Name: Axon Stretch groei: de Mechanotransductie van neuronale groei (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-08-10T12:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 46 s
Description: Leer axon stretch groei voor weefselengineering met een bioreactor die trekkracht toepast op neuronen. Deze methode bereikt groeisnelheden tot 10 mm per dag en helpt onderzoekers zenuwontwikkeling en potentiële behandelingen voor zenuwletsel te bestuderen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Dit werk werd gefinancierd door NSF CARRIERE cbet-0747615. De auteurs willen Drs bedanken. Douglas H. Smith en David F. Meaney voor hun mentorschap en ondersteuning.

1. Overzicht van de Axon Stretch Growth Bioreactor System <ol><li> Twee overheersende benaderingen zijn gebruikt om experimentele krachten van toepassing zijn op neuronen. In de eerste benadering, zijn krachten toegepast op de gehele neuron (Lu, Franze et al., 2006;. Chetta, Kye et al. 2010;.. Lindqvist, Liu et al. 2010). In de tweede benadering, zijn krachten direct op het axon door te trekken op de groei kegel. Met behulp van glas naalden, heeft deze laatste benadering is gebruikt om het model de vorming van nieuwe axon (Bernal, Pullarkat et al. 2007;. O'Toole, Lamoureux et al. 2008;.. Lamoureux, Heidemann et al. 2010), te dwingen drempels voor rek te identificeren en retractie (Dennerll, Lamoureux et al. 1989;. Zheng, Lamoureux et al. 1991;.. Lamoureux, Zheng et al. 1992), naar neurotransmitter clustering en te analyseren in axon terminals (Siechen, Yang et al. 2009.). Een unieke tissue engineering uitbreiding van deze methode is ontwikkeld om grote zenuw produceren construeert met behulp van een geautomatiseerd Axon Stretch Growth (ASG) bioreactor systeem (Iwata, Browne et al., 2006;.. Pfister, Iwata et al. 2006). Onlangs ontwikkelden we een geminiaturiseerde versie van de bioreactor systeem om te studeren ASG microscopisch in real time (Loverde, Ozoka et al.. 2011). Hier hebben we detail de 9-daagse protocol (tabel 1) we momenteel gebruiken om bioreactoren voor te bereiden en ASG routinematig uit te voeren. </li><li> Overall Werking: Het ASG bioreactor systeem bestaat uit drie hoofdcomponenten, 1) een bioreactor kamer met onafhankelijke rijstroken (langwerpige putten) waar neuronen worden gekweekt en uitgerekt, 2) een geautomatiseerde lineaire beweging tafel om stretching krachten en 3) een stappenmotor toe te passen aandrijving controller met software op te rekken groei (figuur 1) te controleren. </li><li> In het kort werd de fabricage van bioreactor prototypes uitgevoerd in een werkplaats met behulp van een verticale freesmachine (Bridgeport, Elmira, NY). Voor biocompatibiliteit, het gemak van sterilisatie en duurzaamheid, zijn de interne bioreactor componenten vervaardigd uit 3 / 8 "polyetheretherketone (PEEK). Transparant polycarbonaat werd gebruikt voor deksels om voor licht microscopie en bekijken van culturen. Corrosiebestendig 316 roestvrij stalen schroeven en de hardware te voltooien de montage (McMaster-Carr, Elmhurst, IL). </li><li> De bioreactor kamer bestaat uit een frame dat zich uitstrekt drie rijstroken, een instelbare sleep-blok dat cellen over de rijstroken manipuleert, en uitstekende slepen staven vormen voor externe manipulatie (figuur 2). Neuronale culturen zijn uitgeplaat op wegwerp Aclar slepen cultuur substraten gesteund door het trekkende blok (figuren 2 &amp; 3). Een wegwerp dekglaasje stationair ondergrond hecht aan de onderkant van het frame en stretching omvat alle drie rijstroken. Voorafgaand aan stretching, moet plated neuronen te breiden axonale processen van het trekkende substraat op de stationaire substraat via groeikegel extensie. De bevolking van axonen die brug de substraten vervolgens zal strekken ondergaan door het beheersen van verplaatsing van het trekkende blok. </li><li> De geautomatiseerde lineaire beweging tabel bestaat uit een stappenmotor (HT23-397, Applied Motion Products, Watsonville, CA) en de lineaire beweging tafel (MIPS-2-10-1,0 mm, Servo Systems, Monteville, NJ), gemonteerd op een delrin alignment tafel . De bioreactor kamer zit in de tabel parallel aan de lineaire beweging tafel. Het trekkende staven dat zich uitstrekt van de bioreactor kamer zijn bevestigd aan de lineaire beweging tafel met behulp van een adapter. </li><li> De stap aandrijving controller (Si 2035, Applied Motion Products) is geprogrammeerd met behulp van de meegeleverde Si programmeur software om manipulatie van het trekkende substraten te controleren. Axonale stretch wordt toegepast op een stapsgewijze manier door het nemen van een serie van kleine verplaatsing stappen afstand van elkaar door de verblijftijden (Pfister, Iwata et al., 2004;.. Pfister, Iwata et al. 2006). Dit computergestuurde systeem biedt de mogelijkheid om aangepaste profielen voor ASG, en is essentieel voor continue experimenten gedurende enkele dagen tot weken. </li></ol> 2. Voorbereiding van de Bioreactor Kamer <ol><li> Bereid de wegwerp sleep-en stationaire cultuur neuronale substraten voor cultuur: <ol><li> Slepen cultuur substraten worden gesneden van 8,5 "x 11" vellen Aclar film (33C 2,0 mil, Structure Probe, West Chester, PA). Met behulp van een scherp mes de substraten teruggebracht tot ongeveer 0,5 x 2,5 cm, of iets korter dan de breedte van de rijstroken ten minste 1-2mm speling laten aan beide kanten. </li><li> Licht zand de onderste 1 / 3 van het trekkende cultuur substraten aan beide zijden met fijn schuurpapier korrel 1200 (McMaster Carr). Schuren van het trekkende substraten faciliteert groei van axonen van het trekkende substraten op het dekglaasje stationaire substraat. </li><li> Snijd een 5 x 7cm stuk Aclar of