Name: Isolamento dei fibroblasti Portal ratto In situ Fegato perfusione (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-06-29T12:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 39 s
Description: Impara l'isolamento dei fibroblasti portali da fegato di ratto mediante perfusione in situ con collagenasi. Questo metodo fornisce popolazioni cellulari pure senza passaggio in coltura per studi di biologia epatica e rigenerazione.

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Questo lavoro è stato finanziato dal NIH R01 DK05823 (a RGW), F32 DK083213 (a JWW), F30 DK081265 (a ALO), e da una borsa di studio del Fred e Suzanne Biesecker Pediatric Liver Center (a RGW).

L&#39;intera procedura viene eseguita a temperatura ambiente a meno che diversamente specificato. 1. Preparazione di soluzioni enzimatiche <ol><li> Preparare soluzioni enzimatiche secondo la Tabella 1 e filtro sterile utilizzando un filtro di 0,22 micron. Mantenere soluzione 1 e 2 della soluzione a temperatura ambiente e la soluzione 3 a 4 ° C fino al momento dell&#39;utilizzo. Tutte le soluzioni e le attrezzature che entrano in contatto con le cellule isolate deve essere sterile. </li></ol> 2. Preparazione delle apparecchiature di perfusione <ol><li> Prime il sistema di perfusione con HBSS meno di Ca 2 + / Mg 2 +, che è stato riscaldato a 37 ° C. Nota: Per assicurare che il perfusato è 37 ° C quando arriva al fegato, HBSS è scaldata in un bagno d&#39;acqua impostata a 37 ° C. Dopo che passa attraverso la pompa di perfusione, passa attraverso un condensatore vetro incamiciato che è collegato ad una serie circolatore acqua a 40 ° C (Fig. 1). </li><li> Sterilizzare chirurgicaols in un bicchiere con il 70% di etanolo. </li></ol> 3. Perfusione del Fegato <ol><li> Anestetizzare un adulto maschio Sprague-Dawley ratto mediante iniezione intraperitoneale di Nembutal (50-100 mg / kg di peso corporeo come necessario per ottenere un&#39;adeguata anestesia). </li><li> Mettete l&#39;animale in posizione supina su un vassoio di plastica e fissare gli arti al vassoio con del nastro adesivo. </li><li> Pulire l&#39;addome con il 70% EtOH. </li><li> Fai una piccola incisione nella pelle dell&#39;addome sulla linea mediana. Dissect la pelle dalla fascia apportando U taglio sull&#39;addome. Tagliare il muscolo addominale con forbici che segue la stessa forma per esporre la cavità peritoneale. </li><li> Esporre la vena portale utilizzando 2 tamponi di cotone per spostare delicatamente il visceri addominali sul lato destro. </li><li> Passare due punti di sutura sterili in seta 2.0 sotto la vena porta e legare liberamente. </li><li> Incannulare la vena portale con un catetere di calibro 16-18 IV e fissare il catetere in posizione stringendo la liberamente tiEd suture dal passaggio precedente (Fig. 2). </li><li> Iniettare eparina diluita attraverso il catetere IV (1 ml di eparina 5000 unità USP / ml diluito con 4 ml di HBSS meno Ca 2 + / Mg 2 +). Il fegato deve sbollentare. </li><li> Collegare il catetere IV al sistema di perfusione. Perfondere con HBSS meno di Ca 2 + / Mg 2 + ad una velocità di 20 ml / min per 10 minuti. Transetto della IVC inferiore al fegato per permettere il drenaggio del sangue e perfusato. Aspirare il sangue pool dalla cavità addominale. </li><li> Cambiare il liquido di perfusione di una soluzione di collagenasi allo 0,3% (150 mg collagenasi di tipo 2 in 500 ml di HBSS più Ca 2 + / Mg 2 +) e profumato per 25 minuti. Mantenere