Name: Pressurizzazione impulsivo delle cellule neuronali per lo studio traumatica lesione cerebrale (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-10-12T12:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 24 s
Description: Scopri la pressurizzazione impulsiva delle cellule neuronali per studiare i meccanismi del trauma cranico usando il dispositivo Kolsky bar. Questo metodo consente di controllare pressione e durata per analizzare la morte cellulare e i danni strutturali.

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Gli autori desiderano ringraziare le fonti di finanziamento: Esercito-UNL Centro per la Meccanica Trauma (DoD / ARO, # W911NF-11-1-0033, PI: Dr. Namas Chandra), Premio Layman UNL (-001 26-1110-0033 , PI: Lim).

1. Coltura cellulare neuronale <ol><li> Cellule del cervello, comprese cellule neuronali, astrociti, e la loro co-coltura può essere utilizzato come modello cellulare. A dimostrazione di fattibilità, pressurizzazione impulsivo delle cellule neuronali linea cellulare viene presentato. </li><li> SH-SY5Y cellule di neuroblastoma umano (ATCC, CRL-2266) sono coltivate su 18 coprioggetto mm di vetro di diametro. Le cellule vengono seminate ad una densità di 3 x 10 3 cellule / cm 2 mediante i mezzi di crescita composto DMEM supplementato con 10% di siero fetale bovino e 1% di penicillina-streptomicina. Vetrini cellule coltivate vengono conservati in 5% CO 2 incubatore umidificato a 37 ° C. </li><li> Per ottenere la differenziazione neuronale delle cellule SH-SY5Y, le cellule vengono trattate con supporti ulteriormente integrato con 10 mM di acido retinoico (RA) per 7 giorni con supporti cambiati ogni due giorni. Il giorno 7, le cellule sono pronte per essere in pressione. </li></ol> 2. Pressurizzazione Attrezzatura: Kolsky Bar <ol><li> Il bar Kolsky, desviluppata da Kolsky 1 nel 1949, è stato utilizzato per misurare le proprietà meccaniche di un materiale ad un tasso di carico molto elevata. L'apparecchiatura consiste di due barre con un campione posto in contatto tra le barre. Un onda d'urto, creata sulla barra incidente, propaga al campione in cui l'onda si divide in un'onda riflessa e trasmessa. Lo stress nel campione è proporzionale alla onda trasmessa. In questo studio, si utilizzano una camera di pressurizzazione cella da interporre tra le due barre del Kolsky set-up. </li><li> Le due barre di lega di alluminio (ogni 6-m) sono sospese da bronzine allineati, e una camera di pressurizzazione in vitro di cellule è inserita tra le barre. Il bar a monte è la barra incidente con una massa di 130 £ fissato su una delle estremità. Un morsetto di attrito è collocato in una posizione che darà la durata di impulso desiderata. Impegnando il morsetto e il serraggio di un jack forbice tra la massa ed un supporto di carico, il morsetto-massa sezione della barra incidente è pre-compressed al livello desiderato. Costringendo un bullone dentata che blocca il morsetto di una rottura improvvisa di un sistema idraulico rilascia la compressione pre-memorizzati rapidamente e genera così un impulso di pressione. Questo si propaga attraverso la barra incidente, spinge il pistone camera di prova, e pressurizza il fluido e le cellule all'interno della camera impulsivamente. La camera di pressurizzazione a sua volta emette un impulso di pressione di moltiplicazione nei bar a valle trasmessi. I ceppi associati con gli impulsi di pressione nelle barre sono misurate con manometri ad alta resistenza estensimetri composti eccitati a 45 volt. I segnali di gauge sono registrate con un oscilloscopio digitale a 1 MHz come una storia di carico. </li><li> La camera di pressurizzazione in vitro di cellule è composto da un cilindro-pistone. Il cilindro ha diametro interno 2,6 cm e 3,8 cm di diametro esterno, e ha un piccolo foro filettato alla base della cavità. Il foro funge da sfiato aria e liquidi in eccesso durante l'installazione cella campione. Il pistone è 7,5 cm di lunghezzaed è realizzato in materiale stessa barra. Il pistone è avvolto con due o tre strati di idraulico (Teflon) del nastro che fungono da guarnizione a basso attrito. La testata è di 32 mm di lunghezza e dispone di due piccole viti in acciaio inox che fissano i vetrini (in cui le cellule sono coltivate) durante il caricamento. </li></ol> 3. Pressurizzazione impulsivo delle cellule neuronali <ol><li> Tutte le parti della camera di pressurizzazione sono sterilizzati usando l'autoclave e sono tenuti sotto luce UV. L'assemblaggio della camera viene eseguito all'interno della cappa coltura cellulare. La vite di sfiato della camera è liberamente impegnata nella presa d'aria alla base