Name: Twee Soorten Assays voor het detecteren van Kikker Sperma chemoattractie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-12-27T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 2 s
Description: Leer twee methoden voor het detecteren van spermachemo-attractie bij kikkers met accumulatie- en tracking-assays. Deze technieken kwantificeren spermatozoënmigratie en zwemgedrag voor fertilisatieonderzoek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Wij danken de WM Keck BioImaging Laboratorium voor gebruik van hun video-microscopie werkplek. Dit onderzoek werd ondersteund door NSF subsidie ​​IBN-0615435.

<ol><li>Ward, G. E., Brokaw, C. J., Garbers, D. L., Vacquier, V. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemotaxis+of+Arbacia+punctulata+spermatozoa+to+resact%2C+a+peptide+from+the+egg+jelly+layer%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Chemotaxis of Arbacia punctulata spermatozoa to resact, a peptide from the egg jelly layer.</a> J. Cell Biol. 101, 2324-2329 (1985).</li>
<li>Olivera, R. G., Tomasi, L., Rovasio, R. A., Giojalas, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+velocity+and+induction+of+chemotactic+response+in+mouse+spermatozoa+by+follicular+and+oviductal+fluids%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Reprod.+Fertil%22%5BJournal%5D)">Increased velocity and induction of chemotactic response in mouse spermatozoa by follicular and oviductal fluids.</a> J. Reprod. Fertil. 115, 23-27 (1999).</li>
<li>Fabro, G., Rovasio, R. A., Civalero, S., Frenkel, A., Caplan, S. R., Eisenbach, M., Giojalas, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemotaxis+of+capacitated+rabbit+spermatozoa+to+follicular+fluid+revealed+by+a+novel+directionality-based+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Biol.+Reprod%22%5BJournal%5D)">Chemotaxis of capacitated rabbit spermatozoa to follicular fluid revealed by a novel directionality-based assay.</a> Biol. Reprod. 67, 1565-1571 (2002).</li>
<li>Sugiyama, H., Burnett, L., Xiang, X., Olson, J., Willis, S., Miao, A., Akema, T., Bieber, A. L., Chandler, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+and+multimer+formation+of+allurin%2C+a+sperm+chemoattractant+from+Xenopus+laevis+egg+jelly%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Reprod.+Dev%22%5BJournal%5D)">Purification and multimer formation of allurin, a sperm chemoattractant from Xenopus laevis egg jelly.</a> Mol. Reprod. Dev. 76, 527-536 (2009).</li>
<li>Al-Anzi, B., Chandler, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Xenopus+laevis+egg+jelly+releases+a+sperm+chemoattractant+during+spawning%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Xenopus laevis egg jelly releases a sperm chemoattractant during spawning.</a> Dev. Biol. 198, 366-375 (1998).</li>
<li>Ralt, D., Goldenberg, M., Fetterolf, P., Thompson, D., Dor, J., Mashiach, S., Garbers, D. L., Eisenbach, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sperm+attraction+to+a+follicular+factor%28s%29+correlates+with+human+egg+fertilizability%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Sperm attraction to a follicular factor(s) correlates with human egg fertilizability.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 88, 2840-2844 (1991).</li>
<li>Gakamsky, A., Schechtman, E., Caplan, S. R., Eisenbach, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+chemotaxis+when+the+fraction+of+responsive+cells+is+small--application+to+mammalian+sperm+guidance%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Analysis of chemotaxis when the fraction of responsive cells is small--application to mammalian sperm guidance.</a> Int. J. Dev. Biol. 52, 481-487 (2008).</li>
<li>Böhmer, M., Van, Q., Weyand, I., Hagen, V., Beyermann, M., Matsumoto, M., Hoshi, M., Hildebrand, E., Kaupp, U. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ca2%2B+spikes+in+the+flagellum+control+chemotactic+behavior+of+sperm%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Ca2+ spikes in the flagellum control chemotactic behavior of sperm.</a> EMBO J. 24, 2741-2752 (2005).</li>
<li>Shiba, K., Baba, S. A., Inoue, T., Yoshida, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ca2%2B+bursts+occur+around+a+local+minimal+concentration+of+attractant+and+trigger+sperm+chemotactic+response%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Ca2+ bursts occur around a local minimal concentration of attractant and trigger sperm chemotactic response.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 19312-19317 (2008).</li>
