Name: 라이브 세포의 저장소로 작동하는 칼슘 항목의 형광 기반의 측정 : 교양 암 세포에서 골격근 섬유에 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-02-13T12:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 18 s
Description: 배우세요 형광 기반 방법으로 암 세포와 골격근 섬유에서 저장소 작동 칼슘 유입(SOCE)을 측정하는 기술을. 공초점 현미경을 활용한 실시간 칼슘 역학 분석 방법입니다.

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우리는 읽는이 원고의 편집을 위해 닥터 노아 Weisleder 감사드립니다. 이 작품은 메가바이트에 0535555N ZP, XZ로 미국 심장 협회 SDG2630086, 그리고 건강의 국립 연구소 RC2AR058962-01메가바이트까지 연구 보조금 UMDNJ 재단 62-09에 의해 지원되었다.

<ol><li>Parekh, A. B., Putney, J. W. Jr <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Store-operated+calcium+channels%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol.+Rev%22%5BJournal%5D)">Store-operated calcium channels.</a> Physiol. Rev. 85, 757-810 (2005).</li>
<li>Ma, J., Pan, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retrograde+activation+of+store-operated+calcium+channel%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Calcium%22%5BJournal%5D)">Retrograde activation of store-operated calcium channel.</a> Cell Calcium. 33, 375-384 (2003).</li>
<li>Feske, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ORAI1+and+STIM1+deficiency+in+human+and+mice%3A+roles+of+store-operated+Ca2%2B+entry+in+the+immune+system+and+beyond%5BTitle%5D)+AND+%22Immunol.+Rev%22%5BJournal%5D)">ORAI1 and STIM1 deficiency in human and mice: roles of store-operated Ca2+ entry in the immune system and beyond.</a> Immunol. Rev. 231, 189-209 (2009).</li>
<li>Parekh, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Store-operated+CRAC+channels%3A+function+in+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Drug+Discov%22%5BJournal%5D)">Store-operated CRAC channels: function in health and disease.</a> Nat. Rev. Drug Discov. 9, 399-410 (2010).</li>
<li>Pan, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dysfunction+of+store-operated+calcium+channel+in+muscle+cells+lacking+mg29%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Dysfunction of store-operated calcium channel in muscle cells lacking mg29.</a> Nat. Cell Biol. 4, 379-383 (2002).</li>
<li>Shin, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+retrograde+signal+from+calsequestrin+for+the+regulation+of+store-operated+Ca2%2B+entry+in+skeletal+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">A retrograde signal from calsequestrin for the regulation of store-operated Ca2+ entry in skeletal muscle.</a> J. Biol. Chem. 278, 3286-3292 (2003).</li>
<li>Ma, J., Pan, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Junctional+membrane+structure+and+store+operated+calcium+entry+in+muscle+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Biosci%22%5BJournal%5D)">Junctional membrane structure and store operated calcium entry in muscle cells.</a> Front Biosci. 8, d242-d255 (2003).</li>
<li>Pan, Z., Damron, D., Nieminen, A. L., Bhat, M. B., Ma, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Depletion+of+intracellular+Ca2%2B+by+caffeine+and+ryanodine+induces+apoptosis+of+chinese+hamster+ovary+cells+transfected+with+ryanodine+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Depletion of intracellular Ca2+ by caffeine and ryanodine induces apoptosis of chinese hamster ovary cells transfected with ryanodine receptor.</a> J. Biol. Chem. 275, 19978-19984 (2000).</li>
<li>Hirata, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Uncoupling+store-operated+Ca2%2B+entry+and+altered+Ca2%2B+release+from+sarcoplasmic+reticulum+through+silencing+of+junctophilin+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Uncoupling store-operated Ca2+ entry and altered Ca2+ release from sarcoplasmic reticulum through silencing of junctophilin genes.</a> Biophys. J. 90, 4418-4427 (2006).</li>
<li>Zhao, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+resistance+to+fatigue+and+altered+calcium+handling+properties+of+sarcalumenin+knockout+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol.+Genomics%22%5BJournal%5D)">Enhanced resistance to fatigue and altered calcium handling properties of sarcalumenin knockout mice.</a> Physiol. Genomics. 23, 72-78 (2005).</li>
<li>Zhao, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Azumolene+inhibits+a+component+of+store-operated+calcium+entry+coupled+to+the+skeletal+muscle+ryanodine+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Azumolene inhibits a component of store-operated calcium entry coupled to the skeletal muscle ryanodine receptor.</a> J. Biol. Chem. 281, 33477-33486 (2006).</li>
<li>Launikonis, B. S., Barnes, M., Stephenson, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+the+coupling+between+skeletal+muscle+store-operated+Ca2%2B+entry+and+the+inositol+trisphosphate+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Identification of the coupling between skeletal muscle store-operated Ca2+ entry and the inositol trisphosphate receptor.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100, 2941-2944 (2003).</li>
<li>Shuttleworth, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temporal+relationships+between+Ca2%2B+store+mobilization+and+Ca2%2B+entry+in+an+exocrine+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Cell.+Calcium%22%5BJournal%5D)">Temporal relationships between Ca2+ store mobilization and Ca2+ entry in an exocrine cell.</a> Cell. Calcium. 15, 457-466 (1994).</li>
</ol>