della cavità. Pre-riscaldata (37 ° C), mezzi di crescita freschi pipettato nella camera senza fare bolle. Quindi, una cellula-coltura vetrino viene raccolto, ed è posto sul tappo del pistone (cellule rivolti all'esterno). Le piccole viti che tengono sono serrati verso il basso sulla diapositiva per tenerlo in posizione. Il pistone con una cellula-coltura vetrino viene inserito un poco into della cavità della camera, e il gruppo è inclinato con lo sfiato essendo nel punto più alto. La vite di sfiato viene rimosso e il pistone viene spinto nella prima cavità costringendo le bolle d'aria, il liquido in eccesso. Un segno di riferimento o una maschera viene utilizzato come guida per garantire lo stesso volume di cultura media per ogni test. La dimensione assiale del supporto della camera è di circa 6 mm. Disinfettare la vite di sfiato e sostituirlo per rendere l'acqua camera di tenuta. La camera non dovesse perdere in questa carico statico, se lo fa, la pellicola Teflon deve essere sostituito o rinforzato. </li><li> A questo punto, il sistema bar Kolsky è resettato. La massa pesante viene spostato nella posizione originale e un bullone di bloccaggio sostituisce l'usato (rotto) uno. Inserire la nuova vite di bloccaggio con l'idraulica a circa 200 psi. Utilizzare il jack forbici per comprimere il pre-caricamento sezione della barra incidente fino ad una pressione di poco superiore al valore desiderato, e poi marcia indietro per innestare la frizione pienavite di Jack. L'acquisizione dei dati è ora in funzione. </li><li> L'assemblato camera di pressurizzazione cella è montata nel sistema. Esso è collocato in un blocco V supportato da laboratorio piccola forbice jack e allineato con le due barre. Ingrassare ogni interfaccia con uno strato di grasso leggero e strofinare le superfici intestatura insieme per eliminare eventuali vuoti d'aria tra i due. </li><li> Il test è ora pronto per procedere. Il bullone di bloccaggio pinza è costretto a rompere in fretta pompando il driver idraulico pinza. Il morsetto separerà e l'acquisizione dei dati deve visualizzare i risultati. La storia pressurizzazione cella è determinato dalle misurazioni del calibro bar trasmesso. Se la barra di trasmissione utilizzato è abbastanza lungo, questa dovrebbe essere solo dal primo disturbo al punto in cui le misurazioni mostrano una pressione negativa. La durata dell'impulso trasmesso può essere più breve impulso incidente se una bolla viene intrappolato. L'entità non può raggiungere quella dell'impulso incidente, ma dovrebbe avere una sufficiente long pianoro prima dello scarico. Altrimenti, sia una bolla d'aria grande nella camera stagna o un disallineamento tra il gruppo e un bar potrebbe essersi verificato. </li><li> La camera di pressurizzazione cella viene quindi rimosso e smontato all'interno della cappa coltura cellulare. La vite di sfiato viene rimosso e il pistone viene tirato libera della camera. La cellula-coltura vetrino viene prelevato dalla testa del pistone. </li></ol> 4. La valutazione del comportamento sotto pressione cellulare <ol><li> Dopo la pressurizzazione, le cellule possono essere ispezionati immediatamente o ulteriormente incubate per successivo esame. Con adeguati processi di funzionamento asettici, a più lungo termine post-incubazione è possibile. </li><li> Cellule in pressione può essere esaminato da tutte le tecniche di biologia molecolare e cellulare. In particolare per la pressurizzazione delle cellule neuronali, per studiare la fisiologia cellulare e molecolare in condizioni TBI, saggi di valutazione di pressione indotti cambiamenti nella crescita dei neuriti, il cambiamento dei microtubuli del citoscheletro, expre gene neuronalession, apoptosi, ecc, possono essere eseguite. Come campioni di cellule di controllo, cellule che sono coltivate stesso, mantenuto all'interno della camera di pressurizzazione per lo stesso periodo, ma non in pressione vengono utilizzati (cosiddetta, camera di controllo). </li><li> Per valutare i cambiamenti nella crescita dei neuriti, cellule di controllo pressione e la camera sono esaminati al microscopio ottico subito dopo la pressurizzazione e il 1 ° e 24 ore di post-incubazione. Un esempio di immagini di cellule neuronali sono riportati nella sezione "Rappresentante dei risultati" (Figura 2). La variazione di lunghezza dei neuriti può essere quantificato mediante colorazione immunofluorescente actina e analisi d'immagine. Cellule vengono fissate con 4% w / v soluzione di paraformaldeide, sciacquato con 0,05% v / v Tween-20 tampone di lavaggio, e permeabilizzate con v / v 0,1% Triton X-100 soluzione. Dopo il bloccaggio con