<li>Burnett, L. A., Sugiyama, H., Bieber, A. L., Chandler, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Egg+jelly+proteins+stimulate+directed+motility+in+Xenopus+laevis+sperm%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Reprod.+Dev%22%5BJournal%5D)">Egg jelly proteins stimulate directed motility in Xenopus laevis sperm.</a> Mol. Reprod. Dev. 78, 450-462 (2011).</li>
<li>Abaigar, T., Barbero, J., Holt, W. V. Trajectory variance and autocorrelations within single sperm tracks as population level descriptors of sperm track complexity, predictability and energy generating ability. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aAbaigar%2C+T+%22J.+Androl%22">J. Androl</a>. , Forthcoming (2011).</li>
<li>Mortimer, S. T., Swan, M. A., Mortimer, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fractal+analysis+of+capacitating+human+spermatozoa%5BTitle%5D)+AND+%22Hum.+Reprod%22%5BJournal%5D)">Fractal analysis of capacitating human spermatozoa.</a> Hum. Reprod. 11, 1049-1054 (1996).</li>
<li>Guerrero, A., Carneiro, J., Pimentel, A., Wood, C. D., Corkidi, G., Darszon, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Strategies+for+locating+the+female+gamete%3A+the+importance+of+measuring+sperm+trajectories+in+three+spatial+dimensions%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Hum.+Reprod%22%5BJournal%5D)">Strategies for locating the female gamete: the importance of measuring sperm trajectories in three spatial dimensions.</a> Mol. Hum. Reprod. 17, 511-523 (2011).</li>
<li>Yoshida, M., Yoshida, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sperm+chemotaxis+and+regulation+of+flagellar+movement+by+Ca2%2B%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Hum.+Reprod%22%5BJournal%5D)">Sperm chemotaxis and regulation of flagellar movement by Ca2+.</a> Mol. Hum. Reprod. 17, 457-465 (2011).</li>
<li>Spehr, M., Schwane, K., Riffell, J. A., Zimmer, R. K., Hatt, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Odorant+receptors+and+olfactory-like+signaling+mechanisms+in+mammalian+sperm.Mol%5BTitle%5D)+AND+%22Cell.+Endocrinol%22%5BJournal%5D)">Odorant receptors and olfactory-like signaling mechanisms in mammalian sperm.Mol.</a> Cell. Endocrinol. 250, 128-136 (2006).</li>
<li>Veitinger, T., Riffell, J. R., Veitinger, S., Nascimento, J. M., Triller, A., Chandsawangbhuwana, C., Schwane, K., Geerts, A., Wunder, F., Berns, M. W., Neuhaus, E. M., Zimmer, R. K., Spehr, M., Hatt, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemosensory+Ca2%2B+dynamics+correlate+with+diverse+behavioral+phenotypes+in+human+sperm%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Chemosensory Ca2+ dynamics correlate with diverse behavioral phenotypes in human sperm.</a> J. Biol. Chem. 286, 17311-17325 (2011).</li>
<li>Tholl, N., Naqvi, S., McLaughlin, E., Boyles, S., Bieber, A. L., Chandler, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Swimming+of+Xenopus+laevis+sperm+exhibits+multiple+gears+and+its+duration+is+extended+by+egg+jelly+constituents%5BTitle%5D)+AND+%22Biol.+Bull%22%5BJournal%5D)">Swimming of Xenopus laevis sperm exhibits multiple gears and its duration is extended by egg jelly constituents.</a> Biol. Bull. 220, 174-185 (2011).</li>
<li>Eisenbach, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sperm+chemotaxis%5BTitle%5D)+AND+%22Rev.+Reprod%22%5BJournal%5D)">Sperm chemotaxis.</a> Rev. Reprod. 4, 56-66 (1999).</li>
<li>Riffell, J. A., Zimmer, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sex+and+flow%3A+the+consequences+of+fluid+shear+for+sperm-egg+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Biol%22%5BJournal%5D)">Sex and flow: the consequences of fluid shear for sperm-egg interactions.</a> J. Exp. Biol. 210, 3644-3660 (2007).</li>
<li>Corkidi, G., Taboada, B., Wood, C. D., Guerrero, A., Darszon, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tracking+sperm+in+three-dimensions%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem.+Biophys.+Res.+Commun%22%5BJournal%5D)">Tracking sperm in three-dimensions.</a> Biochem. Biophys. Res. Commun. 373, 125-129 (2008).</li>
<li>Himes, J. E., Riffell, J. A., Zimmer, C. A., Zimmer, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sperm+chemotaxis+as+revealed+with+live+and+synthetic+eggs%5BTitle%5D)+AND+%22Biol+Bull%22%5BJournal%5D)">Sperm chemotaxis as revealed with live and synthetic eggs.</a> Biol Bull. 220, 1-5 (2011).</li>