관심의 어떠한 충돌 선언 없습니다.

칼슘 2 + 바인딩 및 CA 2 + 무료 Fura-2의 여기 파장은 각각 340 nm의 380 nm의 있지만, CA 2 Fura-2의 최고 비율 동적 범위는 + 농도 측정은 특히 다른 파장에서 발생할 수 현미경 시스템. 파장에서의 이러한 변화는 일반적으로 다양한 광학 부품의 추가와 광학 경로의 변화로 인해 수 있습니다. 본 연구에서는 Fura-2의 여기 파장은 Fura-2 형광 분광 분석을 수행하여 350 nm의 및 390 nm의로 결정됩니다. 를 포함한 여러 소스의 균형에서 cytosol 결과에서 세포 내 칼슘 2 + 수준의 세포내 칼슘 2 + 릴리스, 세포외 칼슘 2 + 항목뿐만 아니라 응급실과 플라즈마 막에서 칼슘 2 + 배제 메커니즘. 세포내 칼슘 2 + 릴리스 및 CA 2 + extr에서 단방향 SOC-매개 칼슘 2 + 유입을 분리하려면usion는 MN 2 + 담금질 분석을 사용할 수 있습니다. MN 2 +는 SOCE 통해 세포에 침투 수 있도록 알려져 있지만 표면 막 압출 또는 칼슘이에 의해 응급실로 이해 + 펌프를 안타입니다. 따라서 형광 담금질은 SOCE의 활성화 정도를 예상 세포로 단방향 MN 2 + 유량의 측정을 나타냅니다. MN 2 + 담금질 분석 같은 파장에서 isosbestic 시점 공연 Fura-2 형광 강도는 칼슘 2 + 농도에 독립적입니다.합니다 각 시스템에 대한 isosbestic 포인트는 스펙트럼 스캔에 의해 결정되어야한다. 또한, MN 2 + 담금질은 최종 값이 칼슘 2 + 농도 13 독립이라는 같은 방법으로 두 개의 파장에서 빛을 조정 형광에 의해 기록될 수 있습니다. 골격 근육의 SOCE의 활동 공간과 시간적 정보를 얻으려면 우리는 동시 measureme 수 있도록 이중 염색 방법을, 고용SOCE 활동 및 SR 칼슘이 피부 성인 포유류의 편집 판단리스트 근육 섬유에 + 컨텐츠 NT. SR 칼슘 2의 변화 사이의 상관 관계는 + 내용 및 SOCE 활동은 SR 칼슘 2의 고갈 + 스토리지로 SOCE 활성화의 한계와 감도를 나타내는 꾸몄다 수 있습니다. TT-로드 솔루션은 또한 칼슘 2 T-tubules을로드하는 데 최적화되어 있습니다 +와 T-tubules 및 SR-로딩 솔루션의 마중물을 위해 최대한의 SR 칼슘 2 + 로딩을 촉진하고 추가로 T-tubules를 로드할 수 있도록 설계되었습니다 ~ 500 μm의 칼슘 2 +. FCCP는 TT / SR-로딩 솔루션과 mitochondria의 효과를 제거하는 SR-파괴 솔루션에 포함되어 있습니다.