un 1% w / v di albumina sierica bovina, le cellule vengono incubate con tetrametilrodamina isotiocianato (TRITC)-coniugato falloidina. Immagini immunofluorescenza delle cellule sono effettuate utilizzando un fluorescentemicroscopio e le lunghezze dei neuriti di cellule pressione e controllo vengono quantificati utilizzando il software ImageJ (NIH). </li><li> I neuriti possono essere identificati come assoni o dendriti. Per valutare le variazioni morfologiche assoni o dendriti, gli esperimenti descritti sopra possono essere ripetute utilizzando anticorpi specifici ciascuna struttura, cioè, neurofilamenti (NF) anticorpo per assoni e proteina associata ai microtubuli (MAP2) anticorpali per dendriti. </li><li> Microtubuli sono uno dei componenti chiave citoscheletrici di neuroni, e il danno ai microtubuli è stato usato come marcatore di danno neuronale. 2 microtubuli possono essere visualizzati utilizzando il immunofluorescently β-tubulina. Cellule vengono fissate dopo 0 e 24 h post-pressurizzazione, colorati con β-tubulina, e osservato al microscopio a fluorescenza. </li><li> Per valutare l'effetto di pressurizzazione impulsivo sull'espressione genica neuronale apoptotica, RNA totale viene estratto da cellule pressione e controllo. Genespressione e può essere esaminato eseguendo quantitativa RT-PCR o real-time RT-PCR, simile ai nostri protocolli pubblicati. 3 </li></ol> 5. Rappresentante dei risultati: <img src="/files/ftp_upload/2723/2723fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1. Un esempio di profilo di pressione applicata alle cellule all'interno della camera di pressurizzazione. L'apparato bar Kolsky genera successo 2 livello MPa, singolo impulso pressurizzazione tipo impulsivo con una durata di circa 0,7 ms. <img src="/files/ftp_upload/2723/2723fig2.jpg" alt="Figura 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 2"> Figura 2. Un esempio di risposta cellulare neuronale della pressurizzazione impulsivo. SH-SY5Y esposte a pressurizzazione impulsivo a 2 MPa mostra distinta neurite / assone rottura rispetto a cellule di controllo della camera. 6. Difficoltà e soluzioni <ol><li> Camera di tenuta è uno dei principali ostacoli da superare. È found che i dischi di grandi dimensioni con o-ring hanno un problema di scriccatura e maggiore attrito. Al fine di eliminare gli effetti di attrito, così come impedire sgorbiatura, un semplice metodo di nastratura pistone idraulico con nastro di teflon viene utilizzato. Questo risolve i problemi e produce livello di pressione desiderato e durata. </li><li> Sotto pressione il comportamento delle cellule neuronali, in particolare in sede di valutazione secondaria meccanismo di trauma cranico o di effetti a lungo termine, devono essere esaminati dopo un lungo tempo di post-incubazione. La cella contenente camera è esposta a potenziali condizioni non sterili mentre si sposta al bar Kolsky, pressurizzazione, e tornando alla cappa coltura cellulare. Con pre-sterilizzazione dei pezzi da camera e il funzionamento corretto per il montaggio / smontaggio della cellula-colta vetrino e la camera all'interno della cappa di coltura cellulare, a più lungo termine post-incubazione è possibile fino a diverse settimane. </li><li> La riproducibilità dei dati è un parametro importante per cellulari esperimenti di stimolazione meccanica. Per il nostro dispositivo, il reproducibility in risposta neuronale è determinato come desiderato profilo impulsivo pressurizzazione, sia sul livello di pressione e durata, si ottiene ripetutamente. Dal registriamo il profilo di pressione ottenuti per ogni pressurizzazione, i dati di risposta delle celle di profilo di pressione indesiderato può essere escluso manualmente in seguito. </li><li> Le fasi di pressurizzazione intero, compreso l'assemblaggio della camera, il trasferimento e montare nella barra Kolsky, pressurizzazione, il trasferimento-back, e la camera di smontaggio, in meno di 10 minuti. La slitta cella successiva coltivate può essere pressurizzata immediatamente dopo la pressurizzazione precedente. Così, il numero sufficiente di esperimenti di pressurizzazione può essere completato in modo efficiente. Il nostro set-up utilizza 18 millimetri di diametro coprioggetto. Un esperimento pressurizzazione non fornisce sufficienti proteine ​​per Western immunoblotting causa delle dimensioni del substrato (e in parte anche perché alcune delle cellule pressurizzati sono morti). Circa tre esperimenti di pressurizzazione ripetuti fornire quantità di proteine ​​necessaria per immunoblOtting. Ancora, la riproducibilità viene controllato ogni volta con il profilo di pressione. </li></ol>

