Name: 組換えアデノ随伴ウイルスベクターの産生と力価測定 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-11-27T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 35 s
Description: 学ぶ rAAVベクターの産生とヘパリンカラムクロマトグラフィーによる精製法。HEK293細胞を用いた遺伝子導入と蛍光顕微鏡による力価測定の手法を解説し、in vivo研究への応用を示します。

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次のプロトコルをまとめた図は、図1を参照してください。 安全上の注意：組み立てられたウイルス粒子と接触しているすべての材料はVirkon液または他の適切な消毒剤で消毒する必要がある。 1。プラスミドDNAの株式の準備（〜2日間） <ol><li>以下のプラスミドが1必要です。 <ul><li> pRV1 - AAV2 repおよびcap配列を含有する</li><li> PH21 - AAV1 repおよびcap配列を含有する</li><li> pFdelta6 - アデノウイルスヘルパープラスミド</li><li> AAV2パッケージングシグナル（逆方向末端反復、ITRS）に挟まれた組換え発現カセットを含むプラスミドAAV </li></ul></li><li> pFdelta6が部分欠失を防ぐためにStbl2コンピテントセルで成長させる必要がありますが、pRV1とPH21はDH5alphaコンピテントセルに成長させることができる。部分的な削除がDH5alpha細胞内で発生した場合はAAVプラスミドはStbl2細胞に成長させることができる。 </li><li>プラスミドDNAは高品質とRNAの汚染物質の自由でなければならない。プラスミドは、次のダイジェストを使用して整合性をスクリーニングすることができます。 <ul><li> pRV1 - XbaIで消化7.5キロバイトと3.8 kbのバンドを与えるために</li><li> PH21 - 4.5kbのバンドを与えるためにEcoRIで消化、2.8 kbと0.2キロバイト</li><li> pFdelta6 - 5.5kbのバンドを与えるためにHindIIIでダイジェスト、3 KB、3 KB、2.3 kbと1.5キロバイト</li></ul></li></ol> 2。 （ - 3日間2）トランスフェクションのためのヒト胚性腎臓293（HEK293）細胞の調製<ol><li>プレート2個の80％5 15cmの直径Nunc社製組織培養皿にHEK293細胞のコンフルエント150センチメートル2フラスコ。トランスフェクションの前にコンフルエント80％（めっき後約48時間） - 細胞は70でなければなりません。 10％ウシ胎児血清、100 U / mlのペニシリン/ 100μg/ mlのストレプトマイシンを含む低グルコースと標準ダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）で培養細胞。 </li><li>トランスフェクションの前に3時間は、DMEMを除去し、イスコフと交換の5％ウシ胎児血清を含む改変ダルベッコ培地（IMDM）。 </li></ol> 3。ウイルス性プラスミドのトランスフェクション（トランスフェクションのための〜1時間、インキュベーションのための3日間） <ol><li>ウイルスの単一のバッチ（5 × 15cmの組織培養プレート）のために、以下を準備します。 <ul><li>プラスミド62.5μgのAAV </li><li> 125μgのpFdelta6 </li><li> 31.25μgのpRV1 </li><li> 31.25μgのPH21 </li><li> 1650μlの2.5 M CaCl 2を </li><li> 12ミリリットルのdH 2 O </li></ul></li><li> 50 mlチューブにクラス2の組織培養フード滅菌フィルタートランスフェクション混合物に。 </li><li>ソリューションをボルテックスながら、素早く液（pH 7.05）緩衝生理食塩水2 × HEPES 13 mlを加える。 50 mlチューブの蓋を交換し、15秒間ボルテックスし続けます。 1分45秒放置する、微細な白色沈殿物が形成すべきである。 </li><li>静かに各15cmの組織培養皿へのトランスフェクション溶液5mlを加える。スワールプレートが混在し、インキュベーターに戻ります。 </li><li>トランスフェクション後16時間は、IMD​​M培地を除去し、DMEMで置き換えてください。 </li></ol> 4。細胞の溶解とrAAVsの収穫（2時間） <ol><li>トランスフェクション後72時間は、細胞培養プレートから培地を除去し捨てる。すべての廃棄物は、Virkon液または他の適切な消毒剤で処理する必要があります。 </li><li>ゆっくりと（; pH7.4のPBS）緩衝生理食塩水暖かい1 ×リン酸で細胞を洗浄。 </li><li>各プレートに25ミリリットル温かいPBSを加え、穏やかにセルスクレーパーで細胞を取り除く。 50mlチューブ中で懸濁液を集める。 </li><li> 10分800 xgで細胞をペレット化する。 </li><li>上清と150mMのNaClでペレットを再懸濁します、20mMのトリスpH8.0を破棄し、組織培養プレートあたり10mlを使用してください。 2つの50 mlチューブに分割。 </li><li>のdH 2 Oで10％のデオキシコール酸ナトリウムの新鮮な溶液を調製します最終濃度0.5％のために各チューブには、この1.25 mlを加え。 ml当たり50単位の最終濃度にベンゾナーゼヌクレアーゼを追加。徹底的にチューブを混ぜる。 </li><l><li> 15分間3000 × gで遠心分離によって細胞残屑を取り除きます。新鮮な50 mlチューブに移す、すべての細胞の破片がヘパリンカラム（ステップ5を参照）がブロックされないように削除されていることを確認してください。この段階で、サンプルは、続行する前に-20℃で保存することができます。我々は、感染性を低下させることなく-20℃で数週間サンプルを保存している。 </li></l></ol> 5。 rAAVsのヘパリンカラム精製（2 - 3時間） <ol><li>そのソリューションが流れそう〜5.4ステップ5.2の毎分1 mlのカラムを通して蠕動ポンプを使用してセットアップハイトラップのヘパリンカラム。に気泡がヘパリンカラムに導入されていないことを確認することが重要です。 </li><li> 10ミリリットル150mMのNaCl、20mMトリス、pH8.0でカラムを平衡化する。 </li><li>カラムを50 mlのウイルス液を適用するとを通して流れるようになります。 </li><li> 20ミリリットル100mMのNaCl、20mMトリス、pH8.0でカラムを洗浄。 </li><li> 5 mlのシリンジを使用すると、列wを洗浄し続けます1ミリリットル300mMのNaCl、20mMトリス、pH8.0のに続いてi番目の1ミリリットル200mMのNaCl、20mMのトリス、pH8.0、。フロースルーを捨てる。 </li><li>適用することにより、カラムから5mlの注射器と穏やかな圧力の溶出ウイルスを使用する： <ul><li> 1.5ミリリットル400mMのNaCl、20mMのトリス、pH8.0の</li><li> 3.0ミリリットル450 mMのNaCl、20mMトリス、pH8.0の</li><li> 1.5ミリリットル500mMのNaCl、20mMトリス、pH8.0の</li><li> 15 ml遠心チューブに、これらを収集する。 </li></ul></li></ol> 6。濃度とrAAVsの無菌濾過（1時間） <ol><li> 10万分子量カットオフを持つアミコンウルトラ-4遠心フィルターユニットを使用してベクトルを集中する。 2分（室温で）2000 xgでコンセントレータと遠心分離機にカラム溶出液4mlをロードする。ろ過液を廃棄し、残りのウイルス液と繰り返し遠心分離でコンセントレータをリロードします。濃縮された量は約250μlのはずです。濃縮されたボリュームがこれよりかなり多い場合は、フローのtを捨てるhroughと体積が約250μlのようになるまで1分のステップで遠心し続けます。 </li><li> 500μlの最終容量のためにウイルスをPBS 250μlを加え、コンセントレータから取り外します。 </li><li> 13mmの直径0.2μmのシリンジフィルターを通してフィルターベクトル。必要になるまでベクトルを分注し、-80℃で保存してください。 </li></ol> 7。ウイルスストックのタイター（3日） これは、レポーター遺伝子または免疫細胞化学的に検出可能な遺伝子産物を駆動するHEK293細胞において活性であるプロモーターが必要です。 HEK293細胞他の細胞株または初代細胞培養と互換性のないベクトルを生成するときに使用することができます。 <ol><li>そう彼らが40であることをHEK293細胞を播種が18ポリ- L -リジンコートしたガラス製カバースリップまたはヌンクチャンバースライドの18の井戸を準備 - コンフルエント50％。 Creリコンビナーゼ依存rAAVsの滴定のためにその安定的に発現するCreリコンビナーゼ2 HEK293細胞を使用してください。 </li><li>シリアルDの各ウェルに感染AAVベクター（図2A）のilutions。希釈当たり3ウェルを使用してください。我々は日常的に各ウェルに直接ウイルスを追加。 </li><li>後72時間は、室温で10分のために培地（2％PFAの最終濃度を与える）に4％パラホルムアルデヒド（PFA）の等量を追加することで、HEK293細胞を修正。 </li><li>細胞をPBSで3回洗浄し、のdH 2 Oおよびカバースリップですすいでください。 </li><li>最高希釈係数を持つ3つの井戸から、形質導入された細胞の数を数えるが、それでも、感染した細胞が含まれ、これらの平均値を見つけ、マイクロリットルあたりの感染ユニット（図2B）の番号を与えるために希釈係数を掛けます。 </li></ol> 8。予想結果 HEK293細胞は、強化された緑色蛍光タンパク質（EGFP）を図2Bに示されているウイルスのエンコーディングで形質導入。我々は一般的にマイクロリットルあたり約6 × 10 6感染性粒子の一貫した力価を実現。我々は日常的に定位麟蹄のため、これらのベクターを使用成人の齧歯類の脳にction。これは、地域固有の遺伝子発現2の強力な技術を提供します。細胞型の選択的な遺伝子発現を持つこの地域の特異性を組み合わせるために、我々は、Cre -トランスジェニックマウス2のターゲット領域にCreリコンビナーゼ依存rAAVsを注入する。図2C - Eは、成人のパルブアルブミンのCreトランスジェニックマウス3の異なる脳領域にEGFPをエンコードするのCre依存rAAVsの定位注射の例を示します。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/3348/3348fig1.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図1"> 図1。するrAAVの生産のためのプロトコルの模式図。 1）HEK293細胞を播種し、70までに成長している - 80％コンフルエントに。 2）AAVとヘルパープラスミドを調製し、そしてHEK293細胞にトランスフェクトされています。トランスフェクションおよびHEK293細胞は別の56時間培養した後、3）培地は、DMEM、16時間に変更されます。 4）HEK293細胞を回収し、溶解されています。 rAAVベクターはcによって細胞残渣から分離されていますentrifugation。 5）ウイルス粒子が濃縮し、滅菌前にヘパリンカラムを通して精製されています。 6）HEK293細胞を24ウェルプレート上で増殖し、感染単位の数を決定するAAVベクターの連続希釈液で感染されています。 <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/3348/3348fig2.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図2"> 図2。タイターとrAAV1 / 2のin vivoアプリケーションで。ウイルス力価を測定するためのHEK293細胞の（A）のセットアップ。 HEK293細胞は、rAAVsの連続希釈液で形質導入されています。 C、感染していないコントロール、N、未希釈のウイルスストックを1μl。 （B）HEK293細胞はEGFPを発現するrAAVsに感染している。 （CE）ウイルスeGFPの発現は、Creを活性化rAAVsの定位注射後のパルブアルブミンのCreトランスジェニックマウスの別のターゲット地域でCreを発現神経細胞に限定されています。例の画像は（C）網様体視床と淡蒼球、（D）歯状回と海馬の（E）CA1領域におけるGFP免疫反応性を示しています。 DG、ドntate回、RT、視床網様核、GP、淡蒼球。スケールバー：B、500μmであり、C、100μm以下、D、100μm以下、E、500μmである。

