Name: La stimolazione cerebrale Slice Utilizzando una rete Microfluidic e della Camera di perfusione standard (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2007-10-01T00:00:00.000+00:00
Duration: 27 min 58 s
Description: Scopri la stimolazione di fette cerebrali con un dispositivo microfluidico modulare per elettrofisiologia. Questo metodo semplifica l'applicazione di neurotrasmettitori con controllo spaziale e temporale preciso.

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Il finanziamento è stato fornito dal NIH MH-64611 e NARSAD premio Young Investigator. Gli autori desiderano inoltre ringraziare Adam Beagley, Mark Dikopf, e Ben Smith, per la loro assistenza tecnica.

SU-8 stampo di fabbricazione Maestro preparazione <ol><li> Il SU-8 master sul substrato di wafer di silicio viene preparato utilizzando un due fasi di serie negativa resistere processo di litografia. </li><li> I segni di allineamento sul wafer di silicio vengono rimossi con una lametta come l&#39;altezza di queste strutture (che si trova lungo il perimetro esterno del wafer) è più che le strutture di dispositivo reale. </li><li> Il wafer di silicio viene poi pulita con alcool isopropilico e asciugato in un flusso di N 2. Pilastri di sostegno fatto di nastro con spessore inferiore della struttura più alta dispositivo sostituire i contrassegni di allineamento sui quattro lati del wafer. Nota: Se l&#39;altezza di supporto pilastri è più che le strutture di più alto dispositivo, attraverso i fori non si formano nello stampo PDMS. </li><li> Il wafer di silicio master è collocato su una piastra calda a temperatura ambiente. </li></ol> PDMS soluzione di preparazione <ol><li> Quattro grammi di polidimetilsilossano (PDMS) soluzione viene preparata grazie alla miscelazione 10 parti di elastomero di silicone con 1 parte di catalizzatore. Nota: Assicurarsi che le due soluzioni vengono mescolate in modo uniforme per ottenere simili proprietà fisiche in tutto lo stampo PDMS. </li><li> Le bolle generate nella soluzione PDMS durante il processo di miscelazione vengono rimossi con un essiccatore a vuoto. </li></ol> PDMS rivestimento e la cura <ol><li> La bolla senza soluzione di PDMS sta lentamente erogata sul SU-8 maestro assicurandosi che le bolle non sono generati durante il processo di erogazione. </li><li> Un termine di una scrittura su pellicola trasparente viene posto sulla piastra riscaldante e lentamente immessi sul PDMS soluzione per diffondere uniformemente il PDMS sul SU-8 master. Eventuali bolle d&#39;generati durante questo processo devono essere rimossi mediante una sonda. [Nota: Non sollevare la trasparenza per impedire la produzione di più bolle.] </li><li> Una lastra Borofloat è posto sulla parte superiore del foglio di trasparenza per applicare una pressione uniforme. Leggera pressione viene applicata sulla superficie superiore del più alto strutture circolari (che si trova a metà strada della lunghezza di canale e centrato tutta la larghezza dei canali) tale che non vi è minima o nessuna PDMS inserita tra la trasparenza e il SU-8 superficie della circolare strutture. </li><li> Tre lastre Borofloat più sono posti sulla parte superiore del sandwich di wafer di silicio-Borofloat lastra di applicare una pressione costante sulla superficie superiore delle strutture apertura circolare prima e durante il processo di polimerizzazione. </li><li> La temperatura della piastra calda viene poi aumentata a 75 ° C e il PDMS è curata a questa temperatura per 1 ora. La piastra calda è portato ad una temperatura di 50 ° C. </li><li> Le lastre vengono rimosse e la trasparenza viene delicatamente rimosso lasciando il master e il foglio sottile PDMS rivestito su di esso. </li></ol> La costruzione del dispositivo a microfluidi Rimozione del foglio PDMS da maestro <ol><li> Il confine esterno della camera di perfusione è scolpito sul foglio PDMS con una lama di rasoio dopo aver allineato le porte della camera di perfusione con i porti sul SU-8 master. </li><li> Il foglio PDMS viene poi delicatamente rimosso dal maestro, tirando su tutta la lunghezza dei canali per evitare strappi di PDMS. Il foglio PDMS è posizionato su un foglio trasparente con la superficie della rete microfluidica verso l&#39;alto. </li><li> Le porte di entrata e di uscita sono poi effettuata utilizzando un piralide del sughero. </li></ol> Incollaggio di fogli PDMS al vetro coprioggetto <ol><li> La superficie di incollaggio del foglio PDMS (la superficie che contiene la rete microfluidica) e un coprioggetto di vetro vengono poi delicatamente puliti con un nastro adesivo 3M, posta su un foglio di trasparenza e, infine, collocato nella camera 2 O plasma. </li><li> Le superfici interessate sono trattate con 165 Watt plasma per 10 s. La superficie trattata al plasma del vetrino di vetro è subito incollata alla superficie trattata al plasma del foglio PDMS. Nota: Applicare una leggera pressione sulla