<ol><li>Kolsky, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+investigation+of+mechanical+properties+of+materials+at+very+high+rates+of+loading%5BTitle%5D)+AND+%22Prec.+Phys.+Soc.+London%22%5BJournal%5D)">An investigation of mechanical properties of materials at very high rates of loading.</a> Prec. Phys. Soc. London. 62, 676-700 (1949).</li>
<li>Tang-Schomer, M. D., Patel, A. R., Baas, P. W., Smith, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanical+breaking+of+microtubules+in+axons+during+dynamic+stretch+injury+underlies+delayed+elasticity%2C+microtubule+disassembly%2C+and+axon+degeneration%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB.+J%22%5BJournal%5D)">Mechanical breaking of microtubules in axons during dynamic stretch injury underlies delayed elasticity, microtubule disassembly, and axon degeneration.</a> FASEB. J. 24, 1401-1410 (2010).</li>
<li>Lim, J. Y., Taylor, A. F., Li, Z., Vogler, E. A., Donahue, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrin+expression+and+osteopontin+regulation+in+human+fetal+osteoblastic+cells+mediated+by+substratum+surface+characteristics%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue.+Eng%22%5BJournal%5D)">Integrin expression and osteopontin regulation in human fetal osteoblastic cells mediated by substratum surface characteristics.</a> Tissue. Eng. 11, 19-29 (2005).</li>
<li>Chen, Y. C., Smith, D. H., Meaney, F. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+approaches+for+studying+blast-induced+traumatic+brain+injury%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurotrauma%22%5BJournal%5D)">In vitro approaches for studying blast-induced traumatic brain injury.</a> J. Neurotrauma. 26, 861-876 (2009).</li>
<li>Ling, G., Bandak, F., Armonda, R., Grant, G., Ecklund, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Explosive+blast+neurotrauma%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurotrauma%22%5BJournal%5D)">Explosive blast neurotrauma.</a> J. Neurotrauma. 26, 815-825 (2009).</li>
<li>Shepard, S. R., Ghajar, J. B. G., Giannuzzi, R., Kupferman, S., Hariri, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluid+percussion+barotrauma+chamber%3A+a+new+in+vitro+model+for+traumatic+brain+injury%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Surg.+Res%22%5BJournal%5D)">Fluid percussion barotrauma chamber: a new in vitro model for traumatic brain injury.</a> J. Surg. Res. 51, 417-424 (1991).</li>
<li>VandeVord, P. J., Leung, L. Y., Hardy, W., Mason, M., Yang, K. H., King, I. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Up-regulation+of+reactivity+and+survival+genes+in+astrocytes+after+exposure+to+short+duration+overpressure%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosci.+Lett%22%5BJournal%5D)">Up-regulation of reactivity and survival genes in astrocytes after exposure to short duration overpressure.</a> Neurosci. Lett. 434, 247-252 (2008).</li>
<li>Huang, H., Feng, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+study+of+the+dynamic+tribological+response+of+closed+fracture+surface+pairs+by+Kolsky-bar+compression-shear+experiment%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Solids.+Struct%22%5BJournal%5D)">A study of the dynamic tribological response of closed fracture surface pairs by Kolsky-bar compression-shear experiment.</a> Int. J. Solids. Struct. 41, 2821-2835 (2004).</li>
<li>Song, B., Chen, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Split+Hopkinson+pressure+bar+techniques+for+characterizing+soft+materials%5BTitle%5D)+AND+%22Lat.+Am.+J.+Solids.+Struct%22%5BJournal%5D)">Split Hopkinson pressure bar techniques for characterizing soft materials.</a> Lat. Am. J. Solids. Struct. 2, 113-152 (2005).</li>
</ol>