<ol><li>Klugmann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((AAV-mediated+hippocampal+expression+of+short+and+long+Homer+1+proteins+differentially+affect+cognition+and+seizure+activity+in+adult+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Neurosciences%22%5BJournal%5D)">AAV-mediated hippocampal expression of short and long Homer 1 proteins differentially affect cognition and seizure activity in adult rats.</a> Molecular and Cellular Neurosciences. 28, 347-360 (2005).</li>
<li>Murray, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Parvalbumin-positive+CA1+interneurons+are+required+for+spatial+working+but+not+for+reference+memory%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Parvalbumin-positive CA1 interneurons are required for spatial working but not for reference memory.</a> Nature Neuroscience. 14, 297-299 (2011).</li>
<li>Hippenmeyer, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+developmental+switch+in+the+response+of+DRG+neurons+to+ETS+transcription+factor+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biology%22%5BJournal%5D)">A developmental switch in the response of DRG neurons to ETS transcription factor signaling.</a> PLoS Biology. 3, e159-e159 (2005).</li>
<li>Hauck, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+and+characterization+of+chimeric+recombinant+AAV+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Therapy%22%5BJournal%5D)">Generation and characterization of chimeric recombinant AAV vectors.</a> Molecular Therapy. 7, 419-425 (2003).</li>
<li>Halbert, C. L., Allen, J. M., Miller, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adeno-associated+virus+type+6+%28AAV6%29+vectors+mediate+efficient+transduction+of+airway+epithelial+cells+in+mouse+lungs+compared+to+that+of+AAV2+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Adeno-associated virus type 6 (AAV6) vectors mediate efficient transduction of airway epithelial cells in mouse lungs compared to that of AAV2 vectors.</a> Journal of Virology. 75, 6615-6615 (2001).</li>
<li>Blankinship, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+transduction+of+skeletal+muscle+using+vectors+based+on+adeno-associated+virus+serotype+6%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Therapy%22%5BJournal%5D)">Efficient transduction of skeletal muscle using vectors based on adeno-associated virus serotype 6.</a> Molecular Therapy. 10, 671-678 (2004).</li>
<li>Wu, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+amino+acid+changes+can+influence+titer%2C+heparin+binding%2C+and+tissue+tropism+in+different+adeno-associated+virus+serotypes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Single amino acid changes can influence titer, heparin binding, and tissue tropism in different adeno-associated virus serotypes.</a> Journal of Virology. 80, 11393-11397 (2006).</li>
<li>Dong, J. Y., Fan, P. D., Frizzell, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+analysis+of+the+packaging+capacity+of+recombinant+adeno-associated+virus%5BTitle%5D)+AND+%22Human+gene+therapy%22%5BJournal%5D)">Quantitative analysis of the packaging capacity of recombinant adeno-associated virus.</a> Human gene therapy. 7, 2101-2112 (1996).</li>
<li>Zolotukhin, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+and+purification+of+serotype+1%2C+2%2C+and+5+recombinant+adeno-associated+viral+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Production and purification of serotype 1, 2, and 5 recombinant adeno-associated viral vectors.</a> Methods. 1, 158-167 (2002).</li>
<li>Burova, E., Loffe, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromatographic+purification+of+recombinant+adenoviral+and+adeno-associated+viral+vectors%3A+methods+and+implications%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Therapy%22%5BJournal%5D)">Chromatographic purification of recombinant adenoviral and adeno-associated viral vectors: methods and implications.</a> Gene Therapy. 12, 5-17 (2005).</li>
<li>Zolotukhin, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recombinant+adeno-associated+virus+purification+using+novel+methods+improves+infectious+titer+and+yield%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Therapy%22%5BJournal%5D)">Recombinant adeno-associated virus purification using novel methods improves infectious titer and yield.</a> Gene Therapy. 6, 973-985 (1999).</li>
<li>Bilbao, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patterns+of+gene+expression+from+in+utero+delivery+of+adenoviral-associated+vector+serotype+1%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Gene+Therapy%22%5BJournal%5D)">Patterns of gene expression from in utero delivery of adenoviral-associated vector serotype 1.</a> Human Gene Therapy. 16, 678-684 (2005).</li>