umido il fegato coprendolo con il lembo precedentemente sezionato addominale. Coprire capsula Petri sul lembo addominale e la posizione di una lampada di calore sulla superficie di mantenere l&#39;intra-addominale temperatura a circa 37 ° C. </li></ol> 4. Preparazione del the delle vie biliari <ol><li> Rimuovere il fegato sollevandola dalla cavità addominale con una pinza e mettetelo in un piatto sterile coltura di tessuti pieni di freddo Leibovitz L-15 media. </li><li> Lavorare nel cofano coltura tissutale, rimuovere la capsula epatica e delicatamente stuzzicare il parenchima epatico a parte con una pinza. Spostare il fegato attraverso diversi piatti pieni di Liebovitz L-15 mezzi, pur continuando a prendere in giro via il parenchima, finché ha lasciato con l&#39;albero biliare isolato. Il parenchima epatico è di colore marrone, mentre l&#39;albero biliare rimanente è bianca. </li><li> Posizionare l&#39;albero biliare isolato in un tubo Falcon da 50 ml riempito con 10 ml di penicillina / streptomicina (10.000 UI / ml di penicillina e 10.000 pg / ml streptomicina); lasciare su ghiaccio per 15 minuti. </li></ol> 5. L&#39;isolamento della Frazione Fibroblast Portal <ol><li> Posizionare l&#39;albero biliare in una sterile tubo da 50 ml Falcon e tritare con le forbici sterili. </li><li> Aggiungere una piccola quantità di enzima soldistribuzione pesi # 1 nel tubo (circa 5 ml) e continuare a tritare dell&#39;albero biliare fino a raggiungere la consistenza di un impasto. </li><li> Versare l&#39;impasto in una bottiglia di vetro sterile. Lavare tubo falcon con la soluzione rimanente # 1, poi versare nella bottiglia di vetro. Incubare a 37 ° C con agitazione a 100 rpm per 30 minuti. </li><li> Filtrare la sospensione attraverso un becher coperto con un singolo strato di rete di nylon (30-micron dimensione dei pori). </li><li> Trasferire qualsiasi tessuto rimanente sulla parte superiore della maglia di una bottiglia di vetro sterile lavando la rete con soluzione enzimatica # 2. Inizia versando mezzo (25 ml) della soluzione in una capsula Petri 15 centimetri sterile. Rimuovere delicatamente la maglia dal bicchiere tenendo i bordi della maglia senza contaminare l&#39;area centrale, quindi invertendo la maglia e immersione nella soluzione nella capsula Petri per rimuovere tutto il tessuto restante sulla mesh. Gettare la maglia. Trasferire la soluzione nella capsula Petri in una bottiglia di vetro sterile. Sciacquare la piastra di Petri con la Remaesaminando la 25 ml di soluzione # 2 e trasferirlo alla bottiglia di vetro stesso. Incubare a 37 ° C con agitazione a 100 rpm per 30 minuti. </li><li> Nel frattempo, prendete il filtrato nel bicchiere e versare in una provetta da 50 ml Falcon. Centrifugare a 1600 rpm (460 x g) per 5 minuti a temperatura ambiente. </li><li> Aspirare media e risospendere il pellet in 25 ml di soluzione # 3. </li><li> Prendere la soluzione dal punto 5.5 e filtrare in un bicchiere secondo sterile coperto con maglie di 30 micron. </li><li> Gettare la maglia. Centrifugare il filtrato a 1600 rpm per 5 minuti a temperatura ambiente. Aspirare e risospendere il pellet con 25 ml di soluzione # 3 come è stato fatto nella fase 5.7. </li><li> Unire le 2 frazioni di passi 5.7 e 5.9 e centrifugare nuovamente a 1600 rpm per 5 minuti a temperatura ambiente. </li><li> Aspirare media e risospendere il pellet in 10 ml di mezzo di coltura di fibroblasti portale (DMEM/F12 supplementato con 10% FBS, 1% di