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

Molti in vitro tecniche sperimentali sono stati tentati per lo studio delle cellule danno cerebrale in condizioni TBI. Tra questi neuroni / astrociti stretching, il flusso indotto shear stress, calo di peso, lacerazione stilo, laser transezione, litotripsia, ecc 4,5 E &#39;stato ipotizzato che la breve durata sovrapressione è un fattore dominante fisica per trauma cranico. 6,7 Specialmente , l&#39;onda d&#39;urto dell&#39;esplosione TBI ha una durata di impulso di un ordine di millisecondi. 4 Sulla base di questa ipotesi ed osservazione, camera barometro capace di pressurizzazione transitoria è stato sviluppato e utilizzato per valutare il comportamento delle cellule cerebrali in condizioni TBI. Per esempio, nella camera di fluido percussioni barotrauma un impulso di pressione con 20-30 ms lunga durata ed una pressione di picco fino a 0,5 MPa stato utilizzato per esaminare il comportamento umano cellule gliali sotto TBI. 6 Recentemente, VandeVord et al. 7 metallo usato palla camera barometro colpisce di esaminare la cella astrociticomportamento sotto TBI ma la sfera di metallo che colpisce prodotti impulsi di pressione più. In questo studio, abbiamo sviluppato un nuovo dispositivo di pressurizzazione cella che genera un solo impulso di pressurizzazione tipo impulsivo. Il dispositivo è stato sviluppato in base barra Kolsky set-up, che è stato usato come materiale di un apparato di test nei nostri 8 e di altri studi. 1,9 La barra Kolsky di funzionalità di test materiale a regime di carico molto elevato è stato modificato per essere in grado di applicare impulso singolo sovrapressione tipo alle cellule coltivate all&#39;interno della camera di pressurizzazione (Figura 1). Potremmo controllare con successo l&#39;ampiezza e la durata della sovrapressione impulsivo. Come una risposta cellulare rappresentante, abbiamo dimostrato che a 2 MPa cellule neuronali SH-SY5Y visualizzare neurite significativa e perdita assonale rispetto alle cellule non pressurizzate camera di controllo. In conclusione, abbiamo sviluppato un nuovo apparato di pressurizzazione impulsivo cella utilizzando un apposito Kolskydispositivo di bar e dimostrato il suo potenziale utilizzo nelle indagini risposta neuronale delle cellule in condizioni TBI. Abbiamo anche notare che questa tecnica è molto versatile in qualsiasi tipo di cellule può essere esposto a pressioni impulsive a vari livelli e la durata. Pertanto, il dispositivo può essere utilizzato per studiare l&#39;impulsivo pressione indotta comportamento cellulare meccanotrasduzione, non solo per ferire le cellule ma anche per stimolare le cellule positivamente nella loro funzione e determinazione fato.

<ul><li> SH-SY5Y (ATCC, CRL-2266) cellule di neuroblastoma umano </li><li> 18 mm di diametro in vetro coprioggetti </li><li> Mezzi di coltura cellulare: DMEM, 10% di siero fetale bovino, 1% di penicillina-streptomicina </li><li> L&#39;acido retinoico (10 micron) per indurre la neurogenesi </li><li> Kolsky bar dispositivo di pressurizzazione impulsivo </li><li> Pistone-cilindro cella camera di pressurizzazione </li><li> Viti in acciaio inox per il fissaggio coprioggetto cellule coltivate sul pistone </li><li> Grasso per interfacce tra cellule da camera e Kolsky bar </li><li> Forniture generali di biologia molecolare per la valutazione della risposta delle cellule della pressurizzazione (fissativo, anticorpi, colorante fluorescente, forniture PCR, ecc) </li></ul>

pressurizzazione impulsivo delle cellule neuronali per lo studio traumatica lesione cerebrale

Impulsive Pressurization of Neuronal Cells for Traumatic Brain Injury Study

Un romanzo impulsivo esperimento pressurizzazione cella è stato sviluppato utilizzando un dispositivo bar Kolsky per indagare esplosione indotta da lesione traumatica cerebrale (TBI). Dimostriamo in questo articolo video come perfetto TBI-rilevante pressurizzazione impulsivo viene applicata alle cellule neuronali in vitro. Questo è ottenuto utilizzando ben controllati impulso di pressione creata da un dispositivo specializzato Kolsky bar, con la storia completa pressione all&#39;interno della camera di pressurizzazione cella registrata. Pressurizzati cellule neuronali sono controllati immediatamente dopo la pressurizzazione, o ulteriormente incubato per esaminare a lungo termine effetti di pressurizzazione impulsivo su neurite / assonale conseguenza, l&#39;espressione genica neuronale, apoptosi, ecc abbiamo osservato che la pressurizzazione impulsivo a circa 2 MPa induce distinta relativa perdita dei neuriti alle cellule non pressurizzate. La nostra tecnica prevede un nuovo metodo per studiare i meccanismi molecolari / cellulari di esplosione TBI, con pressurizzazione impulsivo delle cellule cerebrali a ben controllati prEssure ampiezza e la durata.

Un romanzo impulsivo esperimento pressurizzazione cella è stato sviluppato utilizzando un dispositivo bar Kolsky di investigare i meccanismi molecolari / cellulari di blast-indotta lesione cerebrale traumatica.

Pressurizzazione impulsivo delle cellule neuronali per lo studio traumatica lesione cerebrale

È stato sviluppato un nuovo esperimento di pressurizzazione impulsiva di cellule utilizzando un dispositivo a barra di Kolsky per indagare il trauma cranico (TBI) indotto da esplosione. ...