<li>Pilpel, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((reproducible+transduction+of+select+forebrain+regions+by+targeted+recombinant+virus+injection+into+the+neonatal+mouse+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">reproducible transduction of select forebrain regions by targeted recombinant virus injection into the neonatal mouse brain.</a> Journal of Neuroscience Methods. 182, 55-63 (2009).</li>
<li>Mastakov, M. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combined+injection+of+rAAV+with+mannitol+enhances+gene+expression+in+the+rat+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Therapy%22%5BJournal%5D)">Combined injection of rAAV with mannitol enhances gene expression in the rat brain.</a> Molecular Therapy. 3, 225-232 (2001).</li>
<li>Fu, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-complementary+adeno-associated+virus+serotype+2+vector%3A+global+distribution+and+broad+dispersion+of+AAV-mediated+transgene+expression+in+mouse+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Therapy%22%5BJournal%5D)">Self-complementary adeno-associated virus serotype 2 vector: global distribution and broad dispersion of AAV-mediated transgene expression in mouse brain.</a> Molecular Therapy. 8, 911-917 (2003).</li>
<li>Ghosh, A., Yue, Y., Duan, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+Transgene+Reconstitution+with+Hybrid+Dual+AAV+Vectors+Carrying+the+Minimized+Bridging+Sequences%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Gene+Therapy%22%5BJournal%5D)">Efficient Transgene Reconstitution with Hybrid Dual AAV Vectors Carrying the Minimized Bridging Sequences.</a> Human Gene Therapy. 22, 77-83 (2011).</li>
<li>McCarty, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-complementary+AAV+vectors%3B+advances+and+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Therapy%22%5BJournal%5D)">Self-complementary AAV vectors; advances and applications.</a> Molecular Therapy. 16, 1648-1656 (2008).</li>
<li>Georgiadis, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((AAV-mediated+knockdown+of+peripherin-2+in+vivo+using+miRNA-based+hairpins%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Therapy%22%5BJournal%5D)">AAV-mediated knockdown of peripherin-2 in vivo using miRNA-based hairpins.</a> Gene Therapy. 17, 486-493 (2010).</li>
<li>Atasoy, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+FLEX+switch+targets+Channelrhodopsin-2+to+multiple+cell+types+for+imaging+and+long-range+circuit+mapping%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">A FLEX switch targets Channelrhodopsin-2 to multiple cell types for imaging and long-range circuit mapping.</a> The Journal of Neuroscience. 28, 7025-7030 (2008).</li>
<li>Guggenhuber, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((AAV+Vector-Mediated+Overexpression+of+CB1+Cannabinoid+Receptor+in+Pyramidal+Neurons+of+the+Hippocampus+Protects+against+Seizure-Induced+Excitoxicity%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">AAV Vector-Mediated Overexpression of CB1 Cannabinoid Receptor in Pyramidal Neurons of the Hippocampus Protects against Seizure-Induced Excitoxicity.</a> PLoS One. 5, e15707-e15707 (2010).</li>
<li>Lawlor, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+gene+delivery+and+selective+transduction+of+glial+cells+in+the+mammalian+brain+by+AAV+serotypes+isolated+from+nonhuman+primates%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+therapy+%3A+the+journal+of+the+American+Society+of+Gene+Therapy%22%5BJournal%5D)">Efficient gene delivery and selective transduction of glial cells in the mammalian brain by AAV serotypes isolated from nonhuman primates.</a> Molecular therapy : the journal of the American Society of Gene Therapy. 17, 1692-1702 (2009).</li>
<li>Chtarto, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tetracycline-inducible+transgene+expression+mediated+by+a+single+AAV+vector%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Therapy%22%5BJournal%5D)">Tetracycline-inducible transgene expression mediated by a single AAV vector.</a> Gene Therapy. 10, 84-94 (2003).</li>
<li>Han, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lack+of+humoral+immune+response+to+the+tetracycline+%28Tet%29+activator+in+rats+injected+intracranially+with+Tet-off+rAAV+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Therapy%22%5BJournal%5D)">Lack of humoral immune response to the tetracycline (Tet) activator in rats injected intracranially with Tet-off rAAV vectors.</a> Gene Therapy. 17, 616-625 (2010).</li>
</ol>