penicillina / streptomicina, gentamicina 0,3%, e 0,2% fungizone). </li><li> Contare le cellule per la vitalità e la piastra in piastre di coltura dei tessuti. A seconda dell&#39;applicazione desiderata, da 0,5 a 5 x 10 6 cellule per piastra da 10 cm di coltura tissutale sono appropriati. Da un adulto Sprague-Dawley di ratto, si ottiene di solito da 2 a 10 milioni di cellule vitali. </li><li> Sostituire i terreni di coltura il giorno successivo per rimuovere i detriti non aderenti. Successivamente, sostituire terreni di coltura ogni 2 giorni. </li></ol> 6. Risultati rappresentativi Fibroblasti primari portale isolati da fegato di ratto adulto sono mostrati a 1, 3 e 7 giorni dopo l&#39;isolamento (Fig. 3). Si noti che le cellule sono allungati, con morfologia tipica di fibroblasti. Le celle possono essere colorati con anticorpi anti-elastina (CL55041AP, Cedarlane Labs, Burlington, NC) per confermare la purezza. Portale fibroblasti subiscono differenziazione miofibroblastico nella cultura. Questo può essere dimostrato mediante immunocolorazione per la α-actina del muscolo liscio (α-SMA, A2547, Sigma, St. Louis, MO). <tableborder = &quot;1&quot;&gt; <tbody><tr><td rowspan="2"> Collagenasi soluzione 0,3% </td><td> Tipo 2 collagenasi </td><td> 150 mg </td></tr><tr><td> HBSS con Ca 2 + / Mg 2 + </td><td> 500 ml </td></tr><tr><td rowspan="7"> Soluzione # 1 (Pronasi) </td><td> Albumina di siero bovino </td><td> 50 mg </td></tr><tr><td> Collagenasi di tipo 2 </td><td> 25 mg </td></tr><tr><td> Pronasi </td><td> 18 mg </td></tr><tr><td> DNasi </td><td> 3 mg </td></tr><tr><td> DMEM/F12 </td><td> 47,5 ml </td></tr><tr><td> Pen / Strep </td><td> 1 ml </td></tr><tr><td> Siero fetale bovino </td><td> 1,5 ml </td></tr><tr><td> Soluzione # 2 </td><td> Albumina di siero bovino </td><td> 50 mg </td></tr><tr><td rowspan="6"> (Ialuronidasi) </td><td> Collagenasi di tipo 2 </td><td> 25 mg </td></tr><tr><td> Ialuronidasi </td><td> 22 mg </td></tr><tr><td> DNasi </td><td> 3 mg </td></tr><tr><td> DMEM/F12 </td><td> 47,5 ml </td></tr><tr><td> Pen / Strep </td><td> 1 ml </td></tr><tr><td> Siero fetale bovino </td><td> 1,5 ml </td></tr><tr><td rowspan="2"> Soluzione # 3 </td><td> DNasi </td><td> 3 mg </td></tr><tr><td> RPMI media 1640 </td><td> 50 ml </td></tr></tbody></table> Tabella 1. Soluzioni enzimatiche. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/3669/3669fig1.jpg" /> Figura 1. Perfusione istituito. A. Circolatore acqua per il riscaldamento della colonna. Colonna B. contenenti supporti di perfusione. C. Rubinetto di controllo della pompa di efflusso. D. Pump afflusso. E. a velocità variabile pompa peristaltica. F. fiasco vuoto con Bio-Clean detergente. G. calore della lampada. Acqua H. bagno per i media di perfusione riscaldamento. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/3669/3669fig2.jpg" /> Figure 2. In perfusione situ. A. IV catetere inserito nella vena porta, fissato con sutura e collegata alla tubazione perfusione via rubinetto. B. pipetta di vetro collegato ad beuta da vuoto e di aspirazione a parete per rimuovere il liquido di perfusione drenaggio sezionato IVC. I. intestini. L. Fegato. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/3669/3669fig3.jpg" /> Figura 3. Contrasto di fase e immunofluorescenza macchia di fibroblasti di ratto portale della cultura. Portale fibroblasti in coltura per 1, 3, e 7 giorni dopo l&#39;isolamento sono state fissate e colorate per elastina, α-SMA e DAPI.