superficie del vetro per eliminare eventuali bolle d&#39;aria intrappolate tra le superfici di incollaggio. </li><li> A 5 minuti di ottenere una buona aderenza tra il PDMS e vetro. Dopo 5 minuti rimuovere delicatamente la trasparenza su cui è stato posto il foglio PDMS per il processo di incollaggio. </li><li> Il dispositivo a microfluidi viene inserito nel sistema di plasma di ossigeno per rendere i canali idrofili. Il trattamento al plasma è fatto a 165 Watt per 1 minuto. </li></ol> Integrazione di dispositivo a microfluidi e da camera perfusione Preparazione della camera di perfusione <ol><li> Un off-the-shelf camera di perfusione è stato ordinato, e le porte di ingresso e di uscita sono stati perforati in modo che quando il dispositivo microfluidica e la camera sono legati, le porte della camera e il dispositivo siano allineati. La superficie inferiore della camera di perfusione è rivestita con PDMS di ottenere una perfetta tenuta tra la camera e il dispositivo a microfluidi. </li><li> Una scrittura su un foglio trasparente viene posto su una piastra calda a temperatura ambiente. </li><li> Un grammo PDMS soluzione viene preparata in un processo simile a quello descritto in precedenza. La bolla senza soluzione di PDMS è poi lentamente erogato sulla generazione foglio trasparenza evitando di bolle. </li><li> La camera di perfusione viene posto sulla soluzione PDMS. </li><li> Una lastra Borofloat viene posto sulla parte superiore della camera di applicare una pressione uniforme e di ottenere uno strato sottile di PDMS sulla superficie inferiore della camera. </li><li> La temperatura della piastra calda viene poi aumentata a 75 ° C e il PDMS è curata a questa temperatura per 1 ora. </li></ol> Incollaggio di dispositivo a microfluidi e da camera perfusione <ol><li> La lastra viene rimosso e la trasparenza viene delicatamente rimosso lasciando la camera di perfusione e la sottile lamiera PDMS sulla sua superficie inferiore. Indesiderati PDMS è rimosso con una lama di rasoio e una sonda punta acuminata per la rimozione PDMS da porte di accesso. </li><li> La superficie PDMS del dispositivo microfluidica e la superficie inferiore PDMS della camera sono poi delicatamente puliti con un nastro 3M, posto su un foglio di trasparenza e, infine, collocato nella camera di plasma di ossigeno. </li><li> Le superfici sono trattate con 165 Watt plasma per 10 s. La superficie rivestita PDMS della camera è immediatamente incollata alla superficie PDMS del dispositivo a microfluidi. Nota: Applicare una leggera pressione sulla superficie del vetro per eliminare eventuali bolle d&#39;aria intrappolate tra le superfici di incollaggio. </li><li> Immediatamente prima dell&#39;uso, il dispositivo viene inserito nel sistema di plasma di ossigeno per rendere i canali idrofili. Il trattamento al plasma è fatto a 165 Watt per 1 minuto. </li></ol> L&#39;esposizione fettine di cervello di microambiente neurochimiche utilizzando il dispositivo a microfluidi <ol><li> Il microcanali idrofilo del (dispositivo a microfluidi) - (camera di perfusione) combinazione sono pieni di serie ACSF (Artificial fluido cerebro-spinale) soluzione. </li><li> Dispensare piccole gocce di soluzione ACSF nei porti di entrata e lasciare che la soluzione deve essere malvagio fino nei canali. Eliminare eventuali bolle d&#39;sinistra utilizzando una siringa dal foro di uscita. Dispensare una grossa goccia di soluzione ACSF alla porta di uscita per permettere il pompaggio passivo di fluidi da entrata a uscita del dispositivo microfluidica. Nota: Si deve prestare attenzione a rimuovere tutte le bolle dai canali per consentire il flusso dei fluidi utilizzando il metodo passivo di pompaggio. </li><li> Fissare il (dispositivo a microfluidi) - (camera di perfusione) combo nella piattaforma pianura e fissare la piattaforma comune nel adattatore per microscopio. </li><li> Collegare l&#39;ingresso standard e scarico (aspirazione) tubo alla camera di perfusione per perfusione continua della fetta cervello con soluzione standard ACSF. La soluzione ACSF è continuamente aspirato con il 95% O2-5% di CO 2. Nota: Regolare la posizione del tubo di aspirazione per mantenere costante il livello di ACSF nel bagno della camera di perfusione. </li><li> Una volta che la camera di perfusione è riempita con una soluzione ACSF, una fetta del cervello nella camera di perfusione con un contagocce. Utilizzando una sonda, la posizione la fetta cervello sopra le aperture circolari nel dispositivo microfluidica. Una volta che la fetta cervello è nella posizione desiderata sopra le aperture circolari, utilizzare un ancoraggio fetta per immobilizzare la fetta cervello. </li><li> Il dispositivo a microfluidi può ora essere utilizzato per esporre le fette di cervello (posto nella camera di perfusione e sulla parte superiore della rete microfluidica) per vari neurotrasmettitori utilizzando passiva pompaggio di fluidi. </li></ol>