gebruik een nummer 1 glas dekglaasje om te dienen als de stationaire substraat (# 4865-1, Brain Research Labs, Newton, MA). </li><li> Schoon ee cultuur substraten met een verdunde oplossing Alconox en grondig spoelen met gezuiverde dH 2 O. </li><li> Steriliseer de cultuur substraten door middel van onderdompeling in 70% ethanol gedurende 30 minuten. Laat de substraten te droge lucht in een steriele cultuur kap. </li></ol></li><li> Reinig de bioreactor kamer met verdund Alconox en autoclaaf gesteriliseerd in een autoclaaf container. Direct na het autoclaveren, over te dragen aan een steriele kap en aan de lucht laten drogen. </li><li> Te vervolgen binnen de steriele kap, lijm de cultuur substraten aan de bioreactor met behulp van Silicon RTV (Dow Corning # 732, McMaster Carr) en steriele katoen getipte swabs (McMaster Carr): <ol><li> Met het trekkende blok benen in hun volle rechtop, lijm het trekkende cultuur substraten op de trekhaak te blokkeren benen bij de niet-geschuurde gedeelte. Vermijd contact met de geschuurde oppervlak cultuur. </li><li> Lijm de stationaire cultuur substraat op de bodem van de bioreactor kamer. </li><li> Verwijder overtollige lijm en luchtzakken door zachtjes indrukken van een droog wattenstaafje tegen de gelijmde substraten. </li><li> Sinds Siliconen RTV loogt azijnzuur dat giftig is voor neuronen, is de bioreactor links naar onder UV-licht drogen binnen de kap voor twee volle dagen voorafgaand aan de introductie van neuronale culturen. </li></ol></li><li> Hoe lager de slepen blok benen een 2-3mm overlap tussen de uiteinden van de geschuurde slepen substraten en de stationaire substraat te bereiken. Cruciale aandacht moet worden besteed aan de grootte van de overlap, als het te groot is, de uiteinden van het trekkende substraten kan uit afleiden van de stationaire substraat, vermindering van het aantal axonen die de overlap (figuur 3) span. </li><li> Plaats de sleep-blok aan de start positie, met het trekkende staven teruggetrokken in de bioreactor. Draai de immobilisatie schroeven om beweging van het trekkende staven voorafgaand voorkomen om de groei te rekken. </li></ol> 3. Neuronale Culturen <ol><li> Pool 1 ml van 10 ug / ml hoog moleculair gewicht poly-D-lysine (cat # 354210, BD, Bedford, MA) in serum-vrije media in de ondergrond raakvlak gebied van elke baan. Laat de oplossing ongestoord houden gedurende 1 uur bij kamertemperatuur. Spoel voorzichtig 3x met dH 2 O, gevolgd door een laatste spoelbeurt met cultuur media. Pipetteren moet worden uitgevoerd aan de achterzijde van de rijstroken, het verst van de substraat-interface. </li><li> Isoleer achterwortelganglia explantaten (DRG) van een E16 rat pup. Met behulp van een stereomicroscoop, verdun het explantaten in druppels met behulp van petrischalen. Verzamel 3-4 explantaten met behulp van een 100 ul pipet en de plaat op de rand van de geschuurde slepen cultuur substraat. Zorg moet worden genomen om het bord van de explantaten aan de rand van het trekkende ondergrond met behulp van een kleine plas media. Tot 1 ml van de cultuur media per rijstrook is voldoende om verdamping te voorkomen gedurende enkele uren, terwijl het beperken van beweging van de explantaten. Media formulering: Neurobasal met B-27 + 0,5 mm L-Glutamine (Invitrogen, Carlsbad, CA), 1% FBS-HI (Hyclone, Waltham, MA), 2,5 g / L D-Glucose (G-7528, Sigma, St . Louis, MO), 20ng/mL NGF (13290-010, Invitrogen) en 20 uM FDU + 20 uM Uridine mitotische remmers (F-0503, U-3003, Sigma). </li><li> Bevestig het deksel en breng de bioreactor naar een incubator voor een uur of tot cellen hechten. </li><li> Vul de bioreactor met cultuur media op het punt verste de explantaten om losraken te voorkomen. Incubeer de bioreactor voor een minimum van vijf dagen, terwijl neuronen uit te breiden axonale processen op de stationaire substraat. </li></ol> 4. Axon Stretch Groei <ol><li> De bioreactor ondergaat laatste voorbereiding procedures in een steriel kap: <ol><li> Vul reservoirs binnen de bioreactor met fosfaat gebufferde zoutoplossing om de kamer en beperken de verdamping van de cultuur media bevochtigen. In ons systeem, de uitgeholde behuizing muren dienen als reservoirs. Als alternatief kan petrischaaltje deksels worden geplaatst aan weerszijden van het trekkende blok boven op de cultuur van rijstroken. </li><li> Vervang de cultuur media en vul de rijstroken van de capaciteit. Pipetteren moet worden uitgevoerd aan de achterzijde van de rijstroken, het verst van de substraat-interface. </li></ol></li><li> Plaats de bioreactor in de geautomatiseerde lineaire beweging tafel. Als het experiment moet worden uitgevoerd binnen een incubator, mag het niet worden bevochtigd vanwege mogelijke corrosie van de geautomatiseerde lineaire beweging tafel. </li><li> Bevestig het trekkende staaf-adapter op de trekhaak staven. </li><li> Met behulp van Si Programmer software jog de fase van de lineaire beweging tafel aan te sluiten bij het trekkende roede adapter en het bevestigen aan het podium. Voor het gemak, voor te bereiden Si Programmeur sequenties van te voren om het podium te manipuleren in specifieke stappen. </li><li> Draai de immobilisatie schroeven op de bioreactor kamer voor het vrije verkeer van het trekkende blok mogelijk te maken. </li><li> Stretch wordt toegepast in een stapsgewijs door het initiëren van een serie van kleine verplaatsing stappen afstand van elkaar door de verblijftijden (Pfister, Iwata et al.. 2006). Onze paradigma begint met het nemen van 2 micrometer stappen per 172 seconden,resulterend in een netto-1mm strekken zich uit over 24 uur. Na een dag, kan het traject snelheid opgevoerd worden door verhoging van de verplaatsing of het verminderen van de dwell