<ol><li>Parola, M., Marra, F., Pinzani, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myofibroblast+-+like+cells+and+liver+fibrogenesis%3A+Emerging+concepts+in+a+rapidly+moving+scenario%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Aspects+Med%22%5BJournal%5D)">Myofibroblast - like cells and liver fibrogenesis: Emerging concepts in a rapidly moving scenario.</a> Mol. Aspects Med. 29, 58-66 (2008).</li>
<li>Dranoff, J. A., Wells, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Portal+fibroblasts%3A+Underappreciated+mediators+of+biliary+fibrosis%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatology%22%5BJournal%5D)">Portal fibroblasts: Underappreciated mediators of biliary fibrosis.</a> Hepatology. 51, 1438-1444 (2010).</li>
<li>Tuchweber, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proliferation+and+phenotypic+modulation+of+portal+fibroblasts+in+the+early+stages+of+cholestatic+fibrosis+in+the+rat%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Invest%22%5BJournal%5D)">Proliferation and phenotypic modulation of portal fibroblasts in the early stages of cholestatic fibrosis in the rat.</a> Lab Invest. 74, 265-278 (1996).</li>
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<li>Kinnman, N., Housset, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peribiliary+myofibroblasts+in+biliary+type+liver+fibrosis%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Biosci%22%5BJournal%5D)">Peribiliary myofibroblasts in biliary type liver fibrosis.</a> Front Biosci. 7, d496-d503 (2002).</li>
<li>Kinnman, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+myofibroblastic+conversion+of+peribiliary+fibrogenic+cells+distinct+from+hepatic+stellate+cells+is+stimulated+by+platelet-derived+growth+factor+during+liver+fibrogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Invest%22%5BJournal%5D)">The myofibroblastic conversion of peribiliary fibrogenic cells distinct from hepatic stellate cells is stimulated by platelet-derived growth factor during liver fibrogenesis.</a> Lab Invest. 83, 163-173 (2003).</li>
<li>Uchio, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+retinol-binding+protein-1+expression+and+modulation+during+in+vivo+and+in+vitro+myofibroblastic+differentiation+of+rat+hepatic+stellate+cells+and+portal+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Invest%22%5BJournal%5D)">Cellular retinol-binding protein-1 expression and modulation during in vivo and in vitro myofibroblastic differentiation of rat hepatic stellate cells and portal fibroblasts.</a> Lab Invest. 82, 619-628 (2002).</li>
<li>Kruglov, E. A., Jain, D., Dranoff, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+primary+rat+liver+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Investig.+Med%22%5BJournal%5D)">Isolation of primary rat liver fibroblasts.</a> J. Investig. Med. 50, 179-184 (2002).</li>
<li>Li, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transforming+growth+factor-beta+and+substrate+stiffness+regulate+portal+fibroblast+activation+in+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatology%22%5BJournal%5D)">Transforming growth factor-beta and substrate stiffness regulate portal fibroblast activation in culture.</a> Hepatology. 46, 1246-1256 (2007).</li>
<li>Bosselut, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+proteomic+features+of+two+fibrogenic+liver+cell+populations%3A+hepatic+stellate+cells+and+portal+myofibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">Distinct proteomic features of two fibrogenic liver cell populations: hepatic stellate cells and portal myofibroblasts.</a> Proteomics. 10, 1017-1028 (2010).</li>
<li>Dranoff, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ecto-nucleoside+triphosphate+diphosphohydrolase+NTPDase2%2FCD39L1+is+expressed+in+a+novel+functional+compartment+within+the+liver%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatology%22%5BJournal%5D)">The ecto-nucleoside triphosphate diphosphohydrolase NTPDase2/CD39L1 is expressed in a novel functional compartment within the liver.</a> Hepatology. 36, 1135-1144 (2002).</li>
</ol>

