Name: 中大脳動脈閉塞のマウスモデル (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-02-13T17:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 43 s
Description: 学ぶマウスにおける中大脳動脈閉塞の血管内フィラメントモデル。脳虚血の再現性ある誘導法とTTC染色による梗塞評価を含む神経科学研究の標準プロトコルを解説します。

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この作品は、NIHの助成金NS057195、UCSF REAC賞、そしてケント州立大学のスタートアップ資金WHチョウにによってサポートされていました。

<html> 1。 MCAO方法このプロトコルは、実験動物の使用のための健康ガイドラインの国立研究所で動物実験によって承認され、UCSFとケント州立大学で委員会を使用して、遵守された。 <ol><li> 20mmのセグメントに5から0モノフィラメント縫合糸（ハーバード装置、ホリストン、MA）をカット。 cauterizer（ブレーントリーサイエンティフィック社、ブレーンツリー、MA）の近くに加熱することにより、各セグメントの先端を丸める。マイクロメートル（応用イメージ社、ロチェスター、NY）を用いて先端の直径を測定する。我々は25-30 gの体重を持つマウスのために0.21〜0.22ミリメートルの最後の先端径との縫合糸を使用してください</li><li>オートクレーブ（最小121 ° C、15 PSI、15分間）により、すべての手術器具を滅菌する。 70％エタノールを使用して手術のテーブルおよび関連機器をサニタイズ。 </li><li> V - 10麻酔システムを使用して、OはO 2 / 70％N 2 30％のイソフルラン5％8月12日週齢のマウス（25〜30グラム）（Aerrane、バクスター、ディアフィールド、イリノイ州）の麻酔（VetEquip株式会社。、プレザントン、カリフォルニア州）。麻酔の誘導後、イソフルランのレベルを低下させ、1.5％で、それを維持する。 </li><li>加熱パッド上に仰臥位にマウスを置きます。直腸プローブを挿入し、℃、TR - 200恒温温度システム（ファイン科学ツール（株）、フォスターシティー、CA）を使用して36.5から37.5の間に体温を監視し、維持する。 </li><li>肌を露出するために電気バリカン（ブレーントリーの科学）と頸部腹側の領域の上に毛皮を剃る。 70％エタノールつのアプリケーションを使用して手術部位を消毒する。 </li><li>ステレオ解剖顕微鏡下で（ニコン、日本）、首に1センチの正中切開を行います。手術野を公開し、右総頸動脈（CCA）、外頸動脈（ECA）、および内頸動脈（ICA）を識別するために、リトラクター（ブレーントリーサイエンティフィック）を使用してください。慎重に神経や筋膜の周囲から無料の動脈を詳細に分析します。 </li><li>さらに遠位にECAを摘出し、バイポーラ凝固剤（ハワードインストゥルメント社、アラバマ州タスカルーサ）を使用してECAとその上甲状腺動脈（STA）分岐を凝固。凝固したセグメントでECAとSTAをカット。 </li><li>大まかにECAの切り株2箇所を8から0絹縫合糸を結ぶ。 ECAとICAにCCAの分岐部に血管クランプ（ファイン科学のツール）を適用します。 </li><li> Vannas -スタイル春のはさみ（ファイン科学のツール）とECA切り株の端の小さな切開を加えます。先端に丸みを帯びた5から0モノフィラメント縫合糸の長さを測定し記録する。切開に縫合を挿入し、クランプに進みます。だけで十分な確保はまだで、住居のモノフィラメント縫合糸の機動性を維持するために内腔2箇所を絹の縫合糸を締めます。 </li><li>分岐からクランプを外します。ゆっくりとMCAの起源を閉塞するためにCCAの分岐を超えて9〜10ミリメートルの距離にICAにECAの内腔からモノフィラメント縫合糸を進める。手術時間は約30-45分です。 </li><li>首に切開を縫合し、麻酔からの回復、そしてケージに戻すために35 ° C看護のボックスにマウスを置きます。それは一般的に麻酔から回復するためにマウスの5〜10分かかります。過渡MCAOを実行するには、研究者は、通常の間に0.5〜2時間をマウスを再度麻酔し、一定期間後にECAの切り株に戻って縫合を撤回することができます</li><li> MCAOの誘導24時間後には、イソフルラン5％、マウスを麻酔し、頚椎脱臼によってそれを安楽死させる。マウスの首を切ると脳を収集する。氷の上で脳の行列（ブレーントリーサイエンティフィック）を持つ4 2mmのスライスにcoronally脳をスライスして。梗塞の大きさと範囲を決定するために室温で20分間、1 × PBS中の2％2,3,5 - トリフェニル塩化（TTC）（Sigma - Aldrich社）での脳切片をインキュベートします。イメージングまで中立を4でホルマリン溶液を（Sigma - Aldrich）をバッファリング10％の脳のスライス° Cを修正。 Joveのプロトコル955（で説明されているように心筋梗塞の程度を定量化することができる<a href="https://www.jove.com/index/Details.stp?ID=955">https://www.jove.com/index/Details.stp?ID=955</a> ）9。 </li></ol> 2。代表的な結果 MCAOによって生成された梗塞は、線条体と背外側皮質に見られる。線条体は大脳皮質よりも虚血の影響を受けやすくなります。 MCAOの一時間以上は、線条体と皮質の両方を損傷する恐れながら、MCAOの30分は、唯一の線条体の梗塞が生成されます。 24時間永久MCAO後、合計梗塞の割合は、±半球の5％〜40であり、手術後の死亡率は約10％です。過度の出血が手術中に発生した場合、我々はさらに研究からマウスを除外する、操作時間が90分を超えると、マウスは15分以内に麻酔からの回復に失敗する、または出血は、脳のスライスにまたは剖検時にウィリス動脈輪の根元に発見され。 61/2761fig1.jpg&quot;altが=&quot;図1&quot;/&gt; 永久MCAOの24時間後のTTC染色した脳切片の図1。代表画像（コロナルレベル1-4）。壊死領域でそのような酵素活性の欠如に起因する白のまま組織TTCを生体内で酵素的に色が赤になっている1,3,5 - triphenylformazan（TPF）、、にデヒドロゲナーゼによって低減されます。そのため、梗塞の領域はTPFへのTTCの変換が不足しているため、その白い色で識別することができます。注：これは可能な限り熱と光から染色した切片を保護TTCが不安定にやや熱と光です。