time (tabel 2). </li><li> Zodra ASG is gestart, zijn media veranderingen meestal niet nodig. Na verloop van tijd echter, cultuur media wordt over het algemeen zuur en is duidelijk door een verandering in de geelachtige kleur. Als verdere experimenten nodig is, is oude media nooit helemaal leeg, maar in plaats daarvan slechts gedeeltelijk gewijzigd om trauma's te minimaliseren aan drijvende axonen. </li></ol> 5. Representatieve resultaten: Axonale processen kunnen ondergaan opvallend snelle en robuuste stretch groei. In eerste instantie het proces begint met een periode van trage rek (≤ 1mm/day) dat bestaat uit kleine, onregelmatige verplaatsingen. Binnen de eerste 24 uur na stretching, mechanotransductie van neuronale groei paden treedt, waarbij neuronen beginnen naast de axon cilinder. Binnen de 24 uur van continue ASG, axonen vertonen een toenemende tolerantie voor een grotere en meer frequente verplaatsingen. In het algemeen kan axonen bestand tegen een verhoging van de rek snelheid van 1mm/day iedere 12-24 uur (Pfister, Iwata et al., 2004;. Pfister, Bonislawski et al., 2006;.. Pfister, Iwata et al. 2006). Het verhogen van de stretch rate te snel, kan echter leiden tot een snellere groei van axonen te selecteren, maar zal ook leiden tot pathologische occlusie dat afsluiting veroorzaakt. Stretch groeiende axonen hebben de neiging om bundels vormen, die lijkt op de architectuur van bundels. Gebruik te maken van de huidige protocollen, de centrale, stretch gegroeid deel van de axon bundels hebben geen verklevingen aan de cultuur substraat. Alleen de in eerste instantie aangehouden, proximale en distale segmenten van stretch groeiende axonen gehecht blijven aan de cultuur substraten. Dienovereenkomstig, het centrale gedeelte van stretch gegroeid axonen zweven vrij, en gevoelig zijn voor verstoring gevolge van het behandelen. Om verschillende redenen kunnen sommige axonen niet groeien in de toegepaste stretch tarief. Bijvoorbeeld, een DRG neuron met twee axonale processen, die beide ondergaan stretch, misschien niet in staat zijn om voldoende eiwit te vertalen en op de toegepaste tarief stuk groeien. Axonen, die niet geschikt voor de toegepaste stretch zullen dunne volgende effect Poisson's. Latere rekken zal leiden tot occlusie van de axonen, remmen assemblage, wat leidt tot pathologische verbroken. Het merendeel van de axonen, zijn echter in staat om te ondergaan ASG succesvol en slechts een klein percentage van de axonen ondergaan deze snoeien-achtig proces. <img alt="Figuur 1" src="/files/ftp_upload/2753/2753fig1.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 1"> Figuur 1. Axon Stretch groei Bioreactor System. (A) Bioreactor cultuur kamer &amp; Automated lineaire beweging tafel, (B) Stap motor drive controller en Si Programming software. <img alt="Figuur 2" src="/files/ftp_upload/2753/2753fig2.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 2"> Figuur 2. Bioreactor Cultuur Kamer. Deze cartoon toont de bioreactor kamer van de top met verwijderde het deksel. De positie van het trekkende blok weerspiegelt het eindstadium van de axon stretch groei. Stretch uitgegroeid axonen kan gezien worden in bundels binnen de cultuur rijstroken. <img alt="Figuur 3" src="/files/ftp_upload/2753/2753fig3.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 3"> Figuur 3. Voedingssubstraat Plating Interface. Deze cartoon toont de componenten van het trekkende mechanisme in elke baan van de bioreactor van zijaanzicht. (Top) De correcte overlap van het trekkende en stationaire cultuur substraten. (Onder) Overmatige overlap van het trekkende en stationaire substraten zorgt ervoor dat de tip van het trekkende substraat te krullen. Film 1. Bevestigen van Cultuur Substraten voor Bioreactor Kamer. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/2753/movie1.mov">Klik hier om video te bekijken</a> Movie 2. Plating van DRG Explantaten op Slepen Substrates. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/2753/movie2.mov">Klik hier om video te bekijken</a> Movie 3. SiProgrammer gebruik. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/2753/movie3.mov">Klik hier om video te bekijken</a> Movie 4. Groeikegel Uitbreiding op Stationaire Ondergrond. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/2753/movie4.mov">Klik hier om video te bekijken</a> Movie 5. Axon Stretch Groei. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/2753/movie5.mov">Klik hier om video te bekijken</a> <table border="1"><tbody><tr><td> Dag </td><td> Stap </td></tr><tr><td> 1 </td><td> Sterilisatie &amp; Drogen </td></tr><tr><td> 2 </td><td> Lijmen &amp; Montage </td></tr><tr><td> 4 </td><td> Coatings &amp; Neuronale Cultuur Plating</td></tr><tr><td> 9 </td><td> Stretch Groei Start </td></tr></tbody></table> Tabel 1. Experiment Schema. <table border="1"><tbody><tr><td></td><td> Tijd [hr] </td><td> Stretch Prijs [mm / dag] </td><td> Dwell Time [s] </td><td> Totaal Lengte [mm] </td><td> Totaal Stretch tijd [dagen] </td></tr><tr><td> Pretentie </td><td> 24 </td><td> 1 </td><td> 172,8 </td><td> 0 </td><td> 1 </td></tr><tr><td> Uitrekken </td><td> 24 </td><td> 1 </td><td> 172,8 </td><td> 1 </td><td> 2 </td></tr><tr><td> Uitrekken </td><td> 24 </td><td> 2 </td><td> 86,4 </td><td> 3 </td><td> 3 </td></tr><tr><td> Uitrekken </td><td> 24 </td><td> 3 </td><td> 57,6 </td><td> 6 </td><td> 4 </td></tr><tr><td> Uitrekken </td><td> 24 </td><td> 4 </td><td> 43,2 </td><td> 10 </td><td> 5 </td></tr><tr><td> Uitrekken </td><td> 24 </td><td> 5 </td><td> 34,6 </td><td> 15 </td><td> 6 </td></tr></tbody></table> Tabel 2. Stretch Rate Schema. Alle stretch stappen zijn 2 micrometer in verplaatsing (10 stappenmotor stappen = 2 micrometer stretch).