L'obiettivo generale di questa procedura è somministrare e osservare una pressurizzazione impulsiva di cellule cerebrali coltivate per lo studio del trauma cerebrale. Questo viene realizzato innanzitutto inducendo la differenziazione neuronale di cellule coltivate mediante acido retinoico. Successivamente, le cellule neuronali vengono posizionate nel dispositivo di pressurizzazione cellulare basato sul ksky bar ed esposte a una pressione impulsiva di intensità e durata rilevanti per il trauma cerebrale indotto da esplosione.Infine, le cellule vengono sottoposte a saggi di biologia molecolare per valutare i danni cellulari e i possibili meccanismi di lesione cerebrale traumatica. I risultati dell'ispezione al microscopio mostrano morte cellulare neuronale e perdita strutturale degli assoni neuritici in seguito a pressurizzazione impulsiva di due megapascal di intensità e durata di 0,7 millisecondi. Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti, come la percussione fluidica, è l'assenza di fasi di pressione negativa e un controllo preciso della durata temporale.Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali nel campo del trauma cranico (TBI), come la soglia di morte cellulare neuronale o di lesione in funzione della pressione impulsiva, dell'ampiezza, della durata e della forma del carico. Sebbene finora questo metodo sia stato utilizzato nel nostro gruppo per studiare il TBI indotto da esplosione, può essere applicato anche ad altri tipi di trauma cranico, come il TBI indotto da impatto. La procedura sarà dimostrata da Matthew, uno studente laureato del laboratorio della Professoressa Chen fang, e da li ha, un tecnico del mio laboratorio.Questo esperimento utilizza un set Ksky configurato come apparecchio per la pressurizzazione cellulare. L'apparecchio è costituito da due barre in lega di alluminio lunghe sei metri, sospese mediante cuscinetti in ottone allineati, con una camera per la pressurizzazione cellulare in vitro. Posta tra le barre, la camera per la pressurizzazione cellulare è composta da un cilindro a pistone.Il cilindro presenta un piccolo foro filettato alla base della cavità, che durante l'installazione del campione cellulare permette lo sfiato dell'aria e del liquido in eccesso. Il pistone è realizzato con lo stesso tubo della barra ed è avvolto con due o tre strati di nastro in teflon. Il tappo terminale fissa le lamelle di vetro con due piccole viti in acciaio inossidabile.Questa dimostrazione utilizza cellule di neuroblastoma umano SH-SY5Y. Tuttavia, il protocollo è applicabile a molte colture di modelli cellulari. Le cellule vengono seminate su coprivetri di 18 millimetri di diametro a una densità di 3000 cellule per centimetro quadrato.In DMEM supplementato, durante l'incubazione le cellule vengono indotte a differenziarsi aggiungendo all'ambiente di coltura acido retinoico a 10 micromolari per sette giorni, con cambio del mezzo ogni due giorni. Nel settimo giorno, le cellule mostrano una ben sviluppata struttura assonale dei neuriti ed sono pronte per essere sottoposte a pressione. Sterilizzare tutte le parti della camera di pressurizzazione mediante autoclave e conservarle sotto luce UV durante l'assemblaggio della camera.In una cappa colturale, assicurarsi che la vite di ventilazione nella camera sia avvitata in modo lento al foro di aerazione. Alla base della cavità, riempire la camera con mezzo di crescita appena preparato e tiepido. Quindi avvitare un vetrino colturale in vetro sul coperchio del pistone, con le cellule rivolte verso l'esterno, e inserire con attenzione il pistone all'interno della cavità della camera.Rimuovere la vite di sfiato, inclinare lo sfiato verso l'alto e spingere il pistone nella camera fino a una linea di riferimento precedentemente determinata. Ciò lascia circa sei millimetri di profondità del liquido all'interno della camera di pressurizzazione della cella. Evitare di introdurre bolle d'aria, sanificare la vite di sfiato e reinserirla per rendere la camera stagna all'acqua.La camera non deve presentare perdite sotto il carico statico. Reimpostare il sistema della barra Ksky. Riportare la massa pesante alla sua posizione originale e sostituire il bullone di bloccaggio.Il bullone di bloccaggio esercita una forza di serraggio che impedisce il movimento del barra incidente finché i perni non vengono spezzati. Innestare il nuovo bullone di bloccaggio con il martinetto idraulico