Non ci sono conflitti di interesse dichiarati.

Portale fibroblasti svolgono un ruolo importante nella fibrosi biliare. Qui descriviamo una modifica del protocollo originale pubblicato da Kruglov e Dranoff 8 per isolare fibroblasti portale da fegato di ratto, fornendo un modo semplice per studiare questa popolazione di cellule in vitro. Questo approccio utilizza digestione proteasica e basato sulle dimensioni filtrazione. Il principale vantaggio del metodo è che una popolazione di cellule relativamente pura può essere ottenuta senza passaggio in coltura, consentendo lo studio dell&#39;espressione genica o comportamento cellulare funzionale diversi giorni dopo l&#39;isolamento. Questa tecnica offre anche la possibilità di isolare cellule di fegato sani e malati. Una delle fasi più critiche di questo protocollo è la digestione enzimatica del parenchima epatico. Per garantire la digestione successo, è importante per confermare che il sangue è completamente scarica dal fegato durante la prima perfusionesione facendo in modo che non vi è ancora scottatura del fegato. Per facilitare ciò, è possibile utilizzare un batuffolo di cotone per massaggiare con delicatezza il fegato mentre perfusione. Più-digestione dei risultati parenchima del fegato in una bassa resa di cellule vitali, mentre sotto-digestione renderà difficile separare il parenchima epatico dal dell&#39;albero biliare. Dal momento che le preparazioni di pronasi hanno variabilità dell&#39;attività enzimatica tra lotti differenti, l&#39;ottimizzazione della quantità utilizzata potrebbe essere necessario quando c&#39;è bassa resa di cellule vitali. Questo protocollo può essere modificato per isolare i fibroblasti portale da fegato di topo o fegato di ratto giovane utilizzando un catetere piccolo calibro IV per incannulare la vena porta, diminuendo il volume di soluzioni di perfusione in proporzione al peso degli animali, e diminuendo la velocità di perfusione del fegato a circa 10 ml / min. Portal fibroblasti in coltura subiscono differenziazione miofibroblastico in 10-14 giorni, come evidenziato da α-SMA expressione 9. Marcatori sono stati utilizzati vari per distinguere fibroblasti portale da cellule stellate epatiche, incluse fibulin-2, IL-6, elastina, nucleoside trifosfato diphosphohydrolase-2 (NTPDase2), cofilina-1 e proteine ​​neuronali quali sinaptofisina 2, 6, 10, 11 . Abbiamo scoperto che l&#39;elastina è un buon marcatore per i fibroblasti del portale, anche dopo la differenziazione miofibroblastico, mentre NTPDase2 si perde dopo fibroblasti portale sono stati sottoposti a coltura dopo diversi giorni 9. Pertanto, di solito confermano l&#39;isolamento di fibroblasti portale mediante colorazione per immunofluorescenza elastina. Il limite di questa tecnica è che, immediatamente dopo l&#39;isolamento portale fibroblasti, vi è una piccola frazione di cellule contaminanti comprese cellule di Kupffer e le cellule biliari. Fibroblasti Portal sarà troppo grande per queste cellule contaminanti nel giro di 2-3 giorni, tuttavia, producendo una popolazione relativamente puro (&gt; 98%) 9. Since portale fibroblasti in coltura subiscono differenziazione miofibroblastico su plastica di coltura di tessuti, di solito studiano queste cellule entro 7 giorni di isolamento. Le cellule vengono mantenute in mezzi di coltura di fibroblasti portale contenenti 10% di siero fetale bovino, come descritto nella sezione Metodi. Tuttavia, queste cellule sopravviveranno in terreni di coltura contenente 2% di siero fetale bovino per diversi giorni. Noi di solito non usano mezzi a basso siero fino ad almeno 24 ore dopo l&#39;isolamento. Una volta fibroblasti portale subiscono differenziazione miofibroblastico, possono essere diversi passaggi più volte e conservato come stock congelati di miofibroblasti.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome del reattivo </td><td> Azienda </td><td> Numero di catalogo </td></tr><tr><td> Tipo 2 Collagenasi </td><td> Biochemical Worthington (Lakewood, NJ) </td><td> LS004177 </td></tr><tr><td> Pronasi </td><td> Roche (Indianapolis, IN) </td><td> 70290120 </td></tr><tr><td> Ialuronidasi </td><td> Sigma (St. Louis, MO) </td><td> H3506 </td></tr><tr><td> Deossiribonucleasi </td><td> Sigma </td><td> D4527 </td></tr><tr><td> DMEM/F12 </td><td> Invitrogen (Carlsbad, CA) </td><td> 11320 </td></tr><tr><td> HBSS senza Ca 2 + / Mg 2 + </td><td> Mediatech (Manassas, VA) </td><td> 21-021-CM </td></tr><tr><td> HBSS con Ca 2 + / Mg 2 + </td><td> Mediatech </td><td> 21-020-CM </td></tr><tr><td> Leibovitz L-15 </td><td> Invitrogen </td><td> 11415 </td></tr><tr><td> RPMI Media 1640 </td><td> Invitrogen </td><td> 11875 </td></tr><tr><td> Albumina di siero bovino </td><td> Sigma </td><td> A2153 </td></tr><tr><td> Siero fetale bovino </td><td> Gemini Bio (West Sacramento, CA) </td><td> 900-108 </td></tr><tr><td> Nitex Nylon Mesh 30 micron </td><td> Genesee Scientific (San Diego, CA) </td><td> 57-105 </td></tr></tbody></table>