<li>Sun, F., Giojolas, L. C., Rovasio, R. A., Tur-Kaspa, I., Sanchez, R., Eisenbach, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lack+of+species-specificity+in+mammalian+sperm+chemotaxis%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Lack of species-specificity in mammalian sperm chemotaxis.</a> Dev. Biol. 255, 423-427 (2003).</li>
<li>Guidobaldi, H. A., Teves, M. E., Uñates, D. R., Anastasía, A., Giojalas, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Progesterone+from+the+cumulus+cells+is+the+sperm+chemoattractant+secreted+by+the+rabbit+oocyte+cumulus+complex%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Progesterone from the cumulus cells is the sperm chemoattractant secreted by the rabbit oocyte cumulus complex.</a> PLoS One. 3, e3040-e3040 (2008).</li>
<li>Oren-Benaroya, R., Orvieto, R., Gakamsky, A., Pinchasov, M., Eisenbach, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+sperm+chemoattractant+secreted+from+human+cumulus+cells+is+progesterone%5BTitle%5D)+AND+%22Hum.+Reprod%22%5BJournal%5D)">The sperm chemoattractant secreted from human cumulus cells is progesterone.</a> Hum. Reprod. 23, 2339-2345 (2008).</li>
<li>Teves, M. E., Guidobaldi, H. A., Uñates, D. R., Sanchez, R., Miska, W., Publicover, S. J., Morales Garcia, A. A., Giojalas, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+mechanism+for+human+sperm+chemotaxis+mediated+by+progesterone%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Molecular mechanism for human sperm chemotaxis mediated by progesterone.</a> PLoS One. 4, 8211-82 (2009).</li>
<li>Blengini, C. S., Teves, M. E., Uñates, D. R., Guidobaldi, H. A., Gatica, L. V., Giojalas, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+sperm+pattern+of+movement+during+chemotactic+re-orientation+towards+a+progesterone+source%5BTitle%5D)+AND+%22Asian+J.+Androl%22%5BJournal%5D)">Human sperm pattern of movement during chemotactic re-orientation towards a progesterone source.</a> Asian J. Androl. 13, 769-773 (2011).</li>
<li>Strünker, T., Goodwin, N., Brenker, C., Kashikar, N. D., Weyand, I., Seifert, R., Kaupp, U. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+CatSper+channel+mediates+progesterone-induced+Ca2%2B+influx+in+human+sperm%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The CatSper channel mediates progesterone-induced Ca2+ influx in human sperm.</a> Nature. 471, 382-386 (2011).</li>
<li>Lishko, P. V., Botchkina, I. L., Kirichok, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Progesterone+activates+the+principal+Ca2%2B+channel+of+human+sperm%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Progesterone activates the principal Ca2+ channel of human sperm.</a> Nature. 471, 387-391 (2011).</li>
<li>Boyden, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+chemotactic+effect+of+mixtures+of+antibody+and+antigen+on+polymorphonuclear+leucocytes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Med%22%5BJournal%5D)">The chemotactic effect of mixtures of antibody and antigen on polymorphonuclear leucocytes.</a> J. Exp. Med. 115, 453-465 (1962).</li>
<li>Zigmond, S. H., Lauffenburger, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assays+of+leukocyte+chemotaxis%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Med%22%5BJournal%5D)">Assays of leukocyte chemotaxis.</a> Annu. Rev. Med. 37, 149-155 (1986).</li>
<li>Villanueva-Diaz, C., Vadillo-Ortega, F., Kably-Ambe, A., Diaz-Pérez, M. A., Krivitzky, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+that+human+follicular+fluid+contains+a+chemoattractant+for+spermatozoa%5BTitle%5D)+AND+%22Fertil.+Steril%22%5BJournal%5D)">Evidence that human follicular fluid contains a chemoattractant for spermatozoa.</a> Fertil. Steril. 54, 1180-1182 (1990).</li>
<li>Villanueva-Diaz, C., Arizs-Martinez, J., Bermejo-Martinez, L., Vadillo-Ortega, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Progesterone+induces+human+sperm+chemotaxis%5BTitle%5D)+AND+%22Fertil.+Steril%22%5BJournal%5D)">Progesterone induces human sperm chemotaxis.</a> Fertil. Steril. 64, 1183-1188 (1995).</li>
<li>Olson, J., Xiang, X., Ziegert, T., Kittleson, A., Rawls, A., Bieber, A., Chandler, D. E. A. llurin <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((a+21+kD+sperm+chemoattractant+from+Xenopus+egg+jelly%2C+is+homologous+to+mammalian+sperm-binding+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">a 21 kD sperm chemoattractant from Xenopus egg jelly, is homologous to mammalian sperm-binding proteins.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98, 11205-11210 (2001).</li>
</ol>