<ol><li>Howard, G., Howard, V. J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHoward%2C+G+%22Distribution+of+stroke%3A+hetrogeneity+of+stroke+by+age%2C+and+sex%22">Distribution of stroke: hetrogeneity of stroke by age, and sex</a>. , Elsevier Inc. New York. 3-12 (2004).</li>
<li>Thom, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heart+disease+and+stroke+statistics--2006+update%3A+a+report+from+the+American+Heart+Association+Statistics+Committee+and+Stroke+Statistics+Subcommittee%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Heart disease and stroke statistics--2006 update: a report from the American Heart Association Statistics Committee and Stroke Statistics Subcommittee.</a> Circulation. 113, e85-e151 (2006).</li>
<li>Mohr, J. P. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMohr%2C+JP+%22Middle+cerebral+artery+disease%22">Middle cerebral artery disease</a>. , Elsevier Inc. New York. 123-166 (2004).</li>
<li>Longa, E. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reversible+middle+cerebral+artery+occlusion+without+craniectomy+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Stroke%22%5BJournal%5D)">Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats.</a> Stroke. 20, 84-91 (1989).</li>
<li>Chou, W. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophil+protein+kinase+Cdelta+as+a+mediator+of+stroke-reperfusion+injury%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Invest%22%5BJournal%5D)">Neutrophil protein kinase Cdelta as a mediator of stroke-reperfusion injury.</a> J. Clin. Invest. 114, 49-56 (2004).</li>
<li>Hudgins, W. R., Garcia, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effect+of+electrocautery%2C+atmospheric+exposure%2C+and+surgical+retraction+on+the+permeability+of+the+blood-brain-barrier%5BTitle%5D)+AND+%22Stroke%22%5BJournal%5D)">The effect of electrocautery, atmospheric exposure, and surgical retraction on the permeability of the blood-brain-barrier.</a> Stroke. 1, 375-380 (1970).</li>
<li>Carmichael, S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rodent+models+of+focal+stroke%3A+size%2C+mechanism%2C+and+purpose%5BTitle%5D)+AND+%22NeuroRx%22%5BJournal%5D)">Rodent models of focal stroke: size, mechanism, and purpose.</a> NeuroRx. 2, 396-409 (2005).</li>
<li>Durukan, A., Tatlisumak, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acute+ischemic+stroke%3A+overview+of+major+experimental+rodent+models%2C+pathophysiology%2C+and+therapy+of+focal+cerebral+ischemia%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmacol.+Biochem.+Behav%22%5BJournal%5D)">Acute ischemic stroke: overview of major experimental rodent models, pathophysiology, and therapy of focal cerebral ischemia.</a> Pharmacol. Biochem. Behav. 87, 179-197 (2007).</li>
<li>Taniguchi, H., Andreasson, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+hypoxic-ischemic+encephalopathy+model+of+perinatal+ischemia%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">The hypoxic-ischemic encephalopathy model of perinatal ischemia.</a> J Vis Exp. , (2008).</li>
</ol>