특정 시약 및 장비의 테이블 : <table border="1"><tbody><tr><td> 시약의 이름 </td><td> 회사 </td><td> 카탈로그 번호 </td><td> 댓글 </td></tr><tr><td> RPMI 1640 </td><td> Mediatech </td><td> 10-040 - 이력서 </td><td></td></tr><tr><td> 햄의 F-12 </td><td> Mediatech </td><td> 10-080 - 이력서 </td><td></td></tr><tr><td> DMEM </td><td> Mediatech </td><td> 10-013 - 이력서 </td><td></td></tr><tr><td> 유리 바닥 요리 </td><td> MatTek </td><td> P35G-1.5-14-C </td><td></td></tr><tr><td> Fura - 오전 2시 </td><td> Invitrogen (분자 프로브) </td><td> F1221 </td><td> -20 ° C, DMSO에 녹아있는 빛으로부터 보호 도장 꽉,, </td></tr><tr><td> Fluo-5N 오전 </td><td> Invitrogen (분자 프로브) </td><td> F14204 </td><td> -20 ° C, 도장 꽉 전로부터 보호항공 </td></tr><tr><td> 로드-5N </td><td> Invitrogen (분자 프로브) </td><td> R14207 </td><td> -20 ° C, 도장 꽉은 빛으로부터 보호 </td></tr><tr><td> 석영 Cuvette </td><td> Starna 셀 </td><td> 3-Q-10 </td><td></td></tr><tr><td> thapsigargin </td><td> Tocris </td><td> 1138 </td><td></td></tr><tr><td> 2-Aminoethoxydiphenylborane (2-지명수배) </td><td> Tocris </td><td> 1224 </td><td></td></tr><tr><td> N-벤질-P-톨루엔 sulphonamide (BTS) </td><td> 시그마 - 올드 리치 </td><td> 435,600 </td><td></td></tr><tr><td> Collagenase 유형 I </td><td> 시그마 </td><td> C0130 </td><td></td></tr></tbody></table> 장비 : <ol><li> spectrofluorometer (광자 기술 인터내셔널, 뉴저지) : 크세논 아크 램프, 컴퓨터 제어 고속 랜덤 액세스 단색, cuvette 기반 방출 단색, 니콘 TE-200 거꾸로 형광 microscopE, S 형석 40x/1.30 오일 목적, PMT 탐지기. </li><li> 아르곤 레이저 453/477/488/514, HeNe 레이저 543nm, 니콘 TE2000 거꾸로 현미경, 60X 목표 (NA 1.4, 석유) : 레이저 공촛점 현미경 (BioRad Radiance210​​0)를 스캔. </li><li> 배율 파워&gt; 100 (자이스 혈구 Stemi SV11 APO)와 stereomicroscope. </li></ol>

라이브 세포의 저장소로 작동하는 칼슘 항목의 형광 기반의 측정 : 교양 암 세포에서 골격근 섬유에

Fluorescence-based Measurement of Store-operated Calcium Entry in Live Cells: from Cultured Cancer Cell to Skeletal Muscle Fiber