<ol><li>Blake, A. J., Pearce, T. M., Rao, N. S., Johnson, S. M., Williams, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multilayer+PDMS+microfluidic+chamber+for+controlling+brain+slice+microenvironment%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">Multilayer PDMS microfluidic chamber for controlling brain slice microenvironment.</a> Lab on a Chip. 7, 842-849 (2007).</li>
<li>Walker, G. M., Beebe, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+passive+pumping+method+for+microfluidic+devices%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">A passive pumping method for microfluidic devices.</a> Lab on a Chip. 2, 131-134 (2002).</li>
</ol>

Gli autori sono aperti a collaborazioni che coinvolgono la tecnologia microfluidica dimostrato per diversi campi della biologia.

Macroscala esistenti o microscala perfusione cerebrale camere fetta sono limitati in termini di risoluzione spaziale che forniscono ad esporre fettine di cervello di neurotrasmettitori. La tecnologia microfluidica dispositivo dimostrato qui supera questa limitazione utilizzando semplici tecniche bioMEMS. Si prevede che la semplicità nella fabbricazione del dispositivo microfluidica e la facilità di integrazione con esistenti configurazioni elettrofisiologia permetterà l&#39;applicazione diffusa della tecnologia dei dispositivi dimostrata. E...

<table><tbody><tr><td>RC-26GPL</td><td>Strumento</td><td>Warner Instruments</td><td>W2-64-0236</td><td>Camera di registrazione a basso profilo con ampia vasca RC-26GLP</td></tr><tr><td>SHD-26GH/10</td><td>Strumento</td><td>Warner Instruments</td><td>W2-64-0253</td><td>Fermacampioni in acciaio inossidabile per RC-26G, passo filettatura 1,0 mm</td></tr><tr><td>PDMS (polidimetilsilossano)</td><td>Reagente</td><td>Dow Corning</td><td>Sylgard 184</td><td>Kit di elastomero al silicone</td></tr><tr><td>Plasma Preen-II 862</td><td>Strumento</td><td>Plasmatic Systems, Inc.</td><td></td><td>Sistema al plasma a microonde</td></tr><tr><td>Modello P-1</td><td>Strumento</td><td>Warner Instruments</td><td>W2-64-0277</td><td>Piattaforma liscia serie 20, modello P-1</td></tr><tr><td>SA-NIK</td><td>Strumento</td><td>Warner Instruments</td><td>W2-64-0291</td><td>Adattatore per Nikon Diaphot/TE200/TE2000, SA-NIK</td></tr><tr><td>ACSF (liquido cerebro-spinale artificiale) ossigenato e riscaldato</td><td>Reagente</td><td></td><td></td><td>La composizione esatta varia in base all'applicazione</td></tr></tbody></table>

la stimolazione cerebrale slice utilizzando una rete microfluidic e della camera di perfusione standard

