 범위를 포괄할 수 있도록 연속 희석한 이중 가닥 DNA 표준 물질과 뉴클레아제 프리 바이알 또는 튜브를 준비하십시오.희석된 이중 가닥 DNA 표준물질 각각 5 µL를 개별적으로 라벨링된 뉴클레아제 프리 앰버 튜브 또는 호일로 감싼 튜브에 옮깁니다. 그런 다음, 분석 대상인 각 이중 가닥 DNA 시료 5 µL를 적절하게 차광 처리된 튜브에 분주합니다. 제조사의 프로토콜에 따라 Pico Green 작업 용액을 준비한 후, 이중 가닥 DNA 표준물질 또는 이중 가닥 DNA 시료가 들어 있는 각 튜브에 동일한 부피의 용액(이 경우 5 µL)을 옮깁니다.XTE 완충액과 Pico Green 작업 용액을 동일한 부피로 혼합합니다. 기준 용액으로 사용될 음성 대조군을 준비합니다. 완만한 피펫팅을 통해 각 튜브의 내용물을 충분히 섞은 후, 상온에서 5분 동안 배양합니다.형광 신호는 온도에 영향을 받으므로, 측정 전 모든 표준물질과 시료를 동일한 온도로 평형화해야 합니다. 기기를 준비하고 먼저 측정을 수행하려면, 시료 유지 시스템의 하단 및 상단 표면을 세척하고, 하단 광학 표면 근처에 탈이온수를 2~3 µL 피펫으로 분주하십시오. 그런 다음 레버 암을 열고 깨끗한 보풀 없는 실험실용 와이프로 상단 및 하단 페데스탈을 닦아내십시오.진행하기 전에 표면에 보풀이 없는지 확인하십시오. 보풀은 여기 광원이 있을 때 형광을 나타낼 수 있으며 측정을 방해할 수 있기 때문입니다. 기기 소프트웨어를 실행하십시오.핵산 애플리케이션을 선택하고 pico green 이중 가닥 DNA 옵션을 선택하십시오. 2 µL의 1X TE를 하단 페데스탈에 피펫팅합니다. 레버 암을 닫고 기기 소프트웨어 필드에서 blank를 선택하십시오. 블랭크 측정이 완료되면 샘플 유지 시스템의 양쪽 표면에서 블랭크 용액을 닦아내십시오.다음으로, low retention 팁을 사용하여 부드럽게 피펫팅하여 표준 용액을 혼합합니다. 표준 용액 2 µL를 하단 페데스탈에 피펫팅하고 레버 암을 닫습니다. standards 탭에서 reference를 선택하고 원하는 단위를 선택합니다.측정(measure)을 클릭하여 측정 사이클을 시작합니다. 측정 사이클이 완료되면 레버 암을 열고 시료 유지 시스템 표면의 액체를 완전히 닦아냅니다. 매 반복 측정마다 새로운 Eloqua를 사용하여 표준 물질을 최대 5회 반복 측정합니다.표준 곡선을 작성하기 위해 추가 표준품에 대해 동일한 과정을 반복하십시오. 최대 7개의 표준품을 사용할 수 있습니다. 소프트웨어는 각 표준품당 최대 5개의 반복 측정값을 저장하도록 설계되어 있습니다.표준물질의 반복 측정값을 평균하여 표준 곡선을 생성하며, 이를 통해 시료 농도가 자동으로 결정됩니다. 표준 곡선 작성이 완료되면 시료 탭을 선택하고, 각각의 시료 ID 정보를 입력한 후 각 미지 시료를 측정하십시오. 유효한 곡선이 생성되었다는 것은 표준물질의 최소 개수 요건이 충족되었음을 의미합니다.DNA 농도는 표준 곡선을 기반으로 자동 계산됩니다. NanoDrop 미량 분석 기기는 직접적인 A260 측정 또는 간접적인 형광 측정법을 통해 핵산 농도를 결정할 수 있습니다. NanoDrop 분광광도계는 또한 직접적인 A280 흡광도 측정 또는 단백질 비색 분석법을 사용하여 단백질을 정량하는 데 사용할 수 있습니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

이 동영상은 methylated DNA의 immunoprecipitation (MeDIP)에 대한 프로토콜을 보여줍니다. MeDIP가 선택 (안티 - 5 MC) 5 methylcytosine에 대한 특이성과 항체를 사용하여 게놈 DNA 샘플에서 methylated DNA 조각을 추출 두 하루 절차입니다.

Methylated DNA의 Immunoprecipitation

Microvolume 샘플 cuvettes이나 모세 혈관의 사용없이 샘플을 유지하기 위해 천연 표면 장력을 사용하는 분광 광도계 시스템 계량입니다. 그들이 측정 수있는 단백질 농도와 속도의 동적 범위는 크게이 방법으로 증가하고 있습니다.