isolamento dei fibroblasti portal ratto<em&gt; in situ</em&gt; fegato perfusione

Isolation of Rat Portal Fibroblasts by In situ Liver Perfusion

Fibrosi epatica è definita dalla eccessiva deposizione di matrice extracellulare da miofibroblasti attivati. Ci sono precursori multipli di miofibroblasti epatici, tra cui le cellule stellate epatiche, fibroblasti del portale e del midollo osseo fibroblasti derivati ​​1. Cellule stellate epatiche sono stati i più studiati, ma fibroblasti portali sono sempre più riconosciute come fattori importanti per la piscina miofibroblasti, in particolare nella fibrosi biliare 2. Portale subiscono la proliferazione dei fibroblasti in risposta alla lesione epiteliale biliare, potenzialmente giocare un ruolo chiave nelle fasi iniziali della biliare cicatrici 3-5. Un metodo per isolare fibroblasti portale consentirebbe studio in vitro di questa popolazione di cellule e portare ad una maggiore comprensione del ruolo fibroblasti portale svolgere nella fibrosi biliare. Fibroblasti portale sono stati isolati utilizzando varie tecniche tra cui escrescenza 6, 7 e liperfusione ver con la digestione enzimatica seguita dalla selezione del formato 8. Il vantaggio della digestione e selezione tecnica dimensioni rispetto alla tecnica escrescenza è che le cellule possono essere studiate senza la necessità di passaggio in coltura. Qui, si descrive una versione modificata della tecnica originale descritta da Kruglov e Dranoff 8 per l&#39;isolamento di fibroblasti portale da fegato di ratto che si traduce in una popolazione relativamente pura di cellule primarie.

Una tecnica per isolare fibroblasti portale dal fegato di ratto è descritto. I fegati sono perfusi e digerito<em&gt; In situ</em&gt; Con collagenasi, seguita da<em&gt; Ex vivo</emDigestione&gt; dell&#39;impasto fegato e selezione dimensioni delle cellule. Questo metodo fornisce una popolazione pura di fibroblasti portale senza la necessità di passaggio in coltura.

Isolamento dei fibroblasti Portal ratto<em&gt; In situ</em&gt; Fegato perfusione

La fibrosi epatica è definita dal deposito eccessivo di matrice extracellulare da parte di miofibroblasti attivati. Esistono molteplici precursori epatici...