Brain Slice Stimulation Using a Microfluidic Network and Standard Perfusion Chamber

Abbiamo dimostrato la realizzazione di due livelli dispositivo a microfluidi che possono essere facilmente integrati con configurazioni elettrofisiologia esistenti. I due livelli dispositivo a microfluidi è fabbricato con un passo a due di serie negativa resistere processo di litografia 1. Il primo livello contiene microcanali con aspirazione e scarico ad ogni estremità. Il secondo livello contiene microscala fori circolari trova a metà strada della lunghezza di canale e centrato con larghezza del canale. Passiva metodo di pompaggio è utilizzato per pompare fluidi dal tubo di ingresso alla porta di uscita 2. Il dispositivo a microfluidi è integrato con off-the-shelf camere di perfusione e consente una perfetta integrazione con l&#39;impostazione di elettrofisiologia. I fluidi presentata al flusso di ingresso porte attraverso i microcanali verso i porti di uscita e di fuga attraverso le aperture circolari situato sulla parte superiore del microcanali nel bagno della perfusione. Così la superficie inferiore della fetta cervello nel bagno camera di perfusione e sopra il dispositivo a microfluidi può essere esposto con i neurotrasmettitori diversi. Lo spessore del dispositivo microscala microfluidica e trasparente la natura dei materiali [vetro coprioggetto e PDMS (polidimetilsilossano)] usato per fare il dispositivo a microfluidi permettono microscopia della fetta cervello. Il dispositivo a microfluidi consente la modulazione (sia spaziale e temporale) degli stimoli chimici introdotti microambienti fetta del cervello.

Dimostriamo realizzazione di un semplice dispositivo a microfluidi che possono essere integrati con standard di configurazioni di elettrofisiologia per esporre superfici microscala di una fetta del cervello in un modo ben controllata da diversi neurotrasmettitori.

La stimolazione cerebrale Slice Utilizzando una rete Microfluidic e della Camera di perfusione standard

Abbiamo dimostrato la fabbricazione di un dispositivo microfluidico a due livelli che può essere facilmente integrato con le configurazioni di elettrofisiologia esistenti. Il...

L'obiettivo principale del progetto che vi mostreremo oggi è quello di poter controllare in modo spaziale e temporale la stimolazione cerebrale. Un altro punto fondamentale è che, grazie a una semplice modifica dell'ormai complesso apparato elettrofisiologico, possiamo diffondere questo dispositivo microfluidico tra i vari laboratori che utilizzano effettivamente questa stimolazione cerebrale in condizioni vitali. Salve, sono Java Chek Mohammad del laboratorio Edington del Dipartimento di Bioingegneria dell'Università dell'Illinois a Chicago.Oggi vi mostrerò come applicare un semplice dispositivo microfluidico microfabbricato per la stimolazione di fette cerebrali. Il dispositivo per fette cerebrali che andremo a dimostrare oggi è molto utile per diversi motivi, e i motivi principali sono la sua modularità, che permette di integrarlo facilmente in un setup elettrofisiologico esistente senza ulteriori modifiche, e il fatto che evita l'uso di tubicini e pompe, elementi che complicano qualsiasi dispositivo microfluidico.E poiché stiamo utilizzando il metodo di pompaggio passivo, non abbiamo bisogno di tubi né di pompe. E la terza cosa è che si tratta semplicemente di un sottile foglio

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Applicando Microfluidica di Elettrofisiologia

Questo documento introduce un approccio di combinare fotostimolazione scansione laser con registrazioni cellula intera in topi transgenici che esprimono GFP in popolazioni limitate neuroni inibitori. La tecnica permette per la mappatura estesa e analisi quantitativa dei locali circuiti sinaptici di specifici neuroni inibitori corticali.