쇼핑몰 이전 capacitative 칼슘 2 + 항목을 되나, CA 2 + 항목 (SOCE)를 운영, + 고갈 endoplasmic reticulum (ER) 또는 sarcoplasmic reticulum (SR) 칼슘 2 + 저장소를 보충하기 위해 세포에 세포 밖 칼슘 2의 유입을위한 단단히 규제 메커니즘입니다 1,2. 칼슘 2 + 유비 쿼터스 초 메신저이기 때문에, 그 SOCE가 증식, apoptosis, 유전자 전사 및 운동성 포함한 세포 프로세스 다양한 중요한 역할을 담당 볼 놀라운 일이 아닙니다. 상피 세포와 골격 근육을 포함한 거의 모든 세포 유형에서 자사의 광범위한 발생으로 인해,이 통로가 큰 관심 3,4을 받았습니다. 그러나, 다른 세포 유형 및 생리적 기능에 SOCE 특징 이질 아직도 5-7 해제되지 않습니다. SOCE의 기능적 채널 속성이 생에 대한 지식의 큰 몸 반면, 패치 - 클램프 연구에 의해 밝혀하실 수 있습니다의 경로가 있기 때문에 높은 처리량 검사를위한 편리 성과 타당성의 형광 기반의 세포내 칼슘 2 + 측정하여 얻고있다. 이 보고서의 목적은 단일층 세포, 정지 세포와 근육 섬유 5,8-10의 SOCE의 활성을 측정하기 위하여 몇 가지 형광 기반의 방법을 요약하라는 것입니다. 가장 일반적으로 이러한 형광 방법 중 하나를 사용하는 직접 세포내 칼슘 2의 역학을 모니터 + F를 340nm와 ratiometric 칼슘 2 + 지표 Fura-2의 F 380nm (발광 파장에 대한 510 nm의)의 비율을 사용하고 있습니다. 세포내 칼슘 2 + 릴리스 및 CA 2에서 단방향 SOCE의 활동을 분리하려면 + 압출는 MN 2 + 담금질 분석이 자주 사용됩니다. MN 2 +는 그 표면 막 압출 공정이나 칼슘이에 의해 응급실로 이해를 안타 중에 SOCE 통해 세포에 침투 수 있도록 알려져있다 + 매우 높은 친화도 재치로 인해 펌프는H Fura - 2. 따라서 + 세포에 세포 MN 2의 항목에 의해 유도된 Fura-2 형광 담금질은 SOCE 9 활동의 측정을 나타냅니다. Ratiometric 측정 및 MN이 담금질의 assays는 세포 인구 모드에서 단일 세포를 시각화하는 현미경 기반 시스템의 cuvette 기반 spectrofluorometer 수행할 수 있습니다. 단일 세포 측정의 장점은 유전자 조작에 노출 개별 세포가 유전자 변형 또는 변이되는 세포의 연구를 수 있도록 GFP 혹은 RFP 기자를 사용하여 선택할 수있다는 것입니다. 구조적으로 전문 골격근의 SOCE의 spatiotemporal 특성은 동시에이 낮은 친화력 칼슘 2의 형광을 모니터하여 피부 근육 섬유에서 얻을 수 SR과 이러한 Fluo-5N과 같은 근육 섬유의 특정 구획, 타겟으로 + 지표로드 - 가로 tubules 9,11,12에서 5N.

매장 운영하는 CA의 범위<sup&gt; 2 +</sup&gt; 항목 (SOCE)는 형광 칼슘을 사용하여 모니터링할 수 있습니다<sup&gt; 2 +</sup&gt; 지표. MN<sup&gt; 2 +</sup교양 세포와 골격근 섬유의 이러한 지표의 assays의 SOCE의&gt; 담금질. 기계적으로 피부를 근육 섬유의 공촛점 이미징에 의한 SOCE의 공간과 시간적 해상도를 허용하는 방법도 설명되어 있습니다.

이전에는 용량성 Ca2+ 유입(capacitative Ca2+ entry)으로 불렸던 저장소 작동 Ca2+ 유입(Store operated Ca2+ entry, SOCE)은 세포 내로 세포 외 Ca2+의 유입을 조절하는 엄격하게 제어되는 기전으로, ...