<ol><li>Bernal, R., Pullarkat, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanical+properties+of+axons%5BTitle%5D)+AND+%22Phys+Rev+Lett%22%5BJournal%5D)">Mechanical properties of axons.</a> Phys Rev Lett. 99, 018301-018301 (2007).</li>
<li>Bray, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Axonal+growth+in+response+to+experimentally+applied+mechanical+tension%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Axonal growth in response to experimentally applied mechanical tension.</a> Dev Biol. 102, 379-389 (1984).</li>
<li>Chetta, J., Kye, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytoskeletal+dynamics+in+response+to+tensile+loading+of+mammalian+axons%5BTitle%5D)+AND+%22Cytoskeleton+%28Hoboken%29%22%5BJournal%5D)">Cytoskeletal dynamics in response to tensile loading of mammalian axons.</a> Cytoskeleton (Hoboken). 67, 650-665 (2010).</li>
<li>Dennerll, T. J., Lamoureux, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cytomechanics+of+axonal+elongation+and+retraction%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The cytomechanics of axonal elongation and retraction.</a> J Cell Biol. 109, 3073-3083 (1989).</li>
<li>Fu, S. Y., Gordon, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cellular+and+molecular+basis+of+peripheral+nerve+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">The cellular and molecular basis of peripheral nerve regeneration.</a> Mol Neurobiol. 14, 1-2 (1997).</li>
<li>Gray, C., Hukkanen, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+neural+growth%3A+calcitonin+gene-related+peptide+and+substance+P-+containing+nerves+attain+exceptional+growth+rates+in+regenerating+deer+antler%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Rapid neural growth: calcitonin gene-related peptide and substance P- containing nerves attain exceptional growth rates in regenerating deer antler.</a> Neuroscience. 50, 953-963 (1992).</li>
<li>Heidemann, S. R., Buxbaum, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tension+as+a+regulator+and+integrator+of+axonal+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Motil+Cytoskeleton%22%5BJournal%5D)">Tension as a regulator and integrator of axonal growth.</a> Cell Motil Cytoskeleton. 17, 6-10 (1990).</li>
<li>Heidemann, S. R., Buxbaum, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanical+tension+as+a+regulator+of+axonal+development%5BTitle%5D)+AND+%22Neurotoxicology%22%5BJournal%5D)">Mechanical tension as a regulator of axonal development.</a> Neurotoxicology. 15, 95-107 (1994).</li>
<li>Heidemann, S. R., Lamoureux, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytomechanics+of+axonal+development%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Biochem+Biophys%22%5BJournal%5D)">Cytomechanics of axonal development.</a> Cell Biochem Biophys. 27, 135-155 (1995).</li>
<li>Iwata, A., Browne, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+survival+and+outgrowth+of+mechanically+engineered+nervous+tissue+constructs+implanted+into+spinal+cord+lesions%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng%22%5BJournal%5D)">Long-term survival and outgrowth of mechanically engineered nervous tissue constructs implanted into spinal cord lesions.</a> Tissue Eng. 12, 101-110 (2006).</li>
<li>Lamoureux, P., Heidemann, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Growth+and+elongation+within+and+along+the+axon%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Growth and elongation within and along the axon.</a> Dev Neurobiol. 70, 135-149 (2010).</li>
<li>Lamoureux, P., Zheng, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+cytomechanical+investigation+of+neurite+growth+on+different+culture+surfaces%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">A cytomechanical investigation of neurite growth on different culture surfaces.</a> J Cell Biol. 118, 655-661 (1992).</li>
<li>Lindqvist, N., Liu, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retinal+glial+%28Muller%29+cells%3A+sensing+and+responding+to+tissue+stretch%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Ophthalmol+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">Retinal glial (Muller) cells: sensing and responding to tissue stretch.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 51, 1683-1690 (2010).</li>
<li>Loverde, J. R., Ozoka, V. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live+Imaging+of+Axon+Stretch+Growth+in+Embryonic+and+Adult+Neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurotrauma%22%5BJournal%5D)">Live Imaging of Axon Stretch Growth in Embryonic and Adult Neurons.</a> J. Neurotrauma. , Forthcoming (2011).</li>
<li>Lu, Y. B., Franze, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Viscoelastic+properties+of+individual+glial+cells+and+neurons+in+the+CNS%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Viscoelastic properties of individual glial cells and neurons in the CNS.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 103, 17759-17764 (2006).</li>
<li>O'Toole, M., Lamoureux, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+physical+model+of+axonal+elongation%3A+force%2C+viscosity%2C+and+adhesions+govern+the+mode+of+outgrowth%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">A physical model of axonal elongation: force, viscosity, and adhesions govern the mode of outgrowth.</a> Biophys J. 94, 2610-2620 (2008).</li>
<li>Pfister, B. J., Bonislawski, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stretch-grown+axons+retain+the+ability+to+transmit+active+electrical+signals%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Lett%22%5BJournal%5D)">Stretch-grown axons retain the ability to transmit active electrical signals.</a> FEBS Lett. 580, 3525-3531 (2006).</li>
<li>Pfister, B. J., Gordon, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biomedical+Engineering+Strategies+for+Peripheral+Nerve+Repair%3A+Surgical+Applications%2C+State+of+the+Art%2C+and+Future+Challenges%5BTitle%5D)+AND+%22Crit+Rev+Biomed+Eng%22%5BJournal%5D)">Biomedical Engineering Strategies for Peripheral Nerve Repair: Surgical Applications, State of the Art, and Future Challenges.</a> Crit Rev Biomed Eng. 39, 81-124 (2011).</li>
<li>Pfister, B. J., Iwata, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extreme+stretch+growth+of+integrated+axons%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Extreme stretch growth of integrated axons.</a> J Neurosci. 24, 7978-7983 (2004).</li>
<li>Pfister, B. J., Iwata, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+transplantable+nervous+tissue+constructs+comprised+of+stretch-grown+axons%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">Development of transplantable nervous tissue constructs comprised of stretch-grown axons.</a> J Neurosci Methods. 153, 95-103 (2006).</li>
<li>Siechen, S., Yang, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanical+tension+contributes+to+clustering+of+neurotransmitter+vesicles+at+presynaptic+terminals%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Mechanical tension contributes to clustering of neurotransmitter vesicles at presynaptic terminals.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 106, 12611-12616 (2009).</li>
<li>Smith, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stretch+growth+of+integrated+axon+tracts%3A+extremes+and+exploitations%5BTitle%5D)+AND+%22Prog+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Stretch growth of integrated axon tracts: extremes and exploitations.</a> Prog Neurobiol. 89, 231-239 (2009).</li>
<li>Smith, D. H., Wolf, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+strategy+to+produce+sustained+growth+of+central+nervous+system+axons%3A+continuous+mechanical+tension%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng%22%5BJournal%5D)">A new strategy to produce sustained growth of central nervous system axons: continuous mechanical tension.</a> Tissue Eng. 7, 131-139 (2001).</li>
<li>Weiss, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nerve+patterns%3A+The+mechanics+of+nerve+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Growth%2C+Third+Growth+Symposium%22%5BJournal%5D)">Nerve patterns: The mechanics of nerve growth.</a> Growth, Third Growth Symposium. 5, 163-203 (1941).</li>
<li>Zheng, J., Lamoureux, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tensile+regulation+of+axonal+elongation+and+initiation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Tensile regulation of axonal elongation and initiation.</a> J Neurosci. 11, 1117-1125 (1991).</li>
</ol>