Mappatura dei circuiti neuronali inibitori da fotostimolazione scansione laser

Questo video delinea un metodo per l'imaging e la registrazione simultanea dell'attività elettrica da fette di cervello transgenico che contengono proteine fluorescenti specifiche per i neuroni. La procedura prevede il mantenimento della fetta di cervello in una camera di perfusione con liquido cerebrospinale artificiale aerato, l'utilizzo di una sorgente luminosa per eccitare le cellule marcate con fluorescenza e la registrazione dei segnali elettrici con una sonda multicanale e un patch clamp.

Monitoraggio ottico ed elettrofisiologico simultaneo delle cellule neuronali in fette di cervello

Abbiamo sviluppato un modello fetta cervello che può essere usato per esaminare meccanismi molecolari coinvolti nel trauma cranico eccitotossicità mediata. Questa tecnica genera tessuto cerebrale maturo vitale e riduce il numero di animali necessari per la sperimentazione, pur mantenendo la circuiteria neuronale, interazioni cellulari e compartimenti post-sinaptici in parte intatto.

Eccitotossica stimolazione del cervello Microslices come<em&gt; In vitro</em&gt; Modello di Corsa

Le registrazioni di patch-clamp e il riempimento simultaneo di biocitina intracellulare di neuroni accoppiati sinapticamente in fette cerebrali acute consentono un'analisi correlata delle loro proprietà strutturali e funzionali. Lo scopo di questo protocollo è quello di descrivere le fasi tecniche essenziali della registrazione elettrofisiologica da microcircuiti neuronali e la loro successiva analisi morfologica.

Elettrofisiologici e morfologica Caratterizzazione neuronali Microcircuiti in Acute Fette cervello Utilizzando accoppiati di patch-clamp Recordings

Questo protocollo descrive la stabilizzazione del livello di ossigeno in un piccolo volume di tampone riciclato e aspetti metodologici della plasticità sinaptica attività-dipendente di registrazione in fettine ippocampali acute sommersi.

Registrazione di plasticità sinaptica in fettine ippocampali Acute mantenuti in un piccolo volume riciclaggio - aspersione- e sistema di immersione-tipo camera

Vi illustriamo come eseguire registrazione ed elettrica modulazione di attività epileptiform indotta da 4-aminopyridine in fettine di cervello del roditore utilizzando matrici microelettrodo. Una camera di registrazione personalizzata mantiene la vitalità del tessuto durante prolungate sessioni sperimentali. Live mapping di elettrodo e selezione di coppie stimolante sono eseguite da un'interfaccia di utente grafica personalizzata.

Registrazione e modulazione di attività Epileptiform in fettine di cervello del roditore accoppiate a matrici di microelettrodi

Microglia, le cellule immunitarie residente del cervello, di rispondere rapidamente con i cambiamenti morfologici a modificazioni del loro ambiente. Questo protocollo viene descritto come utilizzare microscopia del due-fotone per studiare l'attrazione dei processi microglial verso la serotonina o ATP nelle fette acuta del cervello dei topi.

Imaging del due-fotone di attrazione dei processi Microglial verso ATP o serotonina nelle fette del cervello acuto

Questo protocollo descrive la preparazione di fette orizzontali di corteccia ippocampale-entorinale (HEC) da topi che mostrano un'attività spontanea di increspatura ad onda acuta. Le fette vengono incubate in una camera di tenuta dell'interfaccia semplificata e le registrazioni vengono eseguite in condizioni sommerse con liquido cerebrospinale artificiale a flusso rapido per promuovere l'ossigenazione dei tessuti e l'emergere spontaneo di attività a livello di rete.

Affezione cerebrale acuta del topo per indagare sull'attività spontanea della rete ippocampale

Qui, descriviamo un protocollo per l'utilizzo di sistemi di array di microelettrodi ad alta densità di semiconduttori a ossido di metallo complementare (CMOS-HD-MEAs) per registrare l'attività simile a un sequestro da fette di cervello ex vivo .

Attività simile a una crisi epilettica di alta qualità da fette cerebrali acute utilizzando un sistema di array di microelettrodi ad alta densità a semiconduttore di ossido di metallo complementare

Scopri la stimolazione di fette cerebrali con un dispositivo microfluidico modulare per elettrofisiologia. Questo metodo semplifica l'applicazione di neurotrasmettitori con controllo spaziale e temporale preciso.

La stimolazione cerebrale Slice Utilizzando una rete Microfluidic e della Camera di perfusione standard

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