본 실험 방법은 형광 기반의 방식을 사용하여 암세포 및 골격근 세포에서 저장소 작동 칼슘 유입(store operated calcium entry, SOCE)의 특성을 규명하는 데 사용됩니다. 이는 세포 내 칼슘 농도에 민감한 URA two의 형광을 살아있는 세포에서 기록함으로써 이루어집니다. 또한, 칼슘 농도에 민감하지 않은 파장에서 망간 첨가에 의한 형광 소광 속도를 측정하며, 이는 SOCE의 활성화를 직접적으로 반영하므로 SOCE 연구에 활용됩니다.구조적으로 전문화된 골격근 세포에서 근육을 박리하고 외피를 제거합니다. 근섬유를 준비합니다. 그다음 근섬유를 저친화도 칼슘 지시약으로 처리하고 내부 형광을 모니터링합니다.이러한 방법들은 SOCE가 비흥분성 세포와 골격근 모두에서 존재하며, 단계적 활성화와 세포 내 칼슘 저장량과의 밀접한 결합을 보인다는 것을 입증합니다. 전기생리학이나 패치 클램프와 같은 다른 방법들에 비해 이 플루오레신 기반 기술의 주요 장점은 사용이 편리하며 세포군 연구나 고효율 스크리닝에 적용할 수 있다는 점입니다. 정량적 환경 및 마그네슘 농도 분석을 위해 적절한 에스테틱스 S를 사용하는 것이 중요합니다.기기마다 특성이 다르기 때문에 개별 기기의 보정은 매우 중요합니다. 단일 근섬유의 기계적 피부 공정은 특수한 실습 교육과 미세 해부 기술에 대한 심층적인 이해 및 학습, 세심한 관찰, 그리고 상당한 인내심이 필요하므로 이 방법의 시각적 시연이 매우 중요합니다. 시작하기 전, URA two 형광 측정을 위해 현미경 설정을 보정하십시오. 칼슘 결합 및 calcium three URA two의 흥분 파장은 340 및 380 nanometer이지만, 특정 현미경 시스템에서 칼슘 측정을 위한 URA two의 최적 비율 동적 범위는 다른 파장에서 나타날 수 있습니다.이러한 파장의 변화는 다양한 광학 부품이 추가됨에 따라 광로가 변경되기 때문에 발생합니다. 마찬가지로, 각 시스템의 ISO spastic point 또한 달라집니다. 따라서 스펙트럼 스캔을 통해 이 파장들을 결정하는 것이 중요합니다.또는, 최종 값이 칼슘 농도와 무관하도록 임의의 두 파장에서 형광만을 측정하여 Ming 스크리닝을 기록할 수 있습니다. 먼저 RFP를 발현하는 플라스미드와 I one에 특이적인 HRNA 또는 스크램블 서열을 포함하는 플라스미드로 배양된 K Ys SE one 50 세포를 형질전환하여 48시간 동안 배양하십시오. 형질전환된 세포를 유리 바닥 접시에서 배양하십시오.그 다음 배지를 제거하고 균형염 용액(BSS)으로 세포를 세척합니다. 세척 후, 2 µM RA가 포함된 BSS 1 mL를 첨가하고 37 °C에서 40분 동안 배양합니다. 세포 내의 URA 형태가 URA 2로 전환될 수 있도록 상온에서 15분 동안 둡니다.그런 다음 현미경 하에서 BSS로 플레이트를 2회 세척합니다. 시각화 모드에서 RFP를 발현하는 세포를 선택합니다. 방출 파장은 510 nanometers로 설정하고, 여기 파장은 350 및 390 nanometers로 설정하여 여기비(excitation ratio) 모드를 선택합니다.비율은 세 번째 창에 표시됩니다. 다음으로, 네 가지 서로 다른 용액이 세포에 관류되는 동안 미리 설정된 파장에서 선택된 세포의 형광을 기록하십시오.마찬가지로, KYSE 150 세포에 ferra 2를 로딩한 후 기록을 진행합니다. 들뜸 비율 모드(excitation ratio mode)에서는 이전 절차와 달리, ISO spastic point 360 nm를 들뜸 파장으로 선택합니다. 그런 다음 5가지 서로 다른 BSS 용액으로 세포를 관류하는 동안 360 nm와 390 nm에서의 형광을 동시에 기록합니다.본 프로토콜에서는 마우스 근원세포주인 C2C12 세포를 유리 바닥 배양 접시에서 합류(confluence) 상태까지 배양한 후, 2.5% 말 혈청(horse serum)이 포함된 분화 배지에서 근관(myotubes)으로 분화시켜야 합니다. BSS 용액을 사용하여 C2C12 근관에 RA 2:00 AM을 최종 농도 5 µM로 처리하고 40분 동안 배양합니다. 그 다음, 근육 수축 및 그로 인한 모션 아티팩트를 억제하기 위해 20 µM의 최종 농도로 벤조-p-톨렌설폰아마이드(benzo-p-toluene sulfonamide, BTS)를 첨가합니다.세포를 상온에서 15분 동안 배양하며 모든 용액에는 BTS를 유지합니다. 다음으로, 4개의 균형 염 용액(Balance salt solutions)을 관류 시스템에 로드합니다.이전에 설명한 바와 같습니다. 매 관류 시 360 및 390 nanometers에서 선택된 세포의 형광을 기록합니다. 본 시리즈에서는 마그네슘 이온 퀜칭(quenching)을 모니터링하기 위해 마그네슘과 thap argen을 함께 처리합니다.소포체 칼슘 저장량이 고갈되는 동안, 장지신근(extensor digitorum longus) 또는 EDL 근육을 분리하기 위해 안락사시킨 마우스의 다리를 측면으로 배치하고 발목부터 무릎까지의 피부를 제거합니다. 표면의 근육 조직층을 절개하여 EDL을 노출시킨 다음, 상단과 하단 건을 모두 절단하여 온전한 EDL 근육을 분리합니다.건의 길이를 최대한 길게 유지하는 것이 중요합니다. 이제 수축을 방지하기 위해, 실체 현미경 하에서 EDL을 0.1 millimolar EGTA가 포함되고 칼슘이 없는 T road 용액으로 옮깁니다. 무릎 삽입 건을 두 부분으로 강제로 나누고 EDL 근육을 두 개의 다발로 분리합니다.