fino a circa 200 PS.I utilizzare il martinetto a forbice per comprimere la sezione di precarico della barra incidente a una pressione leggermente superiore al valore desiderato, quindi allentarla per innestare completamente l'attrito della vite JAK. A questo punto impostare l'acquisizione dati poiché la pressurizzazione avviene in circa un millisecondo.Impostare una frequenza di campionamento di un megahertz utilizzando estensimetri da 2000 ohm in un circuito a ponte di Wheatstone. La tensione deve essere impostata a 45 volt sulla barra trasmessa. Montare la camera della cella con il pistone rivolto verso la barra trasmessa.Posizionare la camera cellulare in un blocco a V sostenuto dal cavalletto per forbici da laboratorio e allineato con le due barre. Ungere leggermente ogni interfaccia ed eliminare qualsiasi aria tra le superfici in contatto strofinandole delicatamente insieme. Ora il sistema è pronto.Armare l'acquisizione dei dati ed eseguire il test pompando rapidamente il dispositivo idraulico della pinza. Questo provoca la rottura del bullone di bloccaggio, determinando la separazione della pinza e la trasmissione di un'onda di pressione alle cellule. Dopo il test, rimuovere la lamella dalla camera in una cappa da coltura e procedere con la valutazione del comportamento cellulare.Con esperienza, l'apparato può essere utilizzato per pressurizzare circa nove vetrini con colture cellulari all'ora. Durante l'analisi del segnale, all'inizio del tracciato trasmesso possono comparire errori dovuti a bolle d'aria, tuttavia in questa dimostrazione non sono presenti.Se la barra di trasmissione è sufficientemente lunga, i dati più importanti dovrebbero iniziare con la prima perturbazione e terminare dove le misurazioni mostrano una pressione negativa; questa lettura di tensione è proporzionale allo sforzo subito dalle cellule mediante l'analisi con estensimetri. La durata dell'impulso trasmesso può essere più breve rispetto all'impulso incidente. Se una piccola bolla è intrappolata nel fluido all'interno della camera di pressurizzazione delle cellule, l'ampiezza dell'impulso trasmesso potrebbe non superare quella dell'impulso incidente, ma dovrebbe presentare un plateau sufficientemente lungo prima dello scarico.In caso contrario, o viene intrappolata una grande bolla d'aria nella camera sigillata oppure l'assemblaggio e la barra sono malallineati. Dopo la pressurizzazione, le cellule possono essere esaminate immediatamente oppure ulteriormente incubate per analisi successive. Confrontare le cellule pressurizzate con le cellule di controllo della camera, trattate in modo identico ma non sottoposte a pressurizzazione, per valutare le variazioni nella lunghezza dei neuriti mediante microscopia ottica in diversi punti temporali successivi all'incubazione.La colorazione immunofluorescente dell'actina può essere utilizzata per valutare i cambiamenti del citoscheletro. Inoltre, l'anticorpo per la proteina associata ai microtubuli due, MAP due, può essere impiegato per visualizzare le modifiche in uno dei principali marcatori neuronali.Per valutare l'effetto della pressurizzazione impulsiva sull'espressione genica neuronale e apoptotica, utilizzare se necessario tecniche standard di biologia molecolare come la R-T-P-C-R. È possibile raccogliere lisati cellulari sufficienti per l'immunoblotting da diversi campioni cellulari sottoposti a pressione identica. In questo esempio, il profilo di pressurizzazione, ottenuto mediante l'apparato ksky bar, ha applicato con successo una singola pressione impulsiva di livello pari a due megapascal con una durata di circa 0,7 millisecondi alle cellule neuronali in coltura, come mostrato nelle immagini al microscopio ottico. Le cellule neuronali umane SHSY5Y, sottoposte a pressione impulsiva di due megapascal, mostrano un evidente deterioramento dei neuriti e degli assoni rispetto alle cellule di controllo non depressurate.Quando si esegue questa procedura, è sempre necessario tenere la camera di pressurizzazione del fluido in questo modo e mai in quest'altro, poiché ciò sottoporrebbe le cellule a una pressione negativa dopo il loro sviluppo. Questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo delle neuroscienze per esplorare il meccanismo cellulare del trauma cranico in condizioni controllate di pressurizzazione prostatica. Ringraziamo il centro dell'esercito UNL per la meccanica del trauma per il supporto finanziario.