L'obiettivo generale di questa procedura è isolare una popolazione relativamente pura di fibroblasti portali primari di ratto, senza la necessità di passaggi in coltura. Ciò viene ottenuto innanzitutto perfundendo in situ il fegato di ratto con una soluzione di collagenasi. Il secondo passaggio consiste nel separare l'albero biliare dal parenchima epatico.Successivamente, l’albero biliare viene ulteriormente digerito con soluzioni enzimatiche. L’ultimo passaggio consiste nel far passare l’albero biliare digerito attraverso un filtro fine per isolare i fibroblasti portali mediante selezione per dimensione; infine, la microscopia a immunofluorescenza per elastina e actina muscolare liscia alpha può essere utilizzata per dimostrare la popolazione relativamente pura di fibroblasti portali ottenuta dal fegato di ratto.Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti, come la tecnica di espansione, è che gli altri metodi richiedono che i fibroblasti portali vengano coltivati come patogeni prima di poter essere studiati. Con questo metodo, una popolazione relativamente pura di cellule primarie può essere direttamente recuperata dal fegato senza la necessità di coltivare cellule patogene. Prima di iniziare la procedura, preparare il sistema di perfusione con HBSS caldo privo di calcio e magnesio. Successivamente, una volta confermata la sedazione mediante pinzatura della zampa, posizionare il ratto maschio adulto anestetizzato in posizione supina su un vassoio di plastica e fissare gli arti al vassoio con del nastro adesivo.Dopo aver pulito l'addome con etanolo al 70%, praticare una piccola incisione nella cute lungo la linea mediana addominale utilizzando forbici sterili. Eseguire un'ampia incisione a U sull'addome per dissezionare la cute dalla fascia, quindi tagliare il tessuto muscolare addominale nello stesso modo per esporre la cavità peritoneale. Successivamente, utilizzare due bastoncini di cotone per spostare delicatamente le viscere addominali sul lato destro, esponendo così la vena porta.Quindi passare due suture sterili in seta 2.0 sotto la vena porta e annodarle leggermente. Ora cannullare la vena porta con un catetere endovenoso di calibro da 16 a 18 e fissare il catetere stringendo le suture. Iniettare eparina diluita attraverso il catetere endovenoso.Notare che il fegato diventerà pallido. Quando perfuso correttamente, collegare il catetere endovenoso al sistema di perfusione e perfondere il fegato con HBSS privo di calcio e magnesio.Tagliare la vena cava inferiore al di sotto del fegato per consentire il deflusso del sangue ed eseguire un'irrigazione di otto, aspirando il sangue man mano che entra nella cavità addominale. Continuare l'irrigazione a un ritmo di 20 millilitri al minuto. Dopo che l'irrigazione con HBSS è terminata, attendere 10 minuti, quindi sostituire il liquido di perfusione con una soluzione di collagenasi allo 0,3%. Coprire il fegato con la precedente lembo addominale dissezionato per mantenerlo umido durante l'irrigazione con collagenasi.Mantenere la temperatura intraaddominale a circa 37 gradi Celsius posizionando un coperchio di una piastra di Petri sulla leva addominale e collocando una lampada a calore sulla zona. Iniziare rimuovendo il fegato perfuso dall'animale e ponendolo in una piastra sterile per colture cellulari riempita con Leibovitz's L 15 freddo, operando sotto cappa a flusso laminare.Sfilare la capsula epatica e delicatamente separare il parenchima epatico con una pinzetta. Spostare il fegato attraverso diverse capsule riempite con mezzo L 15 di Levy, continuando a staccare il parenchima fino a quando l'albero biliare non è completamente isolato. Si noti che il parenchima epatico è di colore bruno-giallastro, mentre l'albero biliare è bianco.Posizionare l'albero biliare in un tubo conico da 50 millilitri riempito con 10 millilitri di soluzione di penicillina-streptomicina, quindi mettere il tubo sul ghiaccio per 15 minuti. Successivamente, trasferire l'albero biliare in un tubo da 50 millilitri pulito e tritarlo con forbici sterili. Aggiungere quindi circa cinque millilitri di soluzione enzimatica numero uno al tubo, continuando a tritare l'albero biliare fino a raggiungere la consistenza di una sospensione.Versare la sospensione in una bottiglia di vetro sterile. Lavare il tubo con la soluzione rimanente, numero uno, quindi versare la soluzione nella bottiglia di vetro. Incubare la sospensione di tessuto a 37 gradi Celsius con agitazione a 100 giri al minuto per 30 minuti, quindi filtrare la sospensione in un becher coperto con un singolo strato di 30 micron.Versare la rete di nylon. Successivamente, versare circa 25 millilitri della soluzione numero due in una piastra di Petri sterile da 15 centimetri. Quindi rimuovere con attenzione la rete dal becher tenendola ai bordi.Ora capovolgere la maglia e immergerla nella soluzione nella piastra di Petri. Per rimuovere qualsiasi residuo di tessuto, trasferire la soluzione dalla piastra di Petri in un flacone di vetro pulito. Risciacquare quindi la piastra di Petri con i restanti 25 millilitri della soluzione numero due e trasferire il risciacquo nello stesso flacone di vetro.Incubare la soluzione di tessuto nella bottiglia di vetro a 37 gradi Celsius con agitazione a 100 giri al minuto per 30 minuti. Nel frattempo, versare il filtrato dal becher in un tubo da 50 millilitri. Dopo aver centrifugato il filtrato a 460 ×g per cinque minuti a temperatura ambiente, aspirare il mezzo e risospendere il pellet in 25 millilitri di soluzione numero tre.Ora filtrare la soluzione tissutale dalla bottiglia di vetro in un secondo becher pulito, coperto con un nuovo filtro da 30 micron. Successivamente, dopo aver centrifugato la soluzione tissutale, risospendere questo pellet con 25 millilitri della soluzione numero tre; quindi unire le due frazioni di sospensione tissutale e, dopo aver centrifugato la soluzione combinata, risospendere il pellet in 10 millilitri di mezzo di coltura per fibroblasti portali. Infine, dopo aver contato le cellule per la piastratura in base alla vitalità, seminare le cellule a una concentrazione di circa 0,5-5 × 10⁶ cellule per piastra di coltura tissutale da 10 centimetri.Qui vengono mostrati fibroblasti portali primari rappresentativi al primo, terzo e settimo giorno dopo l'isolamento. Si noti che le cellule sono allungate e presentano una tipica morfologia di fibroblasto. Le cellule possono essere colorate con anticorpo anti-elastina, mostrato in verde, per confermare la purezza.Inoltre, osservare come i fibroblasti portali subiscano una differenziazione miofibroblastica in coltura, dimostrata in questa figura dalla colorazione immunoistochimica rossa per l'actina alfa del muscolo liscio. Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come isolare fibroblasti portali primari da un fegato rosso mediante la perfusione epatica.