利害の衝突は宣言されません。

rAAVベクターは、動物でのin vivo研究にとってますます貴重になってきています。ここで、我々は企業へのウイルスの生産の高価なアウトソーシングを避けることで、この有用なベクトルの広範なアプリケーションを容易にすることができるrAAVsを製造するための簡単​​で安価なプロトコルを記述している。プロトコルは、（参考文献1に基づいて）等しい比4で、両方の親の血清型からキャプシドタンパク質を含むキメラrAAV1 / 2ベクトルの生産を説明します。ヘパリンカラムに結合することによって、rAAVベクターの精製は、AAV2キャプシドタンパク質の発現に依存していますが、ここで概説AAV1以外の血清型と組み合わせることができます。さらに、AAV6は減少親和性を持つものの、ヘパリンに結合することが報告されており、潜在的にこの手順5,6を用いてヘパリンカラムで精製することができます。それは他の血清型は、ヘパリンカラム溶出5,7のためのNaClの異なる濃度を必要とすること、しかし、注意すべきである。包装するrAAVのゲノムは5.2 KB 8までのパッケージング効率の大幅な削減と4.1と4.9キロバイトの間で最適であることが示された。導入遺伝子発現の細胞型特異的規制は通常、小型のAAV粒子内に収容することができる要素に作用する大きなシスによって達成されるので、このパッケージングの制限は、するrAAVのシステムの最大の欠点と見なすことができます。このような我々はむしろ、ステップ6.3に概説PBSを追加するよりも、1つ以上の500μlをバッチに250μlのに集中して、別のウイルスのバッチを組み合わせているAAVパッキンの制限に近い場合、パッケージの遺伝子をしようとするから生じるものなど、低力価のバッチを、克服するために。信頼性の高い細胞型特異形質導入は、パッケージングの限界を伸ばし避けるためのCre -ドライバーのマウスと、条件付きするrAAVカセット（下記参照）を組み合わせることにより達成することができます。 ノートの、このプロトコルは高いtの生産にわかりやすい指示を提供しようとしながらITERするrAAVは、それはヘパリンアフィニティークロマトグラフィーによる精製のためのAAV2キャプシドタンパク質の部分の存在を必要とする。 AAV2以外の血清型は、別の手順9を用いて精製する必要があります。ヘパリンカラム精製の ​​利点の一つは、それが塩化セシウム勾配10を使用して製造したものよりも大きい感染率を持つAAVベクターを生成すると考えられています。しかし、この方法にはいくつかの欠点もあります。例えば、ヘパリンに結合する他のタンパク質も精製されたウイルスストックで存在することができる。ヘパリン精製ベクターの親和性がベクトル力価10、特に興奮20または抑制性ニューロン（図2）のどちらをターゲットにする我々のアプローチの影響を受けることができるが、AAV介在導入遺伝子の発現のCre -誘発活性化を採用し、力価に依存しません。ヘパリンカラム精製に代わるものを使用するよりも高いウイルス力価と純粋な準備を生成するイオジキサノール密度勾配の使用、です。塩化セシウム勾配10。この方法は、純度99％11より大きいベクトルを生成するためにヘパリンカラム精製と組み合わせることができます。したがって、慎重な検討は、ウイルスの精製法は、その特定のダウンストリームアプリケーションに適しているのと、個々のグループによって行われる必要があります。 このプロトコルに関連付けられている最も一般的な問題は、低ウイルス力価である。私たちの経験では、これは通常、低トランスフェクション効率、またはヘパリンカラムからのウイルスの溶出にさかのぼることができます。すべてのトランスフェクションの材料は、トランスフェクション前に室温になっているはず、とテストのトランスフェクションは、各研究室に最適な条件を見つけるために実行する必要があります。トランスフェクションの他の方法は、リポフェクタミンなど、非常に効率的ですが、法外に高価になることができます。さらに、ヘパリンカラム溶出液の濃度とpHはヘパリンカラムwithoからビリオンの完全な溶出のために重要です。UTの損傷。もう一つの重要なポイントは、パッケージング細胞は組織培養皿の表面によく付着する必要があるということです。細胞が手順の実行中にいくつかの段階でデタッチした場合には、実験を終了し、細胞の新しいバイアルを解凍することをお勧めします。 げっ歯類における導入遺伝子発現の時空間制御が容易に正確な解剖学的ターゲティングと動物の発達段階によって達成されます。効率的なAAVによる遺伝子導入は、子宮内12,13で示されている。成人の脳では、定位注射した後するrAAV粒子に感染して領域のみならず、ウイルス力価の変化によってではなく、注入パラメータを変更することにより非常に大きなエリアに、非常に小さな対象地域から調整することができます。これらは、ボリュームとスピード注射のとウイルス懸濁液14とポリオールマンニトールのインクルードが。マンニトールは、全身するrAAVの注入15日以降の様々な組織の感染性を高めるために使用することができます&lt;/&gt;のSup。 するrAAV（約4.7 KB）のパッケージング能力は、おそらくこれらのウイルスベクターから発現することができる遺伝子の点では最も制限要因になります。しかし、最近の研究では、ウイルス粒子が同じセル16に感染するときに遺伝子発現を開始、これは部分的に別々のrAAVベクターに分割する大規模な遺伝子または発現カセットによって克服し、ブリッジング配列を導入することができることを示している。 rAAVベクターによって運ばれる遺伝子の発現レベルも大幅に自己無料のrAAVベクター17を使用することによって高めることができる。 rAAVベクターの定位注入は、地域固有の方法で遺伝子発現を誘導するための、迅速、安価で強力な方法を提供する。組み合わせでは第2世代のRNA干渉戦略の18 rAAVsはまた地域固有のダウン遺伝子ノックアウトのために使用することができます。 rAAVsは、回路や細胞の種類を達成するためのCreトランスジェニックマウスまたは細胞型特異的プロモーターと組み合わせることができます。例：TETシステムとのフィッティングrAAVsがウイルス媒介遺伝子発現22,23上に時間的なコントロールを追加しながら、高空間分解能2,19-21で遺伝子操作を可能にする特異的な遺伝子発現は、これらの例では、これらのベクトルの膨大な組合せの可能性を示し、今後数年間にわたってするrAAVベースの研究の急速な増加を予測。