De ex-vivo mechanische rek van neuronale cellen is gepatenteerd onder US patenten # 6264944 en # 7429267.

Twee cruciale stappen moeten worden genomen bij de voorbereiding van de bioreactoren. Eerst wordt een optimale overlap bij de substraat-interface die nodig is om ervoor te zorgen dat de axonen kunnen oversteken op de stationaire substraat. Aclar dat overmatig gekruld of anderszins onvolmaakt mag niet worden gebruikt (figuur 3). Voor het optimaliseren van de overlap, bevestigen dat het trekkende ondergrond gelijkmatig is geschuurd en contact met de stationaire substraat gelijkmatig over een 2-3mm lang contact met de weg. De overlap dient voorafgaand aan elk experiment worden geoptimaliseerd door het zorgvuldig aanpassen van de hoogte van het trekkende benen. Ten tweede, terwijl voor de bevestiging van neuronen, substraat coatings te ondersteunen aanzienlijke Sheering krachten veroorzaakt door de verplaatsing van de bioreactor en de contractiele de spanning van de axonen (Heidemann en Buxbaum 1990; Pfister, Iwata et al., 2004;.. Loverde, Ozoka et al. 2011). Ondergronden moeten grondig worden gespoeld met gesteriliseerd water zowel voor als na lysine coating. Coatings worden toegepast van vers ontdooide aliquots en verspreid zo gelijkmatig mogelijk te maken. Belangrijk is dat de ondergrond niet worden verplaatst of anderszins gestoord tijdens de hechting periode. In de daaropvolgende stappen, vermijd contact met de substraten tijdens het plating, en pipet alle oplossingen uit het verre uiteinde van de rijstroken uit de buurt van de ondergrond-interface. Toleranties in de aansluitingen van elk bioreactor component kan manifesteren in de vorm van speling. Tijdens de eerste periode van ASG, speling in het systeem is evident als beweging van de geautomatiseerde lineaire beweging tafel komt, zonder beweging van het trekkende blok. Slack kunnen variëren per experiment, maar is meestal &lt;1mm in onze ervaring. Om deze reden, een &quot;pre-spanning &#39;slappe eliminatiefase van 1mm/day, voor een dag, vooraf aan de ASG schema waarin de bioreactor onderdelen betrekken en beginnen met beweging van het trekkende substraten. Het oplossen van problemen kan nodig zijn als de verplaatsing stap van de automatische lineaire beweging tabel niet overeenkomt met de verplaatsing van het trekkende blok na de pre-spanning fase is voltooid. Asynchroon, onjuiste verplaatsingen van het trekkende blok worden geassocieerd met &#39;stiction&#39; of statische wrijving binnen het trekkende hardware en buigen van de adapter. Om te voorkomen dat deze problemen zich voordoet, moet beweging van het trekkende blok worden gecontroleerd met de hand, na montage, voor een soepele bijna moeiteloos beweging. Indien er bindende optreedt, dient het trekkende montage vooraf te worden vrijgelaten om te experimenteren. Voldoende stijfheid van de adapter is ook noodzakelijk om accurate, synchrone verplaatsingen te verzekeren worden niet overwonnen door stiction van het trekkende hardware.

<table border="1"><tbody><tr><td> Naam van de component </td><td> Vennootschap </td><td> Catalogus nummer </td><td> Reacties </td></tr><tr><td> Polyetheretherketone (PEEK) </td><td> McMaster-Carr, Elmhurst, IL </td><td> 8504K69 </td><td> Custom made bioreactor kamer </td></tr><tr><td> Polycarbonaat </td><td> McMaster-Carr, Elmhurst, IL </td><td> 8574K28 </td><td> Custom made bioreactor kamer deksel </td></tr><tr><td> Stappenmotor </td><td> Applied Motion Products, Watsonville, CA </td><td> HT23-397 </td><td></td></tr><tr><td> Lineaire beweging tafel </td><td> Servo Systems, Montville, NJ </td><td> MIPS-2-10-1,0 mm </td><td></td></tr><tr><td> Stappenmotor drive controller </td><td> Applied Motion Products, Watsonville, CA </td><td> Si2035 </td><td></td></tr><tr><td> Aclar </td><td> Structuur Probe Inc, West Chester, PA </td><td> 1859 </td><td> Slepen cultuur ondergronden </td></tr><tr><td> Nee een dekglaasje </td><td> Brain Research Labs, Newton, MA </td><td> 4865-1 </td><td> Stationaire cultuur substraat </td></tr><tr><td> Silicium RTV </td><td> McMaster-Carr, Elmhurst, IL </td><td> 7587A37 </td><td></td></tr><tr><td> Wattenstaafje swabs </td><td> McMaster-Carr, Elmhurst, IL </td><td> 7074T62 </td><td></td></tr><tr><td> Poly-D-Lysine </td><td> BD, Bedford, MA </td><td> 354210 </td><td></td></tr></tbody></table>