Geen belangenconflicten verklaard.

Chemotaxis van cellen verplaatsen door een van beide amoeboid beweging of flagella-powered zwemmen is te vinden in vele biologische contexten en de studie van dit fenomeen vereist de beschikbaarheid van praktische en betrouwbare testen. Enkele voorbeelden van het fenomeen, zoals de aantrekkingskracht van sperma naar een zee-egel ei of het verzamelen van de slijmzwam cellen aan een vruchtlichaam vormen, hebben directe visuele impact. Kwantificering van dit fenomeen is uitgevoerd in een verschillende manieren, zoals besch...

<table border="1"><tbody><tr><td> Naam van het item </td><td> Vennootschap </td><td> Catalogus nummer </td><td> Reacties </td></tr><tr><td> 24-well platen </td><td> Becton-Dickenson </td><td> 35/1147 </td><td></td></tr><tr><td> 12 mm buitendiameter wisselplaten met 12 um porie membraan </td><td> Millipore </td><td> PIXP01250 </td><td> We hebben eerder gebruikte Costar-Corning transwell plate # 3403-nu stopgezet </td></tr><tr><td> Zigmond kamer </td><td> Neuroprobe </td><td> Z02 </td><td></td></tr><tr><td> Siliconenolie </td><td> General Electric </td><td> SF1154 </td><td> Equivalent aan Dow Corning 550 Fluid </td></tr><tr><td> Afbeelding J-software </td><td> Wayne Rasband, Research Services Branch, National Institute of Mental Health </td><td> Gratis te downloaden op http://rsbweb.nih.gov/ij </td><td> Java-programma dat draait op Windows, Linux en Mac </td></tr><tr><td> MtrackJ software </td><td> Erik Meijering / Imagescience / <a href="http://www.bigr.nl/">Biomedical Imaging Group</a> , Erasmus MC - Universitair Medisch Centrum Rotterdam </td><td> Gratis te downloaden op <a href="http://www.imagescience.org/meijering/software/mtrackj/">http://www.imagescience.org/meijering/software/mtrackj/</a> </td><td> Java-programma dat draait op Windows, Linux en Mac </td></tr><tr><td> Virtual Dub software </td><td> <a href="http://www.virtualdub.org/gpl.html">GNU General Public Licentie</a> software </td><td> Gratis downloaden via <a href="http://www.virtualdub.org/index.html">http://www.virtualdub.org/index.html</a> </td><td> Installatie-instructies op de afbeelding J website onder plugins, alleen voor Windows </td></tr><tr><td> cellSens software </td><td> Olympus </td><td> Zie website: <a href="http://www.olympusamerica.com/seg_section/product.asp?product=1070">http://www.olympusamerica.com/seg_section/p</a>roduct.asp? product = 1070 </td><td> Controles en krijgt beelden van een groot aantal camera&#39;s. Ook heeft beeldverwerking capaciteit </td></tr></tbody></table>