<table border="1"><tbody><tr><td> 試薬の名前 </td><td> 会社 </td><td> カタログ番号 </td><td> コメント </td></tr><tr><td>アミコンウルトラ遠心フィルター</td><td>ミリポア</td><td> UFC810024 </td><td> 10万MWCO </td></tr><tr><td>ベンゾナーゼヌクレアーゼ</td><td>シグマアルドリッチ</td><td> E1014 </td><td></td></tr><tr><td> Dulbecoダルベッコ改変イーグル培地（DMEM） </td><td>インビトロジェン</td><td> 10567014 </td><td> 10％FCSおよび10単位/ mlのpenicillin/100μg/ mlのストレプトマイシンを補足</td></tr><tr><td> HEK293細胞</td><td>アメリカンタイプカルチャーコレクション</td><td> CRL - 1573 </td><td>通路に30未満を使用して、 </td></tr><tr><td> HEPES緩衝生理食塩水</td><td>シグマアルドリッチ</td><td> 51558 </td><td></td></tr><tr><td>ハイトラップヘパリンカートリッジ</td><td>シグマアルドリッチ</td><td> 54836 </td><td></td></tr><tr><td>イスコフ改変ダルベッコ培地</td><td>インビトロジェン</td><td> 12440-053 </td><td> 5％FCSを補足</td></tr><tr><td> 、デオキシコール酸ナトリウム</td><td>シグマアルドリッチ</td><td> D5670 </td><td>バッチごとに新鮮な溶液を作る</td></tr><tr><td> 15cmの組織培養皿</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td> 157150 </td><td></td></tr><tr><td> Stbl2コンピテントセル</td><td>インビトロジェン</td><td> 10268-019 </td><td></td></tr><tr><td> Virkonソリューション</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td> NC9821357 </td><td>廃棄が排出する前に一晩駆除を残す</td></tr></tbody></table> 表1。プロトコルに必要な具体的な試薬

組換えアデノ随伴ウイルスベクターの産生と力価測定

Production and Titering of Recombinant Adeno-associated Viral Vectors

近年、組換えアデノ随伴ウイルスベクターは、（AAV）動物におけるin vivo試験のためにますます貴重になっており、また現在は、人間の臨床試験で検証されています。野生型AAVは、パルボウイルス科ファミリの非病原性のメンバーと本質的に複製欠損である。幅広い伝達プロファイル、低免疫応答だけでなく、これらのベクトルで達成強いと永続的な導入遺伝子の発現は、それらのin vitroおよび in vivo遺伝子デリバリーのために人気があり、多目的なツールきました。 rAAVsは、簡単かつ安価に実験室で生産し、それらの良好な安全性プロファイルに基づいて行うことができます、一般的に低い安全​​性の分類が与えられます。ここで、我々はAAV1およびAAV2両方のキャプシドタンパク質を含むキメラrAAVsの生産とタイターのための方法を説明します。これらのいわゆるキメラベクターの使用は、親のような高力価の株式などの血清型（AAV1）と精製の両方の利点を兼ね備えアフィニティークロマトグラフィー（AAV2）による。これらのAAV血清型はすべてのAAV血清型の最も研究であり、そして個々に広い感染性のパターンを持っている。ここで説明するキメラベクターは、AAV1およびAAV2の感染特性を持つ必要がありますので、神経細胞、骨格筋、膵臓、特に腎臓を含む組織の広い範囲を、感染すると予想することができます。メソッドはここで説明するヘパリンカラム精製を使用して、方法は、塩化セシウム勾配を通じて遠心分離のような他の精製法、より高いウイルス力価とクリーンなウイルス製剤を得たと信じていた。さらに、我々はこれらのベクトルを迅速かつ容易に製造感染性粒子の数の正確な読みを与えるために滴定することができる方法について説明します。

組換えアデノ随伴ウイルス（rAAVs）ベクトルはのためにますます貴重になってきています<em&gt; in vivoで</em&gt;動物での試験。我々はrAAVsが実験室で製造することができるとどのようにこれらのベクトルが生成される感染性粒子の数の正確な読みを与えるために滴定することができる方法について説明します。

近年、組換えアデノ随伴ウイルス（AAV）ベクターは動物を用いたin vivo研究においてますます価値が高まっており、現在は...