我々は、開示する潜在的な利害対立を持っていない。

マウスのMCAOは一般にヒトで局所性脳虚血をモデル化するために使用されます。脳卒中の研究のためのマウスの使用は、トランスジェニックやノックアウト株の可用性をより頻繁になっています。プロトコルで注意するいくつかの重要な詳細があります。 <ol><li>それは手術中にマウスの体温を維持するために不可欠であり、それは完全に麻酔から回復する前に。体温は、梗塞の程度に影響があり、低体温が低下し、温熱療法は、梗塞のサイズが大きくなります。 </li><li>公開し、CCAとECAを隔離し、梗塞サイズと減少生存率を増加させることができる近くの迷走神経や気管を、損傷を避ける。 </li><li> 10mm以上の分岐を通過モノフィラメント縫合糸を挿入しないでください。遠く挿入縫合糸は、脳内出血で前大脳動脈とその結果を穿孔することができます。縫合糸は、分岐点を超えて9〜10ミリメートル程度進んでいるときに抵抗が感じられる。この問題が発生した場合、研究者は、縫合糸を進める停止し、距離を確認する必要があります。 </li></ol>

<table><tbody><tr><td>イソフルラン</td><td>化学物質</td><td>Baxter Internationl Inc.</td><td>95045-588</td><td></td></tr><tr><td>V-10 麻酔システム</td><td>機器</td><td>VetEquip</td><td>901807</td><td></td></tr><tr><td>TR-200 温度コントローラー</td><td>機器</td><td>Fine Science Tools</td><td>21060</td><td></td></tr><tr><td>バリカン</td><td>機器</td><td>Braintree Scientific, Inc.</td><td>CLP-9931</td><td></td></tr><tr><td>解剖顕微鏡</td><td>機器</td><td>Nikon Instruments</td><td>SMZ745T</td><td></td></tr><tr><td>リトラクターシステム</td><td>機器</td><td>Braintree Scientific, Inc.</td><td>ACD-014</td><td></td></tr><tr><td>バイポーラ凝固装置</td><td>機器</td><td>Howard Instrument</td><td>64000</td><td></td></tr><tr><td>シルク縫合糸</td><td>材料</td><td>Harvard Apparatus</td><td>510479</td><td></td></tr><tr><td>モノフィラメント縫合糸</td><td>材料</td><td>Harvard Apparatus</td><td>723351</td><td></td></tr><tr><td>血管クランプ</td><td>機器</td><td>Fine Science Tools</td><td>00396-01</td><td></td></tr><tr><td>バナス鋏</td><td>機器</td><td>Fine Science Tools</td><td>15000-08</td><td></td></tr><tr><td>ブレインマトリックス</td><td>機器</td><td>Braintree Scientific, Inc.</td><td>BS-2000C</td><td></td></tr><tr><td>2,3,5-トリフェニルテトラゾリウムクロリド</td><td>化学物質</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8877</td><td></td></tr><tr><td>10% 中性緩衝ホルマリン</td><td>化学物質</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>HT5011</td><td></td></tr></tbody></table>