twee soorten assays voor het detecteren van kikker sperma chemoattractie

Two Types of Assays for Detecting Frog Sperm Chemoattraction

Sperma chemoattractie in ongewervelden kan voldoende robuust dat men een pipet met de aantrekkelijke peptide in een zaadcel schorsing plaats en microscopisch visualiseren sperma ophoping rond de pipet 1. Sperma chemoattractie in gewervelde dieren zoals kikkers, knaagdieren en de mens is moeilijker op te sporen en vereist kwantitatieve bepalingen. Dergelijke tests zijn twee belangrijke soorten - testen die sperma beweging kwantificeren tot een bron van chemoattractant, de zogenaamde sperma accumulatie assays, en assays die daadwerkelijk volgen het zwemmen trajecten van individuele sperma. Sperma accumulatie tests zijn relatief snel waardoor tientallen of honderden testen gedaan worden in een enkele dag, waardoor dosis-respons curves en tijd cursussen worden uitgevoerd relatief snel. Deze types van testen uitgebreid zijn gebruikt om vele gevestigde chemoattractie systemen karakteriseren - bijvoorbeeld neutrofielen chemotaxis naar bacriaal peptiden en sperma chemotaxis naar follikelvocht. Sperma tracking testen kunnen meer arbeidsintensief zijn, maar bieden aanvullende gegevens over hoe chemoattractancts daadwerkelijk veranderen het zwembad paden die sperma te nemen. Dit type test is nodig om de oriëntatie van het sperma beweging ten opzichte van de chemoattrractant gradiënt as te tonen en karakteristieke bochten of veranderingen in de oriëntatie die de zaadcellen dichter bij het ei te visualiseren. Hier beschrijven we methoden die worden gebruikt voor elk van deze twee soorten testen. Het sperma gebruikte accumulatie assay is een zogenaamde &quot;twee-kamer&quot; assay. Amfibie sperma worden geplaatst in een weefselkweek bord plaatsen met een polycarbonaat filter vloer met 12 micrometer diameter poriën. Wisselplaten met sperma worden geplaatst in weefselkweek putjes met buffer en een chemoatttractant zorgvuldig gepipetteerd in de bodem goed waar de vloer voldoet aan de muur (zie afb. 1.). Na de incubatie, de top plaatst met daarin het sperma reservoir wordt zorgvuldig removed, en sperma in de onderste kamer die zijn gepasseerd door het membraan worden verwijderd, gepelletiseerd en vervolgens geteld door hemocytometer of flowcytometer. Het sperma tracking test maakt gebruik van een Zigmond kamer oorspronkelijk ontwikkeld voor het waarnemen van neutrofielen chemotaxis en aangepast voor observatie van sperma door Giojalas en collega&#39;s 2,3. De kamer bestaat uit een dikke glazen dia in die twee verticale troggen zijn bewerkt. Deze worden gescheiden door een 1 mm brede observatie platform. Na het aanbrengen van een afdekglas, sperma worden geladen in een trog, de chemoattractant-agent in de andere en de beweging van de individuele sperma gevisualiseerd door video microscopie. Videomateriaal wordt vervolgens geanalyseerd met behulp van software voor het twee-dimensionale cel bewegingen in het xy-vlak als een functie van de tijd (xyt data sets) dat het traject van elk sperma vorm te identificeren.

Eieren en de extracellulaire coatings rond eieren vaak los peptiden, eiwitten en kleine moleculen die communiceren met sperma om hen te begeleiden naar het ei daarbij het bevorderen van de bevruchting. Met behulp van kikker sperma beschrijven we en vergelijking van twee klassen van assays gebruikt om sperma chemoattractie detecteren - sperma accumulatie assays en sperma tracking assays.

Twee Soorten Assays voor het detecteren van Kikker Sperma chemoattractie

Sperma-chemoattractie bij ongewervelden kan robuust genoeg zijn om een pipet die het attractieve peptide bevat in een spermasuspensie te plaatsen ...