この手順の目的は、効率的なin vitroまたはin vivoへの導入遺伝子伝達に向けた、組換えアデノ随伴ウイルス（rAAV）を作製することです。まず、導入遺伝子およびウイルス遺伝子をコードするDNAプラスミドをHEK 293細胞に導入します。その後、導入した細胞をスクレイピングし、溶解させて、構築されたrAAV粒子を回収します。次に、ヘパリンカラム精製により、細胞溶解液からR AAVsを精製します。最終ステップとして、ウイルスストックを濃縮します。最終的に、免疫蛍光顕微鏡観察により、ウイルスを介した強力かつ持続的な導入遺伝子発現が示されます。これで、RA AAVはin vitroまたはin vivoへの適用が可能な状態になります。塩化セシウム密度勾配遠心法などの他の精製法と比較して、本手法を用いる主な利点は、超遠心機や毒性物質を使用する必要がないことです。また、より高純度で収量多くのウイルスベクターを得ることができます。本プロトコルの開始前に、書面によるプロトコルの記載に従い、高品質なプラスミドおよびDNAストックを調製し、その完全性を確認してください。まず、80%コンフルエントな150 cm²フラスコ2本分のHEK 293細胞を、5枚の直径15 cmの組織培養ディッシュに播種し、細胞を培養します。培養には、10%胎児牛血清を含む低グルコース標準DMEMを使用してください。播種から約48時間後、トランスフェクション当日のトランスフェクション3時間前までに、細胞が70〜80%コンフルエントになっている必要があります。DMEMを除去し、氷冷した改良型CHO培地または5%胎児牛血清含有IMDMに置換します。書面によるプロトコルに従い、1バッチ分のウイルス用トランスフェクション混合液を調製します。クラス2組織培養フード内で、トランスフェクション混合液を50 mLチューブにステリルフイルターします。ボルテックスで撹拌しながら、2倍濃度のHBSSを13 mL迅速に加えます。50 milliliterチューブの蓋を閉め、さらに15秒間ボルテックスします。1分45秒間静置します。白い沈殿が形成されます。トランスフェクション溶液5 millilitersを、各15 centimeter組織培養ディッシュに緩やかに加えます。16時間インキュベートした後、プレートを軽く回して混ぜ合わせます。IMDMを除去してDMEMに交換し、引き続き細胞をインキュベートします。rAAVを回収します。細胞培養プレートから培地を除去します。トランスフェクションの72時間後に行い、廃棄物は常にvercon溶液またはその他の適切な消毒剤で処理してください。温めたリン酸緩衝生理食塩水で1回、細胞を穏やかに洗浄します。各プレートに25 millilitersの温めたPBSを加え、セルスクレイパーで細胞を優しく回収します。懸濁液を50 milliliterチューブに回収した後、800 times Gで10分間遠心分離し、細胞をペレット化します。上清を捨て、ペレットを再懸濁します。組織培養プレートあたり10 mLの150 mM塩化ナトリウム緩衝液を用い、懸濁液を2本の50 mLチューブに分けて分注します。次に、調製したばかりの10%デオキシコール酸ナトリウム溶液で細胞を溶解させます。その後、核酸を除去するためにベンゾヌクレアーゼを添加します。チューブを十分に混合した後、37 °Cで1時間インキュベートします。インキュベーション後、3000 ×gで15分間遠心分離し、細胞残渣を除去します。ヘパリンの詰まりを防ぐため、すべての細胞残渣が除去されていることを確認しながら、上清を新しい50 mLチューブに移します。r AAVs精製用のカラム。10 mLの塩化ナトリウム緩衝液をシリンジに入れ、ペリスタルティックポンプを用いてHiTrap Heparanカラムをセットアップし、溶液が1 mL/minの速度でカラムを流れるようにします。ヘパリンカラム内に気泡が入らないようにすることが重要です。150 millimolar 塩化ナトリウム緩衝液 10 milliliters でカラムを平衡化します。50 milliliters のウイルス溶液をカラムに適用し、溶液を流します。次に、100 millimolar 塩化ナトリウム緩衝液 20 milliliters でカラムを洗浄します。5 mLのシリンジを使用します。1 mLの20 mM塩化ナトリウム緩衝液でカラムを洗浄し、続いて1 mLの300 mM緩衝液で洗浄します。その際、流出液は廃棄してください。5 mLシリンジを用い、緩やかに圧力をかけながら、高塩濃度溶出バッファーを段階的に加えてカラムからウイルスを溶出させます。溶出液を15 mL遠心チューブに回収します。分止分子量（MWCO）100,000のAmCon Ultra 4遠心フィルターユニットを使用して、ベクターを濃縮します。カラム溶出液 4 mL を濃縮器に入れ、2000 ×g で 2 分間遠心分離します。遠心分離を繰り返した後、濃縮後の液量は約 250 µL になるはずです。ろ過液を捨て、残ったウイルス溶液を再び濃縮器に入れます。ウイルスに250 µLのPBSを加え、最終容量を500 µLにして濃縮機から取り出します。最終ステップとして、ストックウイルスを精製するため、13 mm径の0.2 µmシリンジフィルターでベクターをろ過します。Cree依存性R AAVのタイトレーションのため、HEC 2 9 3細胞を播種し、コンフルエンスが40〜50%になるように調整したポリリシンコートガラスカバースリップを18枚準備します。Creリコンビナーゼを安定的に発現するHEC 2 9 3細胞を使用します。書かれたプロトコルに従い、RAAVベクターの連続希釈液を各ウェルに感染させます。希釈段階ごとに3つのウェルを用い、72時間後に、培地に同 volumes の4%ホルムアルデヒドを加えて室温で10分間静置し、HEC 2 9 3細胞を固定します。その後、細胞をPBSで3回、蒸留水で1回洗浄します。最後に、封入剤を用いてカバーガラスをスライドグラス上に配置します。細胞面を下にしてください。感染細胞が認められるものの、希釈倍率が最も高い3つのウェルにおいて、トレレンチングされた細胞数を数えます。これらの平均値を求め、希釈倍率を掛けることで、1 µLあたりの感染単位数を算出します。強化緑色蛍光タンパク質をコードするウイルスを導入したHEC 2 9 3細胞を示します。通常、1 µLあたり約6×10⁶感染粒子という一定のタイターが得られます。ここでは、成体のparalbumin Creトランスジェニックマウスの異なる脳領域に、緑色蛍光タンパク質をコードするCre依存性rAAVを立体定位的に注入した例を示しています。ウイルスの緑色蛍光タンパク質の発現は、さまざまな標的領域においてCreを発現しているニューロンに限定されています。この例では、緑色蛍光タンパク質の免疫反応性が、網様視床、淡蒼球、および海馬の歯状回とCA1領域に示されています。この手法を習得すれば、適切に行うことで、ウイルスの作製に7〜8日、タイター測定に3日で完了させることができます。