여덟 개의 번들이 얻어질 때까지 이 과정을 반복합니다. 어느 번들에서든 힘줄이 소실된 경우, 해당 번들은 폐기합니다. 다음으로, EDL 번들 스트립의 양쪽 힘줄을 잡고, 양 끝에 힘줄 조직이 붙어 있는 분리된 단일 근섬유가 3~4개 남을 때까지 스트립을 조심스럽게 늘립니다.글라스 바텀 디쉬에 칼슘 제거 tyro 버퍼를 한 방울 넣습니다. EDL 스트립을 디쉬 위에 곧게 펴놓고, 최대한 빠르게 용액을 제거합니다. 그다음, 내수성 스카치 테이프를 사용하여 양쪽 힘줄을 단단히 고정합니다.먼저 섬유를 칼슘 제거 용액으로 세척한 후, 2.5 millimolar 칼슘 용액으로 두 번 더 세척합니다. 섬유의 과수축 및 손상이 관찰되면 해당 섬유는 폐기하고, 선택된 건강한 근섬유를 세척 용액 1번으로 세 번 세척한 다음, 수정된 세포 내 유사 피부 제거 용액(modified intracellular like skinning solution)에 5분 동안 담가 둡니다. 핀 홀더에 부착된 텅스텐 바늘을 사용하여 실체 현미경 하에서 섬유의 피부를 기계적으로 제거하면, 섬유가 다시 밀봉되면서 가로관(transverse tubules) 내에 칼슘과 결합된 road five n이 포획됩니다.제 생각에 건강한 단일 온전한 근섬유 또는 힘줄이 일부 부착된 이러한 유형의 섬유 다발을 얻는 것은 가장 까다로운 단계 중 하나이며, 그다음으로 어려운 과정은 이러한 섬유를 최종 실험 챔버로 옮기는 매우 어려운 작업입니다. 이 과정에서 섬유가 과수축하거나 심지어 파손될 수 있습니다. 따라서 건강한 섬유를 확보했다면, 기계적 스키닝(skinning) 과정에서 SR을 로드하는 것이 훨씬 수월해질 것입니다. 20 µM 플루오르-5-니트로아미노산(flow five N am)이 포함된 스키닝 용액에서 섬유를 배양하십시오.배양 후 세척액 2번으로 충분히 세척하고, 염료의 탈에스테르화가 완전히 이루어지도록 30분 동안 추가 배양합니다. 그 후, 관심 영역에서 60배 대물렌즈가 장착된 공초점 현미경을 사용하여 섬유를 시각화할 수 있습니다. 섬유에 SR 로딩 및 SR 고갈 용액을 관류하는 동안 각 염료의 형광을 동시에 기록하십시오.세포 내 칼슘 측정을 통해 KYS, SE one 50 세포의 SOCE 활성을 조사하였습니다. 세포에 RFP와 Orai1 유전자를 대상으로 하는 짧은 헤어핀 RNA를 공동 형질전환하였으며, Orai1 유전자는 SOCE 채널을 인코딩합니다. 검은색 추적으로 표시된 대조군과 비교했을 때, Orai1 발현을 억제하면 SOCE 활성이 감소하는 결과가 나타났습니다. KYS one 50 세포에서의 SOCE는 망간 소광 분석으로도 확인되었습니다. TG가 ER 칼슘 저장고를 완전히 고갈시킨 후, 망간을 투입하자 형광 강도가 유의미하게 감소하였습니다.URA two의 신호 손실 기울기가 더 가파르다는 것은 SOCE가 더 활발함을 나타냅니다. 따라서 two A PB 처리 세포에서 형광 감소 속도가 느려진 것은 이 화합물에 의해 SOCE 활성이 차단되었음을 의미합니다. 망간 퀜칭 속도는 포화 없이 퀜칭이 여전히 선형 범위에 있던 초기 10초 동안의 데이터를 통해 결정되었으며, 이와 유사한 망간 퀜칭 분석이 배양된 근육 세포에서도 수행되었습니다.이 사례에서는 망간을 tg와 함께 처리하였습니다. TG가 SR 칼슘 저장고를 고갈시키는 동안, 형광 소광 기울기는 최대 속도에 도달할 때까지 점진적으로 변화하였습니다. 이러한 S자형 곡선은 해당 실험 조건에서 SOCE의 단계적 활성화를 나타냅니다.공초점 이미징 하에서, red channel에서 관찰된 것과 같이 TT 구획 내 rhodamine 5 및 dye의 skin-fiber trapping은 전형적인 포유류의 doublet 패턴을 보였습니다. SR에 fluo-5N을 로딩한 후, skinned fiber에 TTSR 로딩 용액을 처리하자 green channel에서 전형적인 점상(punctuated) SR 패턴이 관찰되었습니다. SR 고갈 용액을 처리함에 따라 rhodamine 5N과 fluo-5N 모두의 형광 강도가 증가하였습니다. 이후 SR 구획과 TT 구획의 형광 수준이 감소하기 시작했습니다. 이는 SR 칼슘 저장고의 고갈과 SOCE 활성화 사이에 각각 결합(coupling)이 존재함을 나타냅니다.이 영상을 시청한 후, 여러분은 생존 가능하며 매우 건강하고 온전한 근섬유를 얻는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다. 근섬유의 끝부분에 충분한 힘줄이 있어야 효율적인 박리 과정이 가능하며, 결과적으로 실험자는 엄청난 이점이 있는 생리학적으로 유의미한 표본을 준비할 수 있게 됩니다. 본 연구에 사용된 모든 형광 염색제는 일반적으로 빛에 민감하므로, 이 절차를 수행하는 동안 암실에서 시료를 처리하거나 세척하는 등의 주의 사항을 반드시 준수해야 한다는 점을 잊지 마십시오.이 기술을 숙달하면 몇 시간 만에 수행할 수 있습니다. 기계적 분리 단계의 성공률을 높이기 위해 먼저 여러 개의 온전한 섬유를 확보할 것을 권장하며, 분리 후 이 섬유들을 하룻밤 동안 배양하고자 하는 경우에도 마찬가지입니다. 이 기술은 칼슘 신호 전달 분야의 연구자들이 암세포의 성장 및 사멸에서 저장소 작동 칼슘 유입(store operated calcium entry)의 역할을 탐구할 수 있는 길을 열어주었습니다.근육에서의 생리적 및 병리적 기능.