Hierin worden twee verschillende methoden voor het evalueren van de chemo-attractie van sperma beschreven voor de two-chamber assay. Geactiveerd kikkersperma wordt eerst gedispergeerd in inserts met poreuze membraanbodems die in de putjes van een 24-wellplaat zijn geplaatst. Zodra het sperma op zijn plaats is, wordt er voorzichtig een chemo-attractant aan de bodem van het putje toegevoegd om een chemo-attractieve gradiënt te initiëren.Vervolgens worden de spermatozoën geïncubeerd om de cellen de tijd te geven om door het poreuze membraan te migreren als reactie op de chemotactische gradiënt. Ten slotte wordt de insert verwijderd en worden de spermatozoën die naar de bodem van de put in de assay met twee kamers zijn gemigreerd, geteld met een hemocytometer. Uiteindelijk kan de activiteit van chemotactische attractoren voor sperma worden vergeleken en gekwantificeerd, bijvoorbeeld door middel van een dosis-responscurve-analyse voor de tracking-assay in de zigman-kamer.Een dekglas wordt eerst met siliconenolie op de Zigman-kamer aangebracht en ondersteboven over de ronde opening van een microscoop geplaatst. Eén zijde van de kamer wordt vervolgens gevuld met geactiveerde kikkersperma. Daarna wordt de andere zijde gevuld met de chemoattractant-oplossing.Na vijf minuten is de chemotactische gradiënt gevormd en kunnen de spermaten op dat moment op video worden vastgelegd terwijl ze langs de gradiënt zwemmen. Uiteindelijk kunnen de beelden die zijn verkregen uit de tracking-assay in de Zigmund-kamer worden geanalyseerd om de snelheid van de spermaten en de chemokinetische patronen en trajecten van de spermatenreis als reactie op een chemo-attractantgradiënt te bepalen. Deze twee methoden voor het detecteren van chemotaxis van spermaten zijn complementair en leveren verschillende soorten gegevens op.De assay met twee kamers stelt sperma in staat om door een poreus membraan te passeren, waardoor de kwantificering van de respons van het sperma op een chemo-attractant mogelijk wordt. Een visuele demonstratie van de assay met twee kamers is essentieel, omdat de stappen voor het toevoegen van sperma en de chemo-attractant aan het begin, evenals de stappen voor het verwijderen van het sperma en de inserts aan het einde, een zeer nauwkeurige positionering van de micropipet vereisen. De zigmund-kamerassay maakt gebruik van video om het zwemmen van sperma in een chemotactische gradiënt vast te leggen.Dit maakt de bepaling van dynamische parameters zoals snelheid en richting mogelijk. Het belangrijkste voordeel van de zigmund-kamer tracking assay ten opzichte van de tweekamer-assay is dat het zwemgedrag van de spermacellen kan worden gevisualiseerd en geanalyseerd aan de hand van een aantal dynamische parameters. Spoel de spermacellen uit een kikkerteestikel door gaatjes in één uiteinde te prikken en buffer met een spuit en naald in het tegenovergestelde uiteinde te injecteren.Nadat het sperma uit de testikels van de kikker is gespoeld, wordt het aantal verzamelde cellen geschat met behulp van een hemocytometer. Verdun vervolgens de voorraad spermiesuspensie met oocyten-ringerbuffer om een spermadichtheid van 2 × 10⁷ cellen per milliliter te verkrijgen. Beoordeel de beweeglijkheid van het sperma door vijf µL sperma 1:10 te verdunnen met F1-buffer en de beweging te visualiseren met fasecontrastoptiek.Pipette vervolgens 700 µL F1-buffer in elke well van een plastic 24-wells weefselkweekplaat. Verdun daarna 100 µL van de spermasuspensie met 900 µL F1-buffer bij kamertemperatuur in een microcentrifugeebuis om de spermamotiliteit via osmotische shock te activeren voor elke uit te voeren assay. Plaats een insert met een buitendiameter van 12 mm en een porositeit van 12 µm in een met buffer gevulde well, waarbij u erop let dat de insert niet centraal wordt geplaatst, zodat er aan één zijde ruimte overblijft.Gebruik vervolgens een micropipet met een afgesneden tip om onmiddellijk 400 µL motility-geactiveerd sperma over te brengen naar de well; breng de spermasuspensie aan op de wand van de insert, zodat deze naar beneden op het filter onderin de insert loopt. Pipetteer daarna voorzichtig 50 µL van het chemo-attractant in elke well van de plaat, in de ruimte tussen de well en de decentraal geplaatste insert.Zorg ervoor dat de druppel precies op de plek wordt geplaatst waar de zijkant en de bodem van de well samenkomen. Verwijder de pipet zonder het systeem te verstoren. Nadat alle assays zijn voorbereid.Laat de plaat op kamertemperatuur staan totdat de eerste gestarte assay 50 minuten heeft geïncubeerd. Houd vervolgens de insert voorzichtig met één hand vast. Stop de assay door het grootste deel of geheel van de spermasuspensie in de bovenste kamer met een micropipet te