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学と感染症

すべてのウイルスコード配列を欠く大容量のアデノウイルスベクターを生成するためのプロトコルが提示されます。ベクターゲノムに含まれる導入遺伝子のクローニングは、ホーミングエンドヌクレアーゼに基づいています。接着細胞として増殖した産生細胞および懸濁細胞におけるウイルス増幅は、トランスでウイルス遺伝子を提供するヘルパーウイルスに依存しています。...

ヒトアデノウイルス5型に基づく高容量アデノウイルスベクターのクローニングおよび大規模生産

ここでは、生成する効率的かつ再現性のある戦略、力価、およびアデノ随伴ウイルスベクターの品質管理バッチについて述べる。それは高価にベクトル準備を取得するユーザーをことができます (1013ベクトル ゲノム/mL x ≥ 1)...

生産・精製・ アデノ随伴ウイルスを用いたベクトルの品質管理

ここでは、細胞スタックで増殖した付着HEK 293細胞とアフィニティークロマトグラフィー精製を用いた研究用AAVベクターの大規模生産に関する詳細な手順を提供する。このプロトコルは一貫して&gt;1 x 1013...

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このプロトコルでは、AAV2ベクターは、バキュロ ウイルス...

バキュロウイルス昆虫細胞培養システムを用いたアデノ関連ウイルス(AAV)2ベクターの製造と精製のためのプロセス開発

組換えアデノ随伴ウイルス(rAAV)は、臨床および前臨床の遺伝子導入に広く使用されています。rAAVの用途としてはあまり評価されていませんが、精製を必要とせずに培養細胞を強力に形質導入できることです。rAAVに不慣れな研究者向けに、導入遺伝子カセットクローニング、粗ベクター産生、細胞培養形質導入のプロトコルを提供しています。...

未精製組換えアデノ随伴ウイルスベクターを用いた培養細胞における導入遺伝子発現

アデノ随伴ウイルスは浮遊細胞培養で産生され、二重ヨージキサノール密度勾配遠心分離によって精製されます。ウイルスの総収量を増やし、ウイルス沈殿のリスクを低減し、最終的なウイルス生成物をさらに濃縮するためのステップが含まれています。予想される最終力価は10,12 ウイルス粒子/mLに達し、前臨床 in vivo...

In vivoアプリケーションのためのヨジキサノール密度勾配遠心分離によるアデノ随伴ウイルスの浮遊培養産生と精製

ここでは、懸濁液HEK293細胞ベースのAAV生産プロトコルを提示し、その結果、商用ベンダーから研究目的で入手可能なコンポーネントを使用してベクターを生産するために必要な時間と労力を削減します。...

HEK293浮遊細胞を用いた高収率アデノ関連ベクターバッチの作製(英語)

この原稿では、最適化されたヘパリンベースのアフィニティークロマトグラフィー法を使用して、アデノ随伴ウイルスベクターを生成および精製するための詳細なプロトコルについて説明します。シンプルでスケーラブル、かつ費用対効果の高いアプローチを提供し、超遠心分離の必要性を排除します。得られたベクターは、高い純度と生物学的活性を示し、前臨床試験でその価値を証明しています。...

シングルステップおよび半自動ヘパリンアフィニティークロマトグラフィープロトコルによるアデノ随伴ウイルスベクターの単離

遺伝子治療の分野が進化し続ける中、これらの課題に対処できる革新的な方法の必要性が高まっています。ここでは、細胞工場プラットフォームを使用して高収量で高純度のAAVベクターを生成するプロセスを効率化し、 in vivo...

Cell Factory Platformを利用した高力価で高品質なアデノ随伴ウイルスベクターを生成するための合理化および標準化された手順

アデノ随伴ウイルス(AAV)ベクターゲノムコピーの正確な定量は重要ですが、標準化されたプロトコルはまだ確立されていません。このプロトコールでは、精製されたAAVサンプルを調製し、デジタル液滴ポリメラーゼ連鎖反応(dd_PCR)を実施してウイルスゲノムの力価を確実に定量するための検証済みの方法について説明します。...

デジタル液滴ポリメラーゼ連鎖反応による精製ベクターサンプル中のアデノ随伴ウイルスゲノムの定量(英語)

学ぶ rAAVベクターの産生とヘパリンカラムクロマトグラフィーによる精製法。HEK293細胞を用いた遺伝子導入と蛍光顕微鏡による力価測定の手法を解説し、in vivo研究への応用を示します。

組換えアデノ随伴ウイルスベクターの産生と力価測定

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