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Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

우리는 공촛점 현미경을 검색 레이저를 사용하여 살아있는 세포에 느리게 fluxes에서 신속하게 (마이크로초) 칼슘 이벤트를 분리하는 방법을 제시한다. 방법은 세포에 수백 픽셀의 기록 선 검사에 의한 칼슘 지표의 형광 강도 변화를 측정합니다. 히스토그램 분석은 우리가 다른 칼슘 fluxes의 시간 스케일을 분리 할 수​​ 있습니다.

Cardiomyocytes의 빠른 칼슘 Fluxes 측정

출처: Heredia, D. J., et. al. 마우스 횡격막의 삼자 시냅스에서 세포 특이적 칼슘 신호의 생체 외 이미징. J. Vis. Exp. (2018) 이 비디오는 형광 이미징을 보여줍니다. 유전적으로 암호화된 칼슘 지표를 발현하는 형질전환 마우스의 신경근 접합부(NMJ)에서의 칼슘 역학. NJM은 횡격막과 횡격막에 형광으로 표시된 아세틸콜린 수용체에 의해 확인됩니다. 이미지 스플리터는 여러 신호를 동시에 시각화하는 데 사용됩니다. 전기 자극이 전달되고 칼슘 유입에 대한 NMJ의 형광 변화가 기록됩니다.

형질전환 마우스의 횡격막에서 신경근 접합부에서 칼슘 역학의 형광 이미징(Fluorescence Imaging of Calcium Dynamics at Neuromuscular Junctions in the diaphragm of a transgenic mouse)

직접 칼슘 불꽃을 측정하는 방법이 여기에 설명, 칼슘 2 +의 기본 단위는 그대로 골격 근육 섬유의 근질 세망에서 놓습니다. 이 방법은 고립 된 근육 섬유의 ryanodine 수용체에서 칼슘 2 + 릴리스의 삼투 스트레스 매개 트리거를 사용합니다. 역학과 내 Ca 2 + 신호 전달의 항상성 용량은 건강과 질환에서 근육 기능을 평가하기 위해 사용될 수있다.