verwijderen.Zodra het sperma vanuit de bovenkamer is overgebracht, moet de insert onmiddellijk worden verwijderd en weggegooid. Meng nu de spermasuspensies in elke put om eventueel naar de bodem gezakt sperma opnieuw te suspenderen. Breng vervolgens de volledige spermasuspensie uit elke put over in individuele microcentrifugebuisjes.Voeg formaldehye toe tot een eindconcentratie van 0,5% volume per volume. Pelleteer de gefixeerde spermapreparaten in elke buis. Centrifugeer deze in een persoonlijke microcentrifuge met behulp van de tienseconden-drukknop.Verwijder vervolgens uit elke buis al het supernatant behalve 100 µL en resuspendeer het pellet in dat volume. Verdun daarna 20 µL van de spermasuspensie 1 op 10 met gedestilleerd water en tel de sperma op een hemocytometer. Met behulp van het 40x objectief van een rechtopstaande microscoop levert de assay met twee kamers kwantitatieve resultaten op die geschikt zijn voor dosis-responsonderzoeken of voor vergelijkingen tussen attractanten.Bijvoorbeeld bevat kikker-eewater een chemoattractant voor sperma dat aantrekkend werkt, zoals aangegeven door de rode symbolen. Egewater veroorzaakt een toename en vervolgens een afname in het aantal spermacellen dat door het poreuze membraan gaat naarmate de dosis chemoattractant voor sperma wordt verhoogd. In tegenstelling hiermee heeft runder-serumalbumine, weergegeven door de witte symbolen, weinig effect over hetzelfde dosisbereik.Bevestig vóór aanvang van de zigman-kamerassay eerst of het werkstation met de omgekeerde microscoop klaar is voor video-opname. Stel de microscoop in. Start de software voor camerabesturing om zeven frames per seconde vast te leggen.Controleer of de camera is gefocust op het observatieplatform en of de output naar het computermonitor wordt verzonden. Controleer vervolgens of het microscopische veld het grootste deel of de gehele breedte van het observatieplatform omvat. Bereid daarna een suspensie van kikkersperma voor in oocyte ringer's buffer, en een chemo-attractant verdund tot de juiste concentratie met F1-buffer; bewaar beide op ijs tot gebruik.Begin vervolgens met een schone, droge zigmund-kamer. Gebruik een micropipet om een lijn van ongeveer 4 µL siliconenolie aan te brengen, ongeveer 5 mm van de buitenrand van elke trth en parallel daaraan. Plaats daarna een dekglas van 22 bij 40 mm op de kamer, zodat de siliconenolie gelijkmatig naar de buitenrand van elke trth kan verspreiden.Keer de kamer nu om en plaats deze over de grote ronde uitsparing in de microscooptafel. Let erop dat het dekglas de tafel niet raakt en activeer 20 µL van het xap-sperma in oocyten-ringerbuffer door dit bij kamertemperatuur in een verhouding van 1:10 te mengen met F1-buffer. Zuig onmiddellijk 70 µL van het motiliteitsgeactiveerde sperma op met een micropipet met een afgeknipt tipje.Houd vervolgens de micropipet onder een lage hoek en plaats de tip bij de zijopening. Vul de trth en de brug via capillaire werking. Vul daarna de tegenoverliggende trth op dezelfde wijze met een chemo-attractant-oplossing, aangezien xap-spermatozoïden een beperkte motiliteitslevensduur hebben.Start binnen drie minuten met het maken van de video-opname en ga hiermee vijf minuten door. De tracking-assay in de Zigman-kamer maakt videomicroscopie mogelijk van sperma dat zwemt in een gradiënt van chemo-attractanten. Deze film toont een opname van sperma dat zwemt op het observatieplatform, waarbij de trajecten in het rood worden gevolgd, zoals weergegeven in dit diagram.Spermatrajecten bestaan uit segmenten, waarbij elk segment wordt aangegeven door een pijl en de verplaatsing van de spermatozoon tussen opeenvolgende videoframes vertegenwoordigt. De trajectsegmenten brengen het zwemgedrag van individuele spermatozoën in kaart en brengen patronen zoals cirkels en draaiingen naar voren. Op basis van deze gegevens kan men de snelheid en richting van elk segment bepalen, of de eigenschappen van alle segmenten in een traject of een groep trajecten.Bijvoorbeeld de netto lineaire afstand. De vector die het begin van een traject met het einde verbindt, heeft een x-as component en bevindt zich onder een hoek theta ten opzichte van de x-as, zoals hier in het rood weergegeven; theta zou moeten afnemen en de verplaatsing over de x-as zou moeten toenemen wanneer er een chemoattractant-gradiënt aanwezig is. Deze veranderingen betekenen dat sperma een voorkeur vertonen voor het zwemmen in de richting van de gradiënt naar de chemoattractant. Hoewel het uitvoeren van beide assays belangrijk is, moet men onthouden dat aandacht voor de juiste belading van sperma en chemoattractant in elk apparaat cruciaal is voor het verkrijgen van reproduceerbare chemotactische gradiënten in de prestaties van het sperma.