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Laterale fluido percussioni (LFP), un modello stabilito di lesioni cerebrali traumatiche nei topi, è dimostrato. LFP soddisfa tre criteri principali per i modelli animali: rilevanza validità, l'affidabilità e la clinica. La procedura, che consiste di craniotomia chirurgica, la fissazione del mozzo seguita da induzione di lesioni, con conseguente lesioni focali e diffuse, è descritto.

Fluido laterale Percussioni: Modello delle lesioni cerebrali traumatiche nei topi

Questo video mostra la procedura per indurre una lesione cerebrale traumatica a cranio aperto in un topo praticando un'incisione del cranio sulla linea mediana, perforando il cranio e rimuovendo il lembo osseo per esporre la corteccia cerebrale e applicando un'alta pressione per indurre un trauma. La ferita viene quindi suturata per preparare il modello murino per gli esperimenti successivi.

Generazione di un modello murino di lesione cerebrale traumatica utilizzando una sonda impattante

In vitro modelli di lesioni cerebrali traumatiche sono state sviluppate per riprodurre in deformazione del cervello in vivo. Lesioni Stretch indotta è stato impiegato per gli astrociti, neuroni, cellule gliali, aortica, e le cellule endoteliali cerebrali. Tuttavia, il nostro sistema utilizza una barriera emato-encefalica (BBB), modello che possiede le proprietà che costituiscono un modello legittimo della BBB di stabilire un modello in vitro TBI.

Stretch in microvascolari cerebrali cellule endoteliali (CEND) come<em&gt; In Vitro</em&gt; Trauma cranico modello della barriera ematoencefalica

Le lesioni cerebrali traumatiche (TBI) rimangono un serio problema di salute. Utilizzando il modello di chirurgia a impatto corticale controllato, possono essere eseguite ricerche sugli effetti del trauma cranico e sui possibili metodi di trattamento.

Controllata corticale modello Impact per trauma cranico

Questo articolo descrive un nuovo modello di ferita di cervello traumatica esplosione primaria. Un tubo di aria compressa guidato d'urto viene utilizzato per esporre in vitro culture hippocampal fetta di mouse per una singola onda d'urto. Si tratta di un protocollo semplice e rapido, generando una lesione del tessuto di cervello riproducibile con un throughput elevato.

Un modello di romanzo In Vitro di ferita di cervello traumatica di scoppio

Qui, presentiamo un protocollo per descrivere i metodi per ex vivo determinazione di reattività vascolare segue una ferita di cervello traumatica esplosione primaria (bTBI) utilizzando segmenti di isolato, pressurizzato, roditore arterioso cerebrale centrale (MCA). bTBI induzione avviene utilizzando un tubo d'urto, noto anche come un dispositivo avanzato simulatore di Blast (ABS).

Effetti del Neurotrauma indotta da Blast il roditore pressurizzato Middle arterie cerebrali

Qui presentiamo un protocollo per indurre grave TBI con il modello di lesione a percussione fluida laterale (FPI) in adulti, ratti Wistar maschi. Dimostriamo anche l'uso di un sistema di telemetria wireless per raccogliere registrazioni video-EEG continue e monitorare le scariche epilettifori coerenti con l'epileptogenesi post-traumatica.

Uso di un sistema video-eEG wireless per monitorare le scariche epilettifore a seguito di lesioni cerebrali traumatiche indotte da liquido-percussioni laterali

Qui descriviamo un protocollo per l'induzione di lesioni cerebrali traumatiche murine attraverso un impatto corticale controllato a testa aperta.

Modello Murine di impatto corticale controllato per l'induzione di lesioni cerebrali traumatiche

Presentiamo qui un protocollo di un modello di onda d'urto per i roditori per studiare gli effetti neurobiologici e fisiopatologici di lesioni cerebrali traumatiche da lievi a moderate. Abbiamo stabilito una configurazione da banco a gas dotata di sensori di pressione che consentono una generazione affidabile e riproducibile di lesioni cerebrali traumatiche da lievi a moderate indotte da esplosioni.

Modello di onda d'esplosione a bassa intensità per la valutazione preclinica della lesione cerebrale traumatica lieve a testa chiusa nei roditori

Qui vengono presentati i metodi per produrre esposizioni ripetute a esplosioni a bassa intensità utilizzando i topi.

Modellazione dell'esposizione altamente ripetitiva a basse esplosioni nei topi

Questo protocollo descrive un sistema personalizzato di sovrapressione dell'aria progettato per indurre lesioni del sistema nervoso centrale (SNC) a sistema chiuso nei topi, inclusi traumi oculari, cerebrali e del midollo spinale. L'obiettivo di questo protocollo è quello di fornire un quadro di riferimento per i ricercatori per adattare ed espandere facilmente il sistema per i loro studi unici sul trauma del SNC.

Sistema per lesioni focali del sistema nervoso centrale a sistema chiuso

Scopri la pressurizzazione impulsiva delle cellule neuronali per studiare i meccanismi del trauma cranico usando il dispositivo Kolsky bar. Questo metodo consente di controllare pressione e durata per analizzare la morte cellulare e i danni strutturali.

Pressurizzazione impulsivo delle cellule neuronali per lo studio traumatica lesione cerebrale

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