칼슘의 평가는 그대로 골격 근육 섬유에서 불꽃

현재 사용 가능한 대부분의 칼슘 지표는 배양된 평활근 세포의 근 소포체에서 방출된 칼슘의 간접적인 측정으로 세포질 칼슘 과도 현상을 정량화하는 데 사용됩니다. 이 프로토콜은 sarcoplasmic reticulum lum lumen 내에서 칼슘 신호를 직접 측정할 수 있는 특정 FRET 기반 지표의 사용을 설명합니다.

배양 된 평활근 세포의 근질 그물 자리 내 칼슘 변동 FRET 측정을 기반으로 공 촛점 이미지

미토콘드리아는 그들이 세포질 칼슘을 형성하는 2 + 세포 내 신호 전달 수 (2 + 칼슘)을 칼슘을 격리한다 그들의 내막 (Δ Ψm)에서 전기 잠재력을 활용할 수 있습니다. 우리는 형광 염료 및 공 초점 현미경을 사용하여 살아있는 세포에서 동시에 측정 미토콘드리아 칼슘 흡수 및 ΔΨ 분하는 방법을 설명합니다.

형광 현미경으로 살아있는 세포의 잠재적 인 미토콘드리아의 칼슘과 미토콘드리아 막의 동시 측정

여기, 우리는 성인 근육 조직에서 인간 myoblasts의 순수 인구를 얻기위한 방법을 설명합니다. 이 세포들은 생체 외 골격근 분화를 연구하고, 특히 Ca 2+ 신호 전달에 관여하는 단백질을 연구하는데 사용됩니다.

인간의 Myoblast의 분리, Myogenic 분화의 평가 및 저장 운영 칼슘 항목 측정

이 방법은 모델 유기체 C. elegans의신체 벽 근육에서 발동 된 칼슘 과도 의 변화와 이미지 기준선 세포질 칼슘 수준에 광유전학 및 유전적으로 코딩 된 칼슘 센서를 결합하는 방법을 제공합니다.

C. 예쁜꼬마선충의 생체내 칼슘 이미징

시냅스 전달에 필요한 세포하 이벤트를 시각화하기 위해 두 가지 관련 방법이 설명된다. 이들 프로토콜은 시험관내 배양된 뉴런의 라이브 세포 이미징을 사용하여 시냅스 전 칼슘 유입 및 시냅스 소포막 융합의 역학의 실시간 모니터링을 가능하게 한다.

근위축성 측삭 경화증 모델에서 시냅스 기능의 실시간 형광 측정

현재 논문에서는 마우스 세 번째 중족골의 조직 수준 기계적 부하에 대한 반응으로 생체 내에서 내장된 골세포의 기계적으로 유도된 칼슘 신호를 실시간으로 관찰하기 위해 생체 내 이미징 접근 방식을 수행하는 방법을 설명합니다.

마우스 골세포에서 부하 유도 칼슘 신호 역학을 연구하기 위한 형광 생체 내 이미징 접근 방식

기능적 부위 지정 형광 측정법은 단백질 도메인 동작을 실시간으로 연구하는 방법입니다. 천연 세포에 적용하기 위해 이 기술을 수정하면 이제 쥐 격리 골격근 섬유의 전압 개폐 Ca2+ 채널에서 단일 전압 센서 동작을 감지하고 추적할 수 있습니다.

골격근 흥분성을 연구하기 위한 천연 세포의 기능적 부위 지정 형광 측정

이 논문에서는 Fura-2/AM 염료를 사용한 단일 세포 Ca2+ 이미징을 사용하여 세포 내 칼슘 이온(Ca2+) 농도를 실시간으로 정량적으로 모니터링하는 방법을 제시합니다. 이 기술은 효율적인 염료 로딩과 형광 강도 비율을 통한 Ca2+ 수준의 정확한 계산을 가능하게 하여 연구 응용 분야를 위한 간단하고 빠른 접근 방식을 제공합니다.

칼슘 이온 채널의 활성화를 연구하기 위한 Single-cell Calcium Imaging

배우세요 형광 기반 방법으로 암 세포와 골격근 섬유에서 저장소 작동 칼슘 유입(SOCE)을 측정하는 기술을. 공초점 현미경을 활용한 실시간 칼슘 역학 분석 방법입니다.

라이브 세포의 저장소로 작동하는 칼슘 항목의 형광 기반의 측정 : 교양 암 세포에서 골격근 섬유에

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