中大脳動脈閉塞のマウスモデル

Mouse Model of Middle Cerebral Artery Occlusion

脳卒中は米国1の最も一般的な致命的な神経疾患です。脳の血管の閉塞（虚血性脳卒中）2からのストロークの大多数（88％）の結果。ほとんどの虚血性脳卒中（〜80％）中大脳動脈（MCA）の3地域で行われるため、開発されている多くの動物ストロークモデルは、この動脈に焦点を当てている。中大脳動脈閉塞（MCAO）の管腔内モノフィラメントモデルは、外頸動脈に外科的にフィラメントの挿入と先端がMCAの起源を閉塞するまで停止の結果、内頸動脈（ICA）に前方にスレッドを含む血流とMCA領域4のその後の脳梗塞の。手法は永続的または一時的な閉塞5をモデル化するために使用することができます。縫合糸は、一定のインターバル後に削除されている場合（30分、1時間、または2時間）、再灌流が（一時的なMCAO）が達成され、フィラメントはその場に放置されている場合（24時間）の手順では、恒久的なMCAOのモデルとして適しています。 。このテクニックはクレイニエクトミ、頭蓋内圧と温度6に影響を与える可能性のある頭蓋骨の一部を、削除するには、脳外科的処置を必要としません。それは、ラットやマウス7,8の永久および一時的な局所脳虚血を模倣するために最も頻繁に使用される方法となっている。脳梗塞の程度を評価するために、我々は、虚血脳組織9を識別するために、2,3,5 -塩化トリフェニルテトラゾリウム（TTC）での脳切片を染色。このビデオでは、我々はMCAO法およびTTC染色により梗塞サイズの測定を示しています。

我々はビデオで腔内モノフィラメントを使用して成体マウスの中大脳動脈閉塞を製造する方法を示しています。我々はまた、2,3,5 - 塩化トリフェニルテトラゾリウム（TTC）染色による脳梗塞の程度を評価する方法を示します。