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I leucociti epatici marginanti mostrano caratteristiche uniche e funzioni immunologiche distinte rispetto ad altre popolazioni di leucociti. Qui descriviamo un metodo per il prelievo selettivo di questa specifica popolazione di cellule epatiche, attraverso la perfusione forzata del fegato di ratti o topi. I leucociti epatici marginanti sembrano fondamentali nel determinare la suscettibilità alle malattie e alle metastasi epatiche.

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L'obiettivo del presente protocollo è quello di ottenere alta attuabilità e ad alto rendimento di epatociti e cellule endoteliali sinusoidali dal fegato. Ciò avviene mediante che irrora il fegato con una soluzione di collagenasi tipo IV tramite la vena portale, seguita da centrifugazione differenziale per ottenere gli epatociti e le cellule endoteliali sinusoidali.

Purificazione di epatociti e cellule endoteliali sinusoidali da fegato di topo perfusione

Questo è un protocollo per isolare le vesciche extracellulari del tessuto (EV) dal fegato. Il protocollo descrive un processo in due fasi che coinvolge la perfusione di collagenasi seguito da ultracentrifugazione differenziale per isolare gli EV del tessuto epatico.

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Questo protocollo descrive l'uso di uno speciale catetere endovenoso, tubi monouso sterili standardizzati, controllo della temperatura integrato da monitoraggio in tempo reale e un sistema di allarme per la procedura di perfusione della collagenasi in due fasi per migliorare la coerenza nella vitalità, nella resa e nella funzionalità degli epatociti primari isolati di ratto.

Isolamento degli epatociti primari di ratto con controllo della perfusione multiparametrica

Qui delineiamo e dimostriamo un protocollo per l'isolamento primario delle cellule endoteliali sinusoidali epatiche del topo (LSEC). Il protocollo si basa sulla perfusione di collagenasi epatica, sulla purificazione delle cellule non parenchimali mediante centrifugazione a bassa velocità e sulla selezione magnetica delle perline CD146. Abbiamo anche fenotipo e caratterizzato questi LSECs isolati utilizzando la citometria a flusso e la microscopia elettronica a scansione.

Isolamento e caratterizzazione di cellule endoteliali sinusoidali primarie del fegato di topo

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Ex Vivo Perfusione epatica attraverso la vena porta nel topo

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Perfusione epatica di ratto e isolamento degli epatociti primari: una vecchia procedura cruciale per la coltura di organoidi 3D all'avanguardia

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Isolamento dei fibroblasti Portal ratto

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