two-types-of-assays-for-detecting-frog-sperm-chemoattraction

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Werkwijze voor het kwantitatief beoordelen van de chemotactische respons...

C. elegans Chemotaxis Assay

Differentiële sperma concurrerend vermogen...

Het beoordelen van verschillen in sperma concurrerend vermogen in<em&gt; Drosophila</em

Xenopus laevis kikkervisjes liever zwemmen op de witte kant van een zwart / witte tank. Dit gedrag wordt gestuurd door hun visie. Op basis van dit probleem presenteren we een eenvoudige test om de visuele functie kikkervisjes testen.

Een eenvoudige Behavioral Assay for Testing visuele functie in<em&gt; Xenopus laevis</em

Hier presenteren we methodologieën voor evaluatie van spermatozoan membraan integriteit, een cellulaire functie sperma bevruchting bevoegdheid is gekoppeld. We beschrijven drie technieken voor de beoordeling van de fluorimetrische van sperma membranen: gelijktijdige kleuring met specifieke fluorescerende sondes, fluorescentie microscopie en geavanceerde sperma-dedicated stroom cytometry. Voorbeelden van het combineren van de methoden worden ook gepresenteerd.

Fluorimetrische technieken voor de beoordeling van sperma membranen

Hier, twee medium-throughput assays voor de beoordeling van effecten op Ca2 +-signalering en Acrosoom reactie in het menselijk sperma worden beschreven. Deze tests kunnen worden gebruikt om te sluiten snel en eenvoudig grote hoeveelheden compounds voor effecten op Ca2 +-signalering en Acrosoom reactie in het menselijk sperma.

Medium-throughput Screening tests voor de beoordeling van effecten op Ca2 +-signalering en Acrosoom reactie in het menselijk sperma

Het sperma moet met succes door de eileider navigeren om een eicel te bevruchten. Hier beschrijven we een assay voor het meten van sperma migratie binnen de C. hermafrodiet baarmoeder. Deze analyse kan kwantitatieve gegevens over sperma distributie binnen de baarmoeder na het koppelen, evenals op snelheid, richtings snelheid, en omkerings frequentie verstrekken.

Het meten van sperma begeleiding en beweeglijkheid binnen de Caenorhabditis van het hermafrodiet-reproductieve kanaal

We beschrijven de toepassing van een extracellulaire flux-Analyzer om real-time veranderingen in de glycolyse en oxidatieve fosforylering tijdens het gebruik van muis sperma te bewaken.

Met behulp van een extracellulaire flux Analyzer om veranderingen in glycolyse en oxidatieve fosforylering te meten tijdens het gebruik van muis sperma

Hier presenteren we een protocol voor het bestuderen van de paringsconcurrentie van mannelijke Aedes aegypti met fluorescerende kleurstof als marker. Vrouwelijke muggen worden blootgesteld aan zowel gemarkeerde als ongemarkeerde mannetjes voor copulatie. Na de paring worden hun spermathecae onderzocht onder een fluorescentiemicroscoop om hun paringspartner te bepalen.

Met behulp van de fluorescerende kleurstof, Rhodamine B, om paringsconcurrentievermogen bij mannelijke Aedes aegypti-muggen te bestuderen

Wanneer Transforming Growth Factor ß familie voorloper eiwitten ectopisch tot expressie komen in Xenopus laevis embryo's, worden ze gedimeriseerd, worden ze gesplitst en worden ze uitgescheiden in de blastocoele, die begint bij de late blastula tot vroege gastrula stadium. We beschrijven een methode voor het opzuigen van splitsingsproducten uit de blastocoeleholte voor immunoblotanalyse.

Analyse van transformerende groeifactor ß familiesplitsingsproducten uitgescheiden in de blastocoele van Xenopus laevis-embryo's

Dit protocol stelt methoden vast voor het extraheren en kwantificeren van reacties op het vluchtige seksferomoon in C. elegans, en biedt hulpmiddelen om chemische communicatie en navigatietraject te bestuderen.

Vluchtige seksferomoonextractie en chemo-aantrekkingstest bij Caenorhabditis elegans

Leer twee methoden voor het detecteren van spermachemo-attractie bij kikkers met accumulatie- en tracking-assays. Deze technieken kwantificeren spermatozoënmigratie en zwemgedrag voor fertilisatieonderzoek.

Twee Soorten Assays voor het detecteren van Kikker Sperma chemoattractie

Meer video's verkennen