脳卒中は、米国において最も一般的で致死的な神経疾患である1。脳卒中の大部分（88%）は、...内にある血管の閉塞によって引き起こされる。

こんにちは、テレンス・ジャムです。ハイ・ジョーです。本日は、マウスの中大脳動脈閉塞モデルの作製方法を説明します。それでは始めていきましょう。この実験は、まず縫合糸の準備から開始します。まず、縫合糸を 20 millimeter の長さに切断します。次に、縫合糸を電気焼灼器の方へ持っていくことで、先端を回転させます。その後、縫合糸の先端を測定します。これで、背面にマスクを配置した状態で手術を開始する準備が整いました。正中線に沿って切開します。ピンセットを使用してECAを露出させます。ECAに沿った外頸動脈には、多くの分枝が存在します。これらの分枝の一つが、上甲状腺動脈（STA）です。STAはバイポーラ鉗子で凝固させる必要があります。その後、STAを切断し、外頸動脈（ECA）をより適切に単離できるようにします。次に、ECAを凝固させ、CCAからできるだけ離れた位置に配置します。この時点で、操作性を向上させるためにECAを単離させることがあります。その後、ECAの周囲に2本の縫合糸を数ミリの間隔で緩く結びます。総頸動脈（CCA）から外頸動脈（ECA）および内頸動脈（ICA）に分枝する部位にクランプを適用します。次に、ECA断端の先端をクリップします。続いて、ECAをICAと整列するように再配置します。これにより、外頸動脈（ECA）から内頸動脈（ICA）まで縫合糸を連続的に挿入することが可能になります。挿入前に縫合糸の全長を測定してください。ECAの切り口をクリップで固定して作成した開口部に、縫合糸を挿入します。縫合糸が遠位側の結節を通過したら、締め付けて結節を固定します。次に、クランプを取り外し、縫合糸を外頸動脈（ECA）にさらに挿入します。縫合糸が近位側の結節を通過したら、締め付けて結節を固定します。両方の結び目を固定した後、縫合糸を動脈に沿って、縫合糸が9〜10 mm通過するまで慎重に挿入します。分枝点まで。これは、縫合糸の全長から分枝点までの縫合糸の長さを差し引くことで行えます。縫合糸がMCAの起始点に達するまで進めます。MCAを閉塞させる。24時間後、動物を犠牲にし、脳を摘出する。TTC染色のため、摘出した脳を型に入れ、カミソリでスライスする。次に、脳を2% TTCに浸し、室温で20分間放置します。最後に、脳を中性緩衝ホルマリンで一晩固定します。縫合糸の準備は繊細な工程です。以下に役立つヒントをいくつか示します。縫合糸と焼灼器をこのように配置してください。次に、焼灼器を固定したまま、ゆっくりと縫合糸を近づけます。続いて、縫合糸のサイズが適切であることを確認するために測定します。本実験で使用する縫合糸のサイズは約 0.21 から 0.22 Millimeters です。手術を開始するには、マスクを背面に当て、30% oxygenと70% nitrogenで麻酔を導入します。正中線に沿って切開し、リトラクターを用いて患部へのアクセス経路を確保します。このように見えるはずです。ピンセットを用いて組織を慎重に分離します。次に、ピンセットでECAを露出させ、単離します。ECAを単離する過程で、STAを凝固させて切断する必要があります。これにより、より長い距離のECAを単離することが可能になります。次に、バイポーラ鉗子を用いてECAを凝固させます。凝固後、ECAを切断します。続いて、ECAを単離し、ECAの周囲に2本の縫合糸を数ミリの間隔を空けて緩く結びます。結果として、このようになります。次に、総頸動脈（CCA）から内頸動脈（ICA）および外頸動脈（ECA）への分岐点にクランプを適用します。クランプがECAへの血流を完全に遮断していることを確認してください。その後、ECA断端をクリップで固定します。ECAに切開を加えた後、挿入前に縫合糸の長さを測定します。縫合糸を挿入し、遠位側の結節を越えて通します。縫合糸が遠位側の結節を通過したら、結節を締め付けます。次に、クランプを取り除きます。遠位側の結び目が確実であることを確認した後、縫合糸を近位側の結び目を超えてECAのさらに先まで挿入します。次に、近位側の結び目を締め上げます。次に、外頸動脈（ECA）に沿って、内頸動脈（ICA）へ慎重に縫合糸を挿入します。分岐点から9〜10 mm先に縫合糸が到達するまで、ICAに沿って挿入を続けてください。これは、縫合糸の全長から分岐点までの長さを差し引くことで確認できます。次に、周囲の組織を傷つけないように縫合糸を切り揃えます。その後、切開部を縫合し、マウスを回復させます。手術の24時間後にTTC染色を行う準備をします。まず、頸椎脱臼によりマウスを安楽死させます。次に、頭蓋骨から脳を取り出し、型に固定します。その後、カミソリでスライスし、2% TTCで室温にて20分間脳を染色します。その後、一晩固定し、メリン染色のために10%中性緩衝液に浸します。以上になります。ご視聴ありがとうございました。実験の成功をお祈りしております。

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