axon stretch groei: de mechanotransductie van neuronale groei

Axon Stretch Growth: The Mechanotransduction of Neuronal Growth

Tijdens de pre-synaptische embryonale ontwikkeling, neuronale processen traverse korte afstanden om hun doelstellingen te bereiken via groei kegel. Na verloop van tijd worden neuronale somata gescheiden van hun axon terminals als gevolg van groei van het skelet van de zich uitbreidende organisme (Weiss 1941;. Gray, Hukkanen et al. 1992). Dit mechanotransductie leidt tot een secundaire vorm van neuronale groei die in staat van de opvang van voortdurende verlenging van het axon (Bray, 1984; Heidemann en Buxbaum 1994, Heidemann, Lamoureux et al. 1995;. Pfister, Iwata et al. 2004.). Axon Stretch Groei (ASG) is denkbaar een centrale factor in de rijping van korte embryonale processen in de lange zenuwen en witte stof traktaten kenmerk van het volwassen zenuwstelsel. Om te studeren ASG in vitro, hebben we ontworpen bioreactoren om de spanning van toepassing zijn op de korte axonale processen van neuronale culturen (Loverde, Ozoka et al.. 2011). Hier hebben we detail de methodes die wij gebruiken om bioreactoren voor te bereiden en ASG gedrag. De eerste, binnen elk rekken rijstrook van de bioreactor, zijn neuronen plated op een micro-gemanipuleerde slepen substraat. Vervolgens neuronen regenereren hun axonale processen, via groeikegel uitbreiding, op een stationaire substraat. Tot slot wordt de groei stretch uitgevoerd door slepen de vergulde cellichamen weg van het axon terminals gehandeld op grond van de stationaire substraat; indient groei van het skelet na de groei kegel extensie. Eerder werk heeft aangetoond dat ASG van embryonale rat achterwortelganglia neuronen in staat zijn van een ongekende groeicijfers tot 10mm/day, bereiken lengtes tot 10 cm, terwijl tegelijkertijd resulteert in een verhoogde axonale diameters (Smith, Wolf et al. 2001;. Pfister, Iwata et al., 2004;. Pfister, Bonislawski et al., 2006;. Pfister, Iwata et al., 2006;. Smith 2009). Dit is in dramatisch contrast met de regeneratieve groei conus extensie (in afwezigheid van mechanische stimuli), waar de gemiddelde groeipercentages 1mm/day met succesvolle regeneratie beperkt tot een lengte van minder dan 3 cm (Fu en Gordon, 1997;. Pfister, Gordon et al. 2011). Dienovereenkomstig, kan nader onderzoek van ASG helpen om ontregelde groei van mechanismen die vernieuwing te beperken bij het ontbreken van mechanische stimuli te onthullen.

Een unieke tissue engineering methode werd ontwikkeld om een ​​groot aantal zenuwvezels in de cultuur langwerpig door indient axon stretch groei, een vorm van het zenuwstelsel waarbij de groei van zenuwen langwerpig in combinatie met een groei van de zich uitbreidende lichaam.

Axon Stretch groei: de Mechanotransductie van neuronale groei

Tijdens de presynaptische embryonale ontwikkeling leggen neuronale processen korte afstanden af om via de groeikegel hun doelgebieden te bereiken. Na verloop van tijd leggen neuronale somata ...