NanoDrop 2000c 분광을 사용 Microvolume 단백질 농도 결정

의사 소통이 dsDNA와 단백질 quantitation에 대한 BioSpec - UV - VIS 나노 분광 광도계의 정확성과 재현성에 대한 데이터를 제공합니다. 자동 닦는 함수가 처리량과 더 정확한 결과를 위해 최소한의 carryover 결과를 개선하는 동안에도 초소형 볼륨 (1-2 패), 재현성이 우수합니다.

마이크로 볼륨 바이오 사양 나노 분광 광도계를 사용하여 핵산 및 단백질 농도 결정

이 비디오는 DNA 샘플에서 단일 뉴클레오티드 변이를 검출하기 위한 chip-in-a-tube 형식의 디지털 PCR의 유용성을 보여줍니다. 단일 PCR 반응은 독립적인 PCR 반응으로 작용하는 챔버로 분할되며, 챔버 내 증폭된 표적에서 형광 신호를 검출하는 것은 샘플 내 변이 대립유전자의 빈도를 계산하는 데 사용됩니다.

단일 뉴클레오티드 변이체의 정량화를 위한 Chip-in-a-tube 기반 디지털 PCR

MicroRNA(miRNA)는 널리 보존된 조절 분자 부류입니다. 여기에서는 두 가지 강력한 ligation 단계와 high-throughput sequencing에 의존하는 miRNA 클로닝 방법에 대해 설명합니다. 당사의 방법은 miRNA의 정확한 게놈 전체 정량을 가능하게 합니다.

높은 처리량 시퀀싱에 의한 마이크로 RNA 정량을위한 작은 RNA 분자의 고효율 내고

우리는 단순화된 (아날로그) 판독으로 핵산을 정량화하기 위한 종말점 디지털 분석을 설명합니다. 당사는 특수 기기가 아닌 표준 qPCR 기계를 사용하여 액적 기반 디지털 분석의 벌크 형광을 측정하고 현미경 검사로 결과를 확인합니다.

디지털 핵산 정량 분석​​ 실험의 단순 대량 판독

염료 기반 화학 및 액적 디지털 PCR 기술을 사용한 cell-free microRNA 정량화를 위한 민감하고 정확한 방법에 대해 설명합니다.

마이크로 RNA 정량는 DNA 결합 염료 화학, 물방울 디지털 PCR을 사용하여 순환

Semiflexible 폴리머 생명체가 광범위 하 게 적용 되는 독특한 기계적 속성을 표시 합니다. 그러나, biopolymers에 대 한 체계적인 연구는 폴리머 강성 같은 속성은 액세스할 수 없습니다 이후 제한 됩니다. 이 원고는이 제한 프로그래밍 가능한 DNA 나노튜브, 강성 필 라 멘 트의 영향에 대 한 실험 연구를 활성화 하 여 우회는 어떻게 설명 합니다.

Semiflexible 고분자 공부를 다양 한 도구로 DNA 나노튜브

여기에서는 단일 세포에서 절대 미토콘드리아(mt)DNA 복제 수와 mtDNA 결실 이형질 수준을 측정하기 위한 프로토콜을 제시합니다.

디지털 액적 중합효소 연쇄반응을 이용한 단세포 미토콘드리아 DNA 복제 수 및 이형질 측정

DNAzyme 기반 나노머신은 핵산의 매우 선택적이고 민감한 검출에 사용할 수 있습니다. 이 기사에서는 무료 소프트웨어를 사용하여 10-23 코어를 가진 DNAzyme 기반 나노머신을 설계하기 위한 자세한 프로토콜과 Epstein-Barr 바이러스 단편 검출에 대한 응용 프로그램에 대해 설명합니다.

DNAzyme 10-23 - 핵산 인식을 위한 기반 나노머신

이 프로토콜은 마우스 안구 수정체 상피와 섬유 세포 벌크 질량의 분리에 이어 RNA 분리 및 qPCR 분석을 자세히 설명합니다. 이 방법을 사용하면 상피 세포와 분화된 섬유 세포의 전사체 및 생물학적 과정을 보다 자세히 분석하기 위해 수정체 세포 구획을 분리할 수 있습니다.

마우스 안구 수정체 상피 및 섬유 세포 벌크 덩어리에서 RNA 분리

배우세요 NanoDrop 마이크로볼륨 분광광도계를 활용한 핵산 정량화 방법을. NanoDrop 2000C와 3300을 사용하여 소량 샘플로 정확한 농도 측정과 순도 분석을 수행하는 실험 기법을 익히세요.

핵산의 NanoDrop Microvolume의 Quantitation

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