Het algemene doel van het volgende experiment is om trekkracht uit te oefenen op het axonale uitlopers van een neuron om de groei ervan te stimuleren en te behouden. Dit wordt bereikt door neuronen, aangestuurd door een reactor, op een micro-gemanipuleerd trekkend substraat uit te platen. Na het uitplaten worden de neuronen tot een week gekweekt, waarbij de axonen zich via uitbreiding van de groeikegel over een stationair substraat uitstrekken.Vervolgens wordt axonale rekgroei uitgevoerd door de geplaatste cellichamen weg te slepen van de axonterminalen die aan het stationaire substraat hechten. De weefseltechnische methode van axonale rekgroei is in staat tot aanhoudende groeisnelheden tot 10 millimeters per dag, wat op basis van microscopische analyse resulteert in lange vesiculaire bundels van vergrote axonbanen. Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van andere methoden, zoals extensie door groeistroom, is dat axonale rekgroei het mogelijk maakt om axonbanen in kortere tijdsperioden tot elke gewenste lengte te laten groeien.De implicaties van axonrek-groei stellen ons in staat om de biomechanische signalen te reproduceren die zenuwgroei stimuleren. Deze signalen kunnen worden bestudeerd om ze te benutten en nieuwe strategieën te ontwikkelen voor de behandeling van zieke of beschadigde zenuwen. De axonrek-groei-methode kan dus helpen bij het beantwoorden van fundamentele kernvragen over de ontwikkeling en het behoud van het zenuwstelsel.Belangrijk is dat we de mechanismen kunnen onderzoeken die axonen in staat stellen om met snelheden te groeien die we voorheen voor onmogelijk hielden. Het bioreactorsysteem voor axonale rek-groei bestaat uit drie hoofdonderdelen. Ten eerste een bioreactorkamer waarin neuronen worden gekweekt en worden uitgerekt.Ten tweede een geautomatiseerde lineaire bewegingstafel die rekkrachten uitoefent. En tot slot een stappenmotor-aansturingscontroller met software om de rek-groei te beheersen. Hier wordt het protocol gedemonstreerd met behulp van een geminiaturiseerd systeem dat in staat is om onder een microscoop te werken.De fabricage van bioreactorprototypes werd uitgevoerd met een verticale freesmachine voor biocompatibiliteit en eenvoudige sterilisatie van de cultuur. De kamercomponenten werden gefreesd uit Polyetheretherketon en er werden drie corrosiebestendige roestvrijstalen bevestigingsmiddelen van type 16 gebruikt om de assemblage te voltooien. De cultuurkamer van de bioreactor bevat een rekframe, een verstelbaar trekblok, trekstangen voor externe manipulatie en wegwerpbare trek- en stationaire cultuursubstraten.De geautomatiseerde lineaire bewegingstafel bestaat uit een lineaire bewegingstafel met een stappenmotor die is gemonteerd op een delrin tafel. Een softwareprogramma genaamd P si programmer wordt gebruikt om de aansturingscontroller die met de stappenmotor communiceert, te programmeren en te bewaken. Maak substraten voor het slepen van culturen door LAR-folie in dunne stroken te snijden van ongeveer 0,5 bij 2,5 centimeter.Schuur het onderste derde deel van de trekkende cultuursubstraten aan beide zijden licht op met fijn schuurpapier (korrel 1.200) om de groei van axonen van de trekkende substraten naar het stationaire substraat te vergemakkelijken. Het gebruik van een scheidingslip helpt om gelijkmatiger te schuren. Snijd een stuk LAR van vijf bij zeven centimeter of gebruik een glazen dekglas nummer één om als stationair substraat te dienen.Reinig de cultuursubstraten en de bioreactorkamer met een verdunde Alcan-oplossing en spoel grondig na met gedeïoniseerd water. Steriliseer de cultuursubstraten door ze gedurende 30 minuten onder te dompelen in 70% ethanol. Steriliseer de bioreactorkamer in een autoclaafbaar reservoir via autoclaven.Breng na sterilisatie de kweeksubstraten en de bioreactorkamer over naar een weefselkweekkast en laat deze aan de lucht drogen. Een doos pipetpunten kan worden gebruikt om de kweeksubstraten te drogen. Plaats de kweeksubstraten met behulp van steriele wattenstaafjes.Lijm de sleepcultuursubstraten aan de poten van het sleepblok. Met een dunne laag siliconen RTV moet het substraat worden vastgelijmd aan het niet-geschuurde gedeelte, waarbij contact met het geschuurde cultivoppervlak moet worden vermeden. Lijm vervolgens het stationaire cultuursubstraat aan de bodem van de bioreactorkamer.Verwijder overtollige lijm en luchtbellen door een droge wattenstaafje voorzichtig tegen de bodem van het stationaire substraat te drukken. Laat de kamer twee volledige dagen drogen in de weefselkweekkast. Stel na twee dagen de poten van het sleepblok af om een overlap van twee tot drie millimeter te verkrijgen tussen de uiteinden van de standaard sleepsubstraten en het stationaire substraat.Er moet cruciale aandacht worden besteed aan de grootte van de overlap. Als deze te groot is, zullen de uiteinden van de trekkende substraten afbuigen van het stationaire substraat, waardoor het aantal axonen dat de overlap overspant afneemt. Positioneer het trekblok in de startpositie met de trekstangen ingetrokken in de bioreactor.Draai de immobilisatieschroeven vast om beweging van de trekkstangen te voorkomen. Trek vóór de rek-groei in een weefselkweekkap één milliliter hoogmoleculaire poly-D-lysine in serumvrij medium over de substraatinterface van elke baan. Laat de oplossing één uur op kamertemperatuur inwerken; spoel na een uur drie keer met gedeïoniseerd water, gevolgd door een laatste spoeling met kweekmedium. Plaats dorsale wortelganglion-explantaten van E 16 ratpups op de geschuurde trekkweeksubstraten.Verdun met behulp van een stereomicroscoop eerst de planten in druppels met behulp van petrischalen, en verzamel vervolgens drie tot vier plantjes met een pipetteerplaat van 100 µL. Plaats de planten aan de rand van het substraat in een kleine plas medium van maximaal 1 mL kweekmedium. Deze hoeveelheid medium is voldoende om verdamping gedurende enkele uren te voorkomen, terwijl de beweging van de plantjes wordt beperkt.Sluit het deksel van de bioreactor en plaats deze gedurende één uur in een incubator om de eggplants te laten hechten. Vul na één uur de bioreactor met kweekmedium op het punt dat het verst van de eggplants verwijderd is om te voorkomen dat ze losraken. Incubeer de bioreactor vijf dagen zodat de DRG-neuronen axonale uitlopers kunnen vormen op het stationaire substraat.Vul in de weefselkweekkast de reservoirs van de bioreactor met fosfaatgebufferde zoutoplossing om de kamer te bevochtigen en aberratie van het medium te beperken. Voer een laatste mediumwissel uit door de banen van de bioreactor tot de maximale capaciteit te vullen. Plaats de bioreactor op de geautomatiseerde lineaire bewegingstafel in een niet-bevochtigde incubator.Bevestig de adapter voor de sleepstang aan de sleepstangen. Gebruik de Cy programmer-software om de tafel van de lineaire beweging te verplaatsen zodat deze is uitgelijnd met de adapter voor de sleepstang, en bevestig deze voor het gemak aan de tafel.Bereid de programmeersequenties vooraf voor om de tafel in specifieke stappen te kunnen manipuleren. Voordat u start met het groeiprogramma voor axonale rek, draait u de immobilisatieschroeven op de bioreactorkamer los. De rek wordt stapsgewijs aangebracht door een reeks kleine verplaatsingsstappen uit te voeren, gescheiden door rustperioden.Dit paradigma begint met twee micronstappen elke 172 seconden, wat resulteert in een netto rek van één millimeter over de eerste 24 uur na de voorspanning. Na één dag kan de reksnelheid worden versneld door de grootte van de verplaatsingsstap te verhogen of de rusttijd te verkorten. Representatieve resultaten van het axonale rekgroeiproces worden hier getoond.De eerste cellen binnen de geplaatste implantaten migreren naar het sleepsubstraat. Gedurende de volgende vijf dagen strekken groeikegels axonale uitlopers uit op het stationaire substraat. Zodra de groeikegels zich over ten minste één millimeter over het stationaire substraat hebben uitgebreid, wordt de axonale stretch-groei gestart.Het sleepsubstraat wordt weg van de AED-groeikegels gemanipuleerd. In een reeks stappen wordt de elasticiteit van de overspappende axonen onmiddellijk duidelijk zodra ze worden uitgerekt. Doorgaans worden axonen in eerste instantie dunner, maar treden ze binnen enkele uren in een groeifase waarin ze hun diameter herstellen en behouden. Binnen 24 uur van continue rekgroei vertonen axonen een verhoogde tolerantie voor rek en zijn ze in staat om toenames in de reksnelheid te verdragen.Naarmate de axonen verder groeien en FAS circuleren, vertonen ze een toenemende tolerantie voor rek. Hier is het drijven van onder rek gegroeide axonen duidelijk zichtbaar wanneer de bioreactor opzettelijk met de hand wordt aangestoten. Af en toe kunnen axonen losraken van het stationaire substraat als gevolg van onvoldoende adhesie.Dit is de meest voorkomende fout en treedt waarschijnlijk op als de initiële stapgrootte te groot is of als het stationaire substraat onvoldoende is gecoat. Hierdoor raken een deel van de axonen los van het stationaire substraat bij de start van de rek-groei vanwege een te grote stapgrootte. Tijdens het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om de tijd te nemen bij het voorbereiden van de substraatinterface.De teen en het substraat moeten het stationaire substraat met twee tot drie millimeter overlappen, en de DRG moet zo dicht mogelijk bij de interface worden geplaatst terwijl de rekproductie plaatsvindt. U krijgt hiermee een unieke kans om axonale groei te bestuderen met behulp van levende fluorescentie-probes of door de cellen te lyseren terwijl ze rekken om de genexpressie te bestuderen. Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe toegepaste spanning kan worden gebruikt om axonale groei te stimuleren.Met deze techniek ontdekken we dat axonen een verbazingwekkend vermogen hebben om sneller te groeien dan we voor mogelijk hielden, en om verbindingen te maken die op geen enkele andere manier kunnen worden gerealiseerd.

axon-stretch-growth-the-mechanotransduction-of-neuronal-growth

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bio-engineering

Toepassing en directe metingen van de krachten op neuronen in de 2-1000 microdyne serie worden bereikt met een hoge precisie met geijkte glas naalden. Deze methodiek kan gebruikt worden om de controle en meten van verschillende aspecten van axonale ontwikkeling, waaronder axonale initiatie, axonale spanning, snelheid van axonale rek, en kracht vectoren.

Mechanische Manipulatie van Neuronen om axonale Development Controle

Live-Gram-negatieve en Gram-positieve bacteriën kunnen worden geïmmobiliseerd op gelatine gecoate mica en beeld gebracht in een vloeistof met behulp van Atomic Force Microscopy (AFM).

Bacteriële Immobilisatie for Imaging door Atomic Force Microscopy

We presenteren in dit artikel een nieuw strekken platform dat kan worden gebruikt om cel responsen op complexe anisotrope biaxiale mechanische vervorming onderzoeken en kwantificeren van de mechanische eigenschappen van biologisch weefsel.

A Novel Stretching platform voor toepassingen in de Cel en Weefsel Mechanobiology

Er werd een nieuw beeldvormingsprotocol ontwikkeld met behulp van een op maat gemaakte motorgestuurde mechanische actuator om de meting van realtime-responsen op mechanische spanning in levende cellen mogelijk te maken. Relevant voor mechanobiologie, kan het systeem spanningen tot 20% toepassen terwijl het realtime beeldvorming met confocale of atomaire krachtmicroscopie mogelijk maakt.

Live cell imaging tijdens Mechanical Stretch

Dit protocol beschrijft de isolatie van dorsale wortelganglion (DRG) neuronen geïsoleerd uit ratten en de kweek van DRG neuronen op een statisch voorgerekt celkweeksysteem om de uitlijning van axonen te verbeteren, met daaropvolgende co-cultuur van Schwann-cellen (SC's) om myelinisatie te bevorderen.

Een aanpak ter verbetering van Alignment en Myelination van dorsale wortel ganglion Neuronen

Deze procedure beschrijft hoe snel neurieten georganiseerd in microfluïdische kamers kunnen initiëren, verlengen en verbinden met behulp van poly-D-lysine beklede kralen die zijn bevestigd aan micropipetten die leiden tot neuriet verlenging.

Rewiring Neuronal Circuits: een nieuwe methode voor snelle neuritische verlenging en functionele neuronale verbinding

Met behulp van een eerder ontworpen apparaat om mechanische belasting toe te passen op aanhangende cellen, dit document beschrijft een vernieuwde substratum geometrie en een aangepaste apparaat voor hoge-resolutie single-cell beeldvorming van gespannen cellen met een 100x olie onderdompeling doelstelling.

Hoge-resolutie beeldvorming van kern dynamiek in levende cellen onder Éénassige trekspanning

Dit protocol demonstreert een eenvoudige en robuuste methode om in situ axongroei en groeikegeldynamiek te bestuderen. Het beschrijft hoe ex vivo fysiologisch relevante acute hersenplakken kunnen worden bereid en biedt een gebruiksvriendelijke analysepijplijn.

In situ Visualisatie van Axon-groei en groeikegeldynamiek in acute ex vivo embryonale hersenplakculturen

Om vooruit te komen, moeten groeikegels tractiekrachten uitoefenen tegen de externe omgeving. Het genereren van trekkrachten is afhankelijk van actinedynamiek en koppeling. De huidige studie beschrijft methoden voor het analyseren van actinedynamica, koppelingskoppeling en tractiekrachten voor groeikegelvoortgang.

Analyses van actinedynamica, koppelingskoppeling en tractiekracht voor groeiconusvooruitgang

Hier presenteren we een veelzijdig equibiaxiaal rekapparaat dat pneumatisch wordt bediend en compatibel is met microscopie met hoge resolutie.

Equibiaxiaal rekapparaat voor sterk vergrote live-cell confocale fluorescentiemicroscopie

Hier presenteren we een nieuw apparaat dat isotrope en uniaxiale spanningsgolfvormen op cellen toepast, terwijl het cultuur ondersteunt op substraten met instelbare stijfheid en aanpasbare eiwitmatrices. Dit eenvoudige, economische platform stelt onderzoekers in staat te onderzoeken hoe mechanische signalen de cellulaire functie reguleren in zowel fundamentele studies als ziektegerelateerde contexten.

Een nieuw platform voor in vitro cellulaire stretching en beeldvorming

Leer axon stretch groei voor weefselengineering met een bioreactor die trekkracht toepast op neuronen. Deze methode bereikt groeisnelheden tot 10 mm per dag en helpt onderzoekers zenuwontwikkeling en potentiële behandelingen voor zenuwletsel te bestuderen.

Axon Stretch groei: de Mechanotransductie van neuronale groei

Meer video's verkennen