Name: Tリンパ球に向かって誘導多能性幹細胞の分化の指示 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-05-14T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 47 s
Description: 学ぶiPS細胞からTリンパ球を誘導分化させる方法。OP9-DL1培養系とラグ欠損マウスを用いて、抗原特異的T細胞を産生し、腫瘍免疫療法への応用可能性を評価する技術です。

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我々は、OT1-2A•pMig II構造、博士はファンをサポートするためのIPS-MEF-NG-20D-17細胞株は、博士ダリオVignali（セントジュード小児研究病院）を提供するための博士山中伸弥（京都大学）に感謝本研究の設計を支援するためのカルロスOP9-DL1のセルラインをサポートするためのスニガ-Pflucker（免疫学教室、トロント大学）、博士ケントEブラーナ（薬理学教室医学のペンシルベニア州立大学）。このプロジェクトは、国立がん研究所、Barsumian信頼とメラノーマ研究財団（J.の歌）からのグラント番号K18CA151798の助成のもと、運営されている。

<ol><li>Brenner, M. K., Heslop, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adoptive+T+cell+therapy+of+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Adoptive T cell therapy of cancer.</a> Curr. Opin. Immunol. 22, 251-257 (2010).</li>
<li>Hataye, J., Moon, J. J., Khoruts, A., Reilly, C., Jenkins, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Naive+and+memory+CD4%2B+T+cell+survival+controlled+by+clonal+abundance%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Naive and memory CD4+ T cell survival controlled by clonal abundance.</a> Science. 312, 114-116 (2006).</li>
<li>Seki, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IL-7%2FSTAT5+cytokine+signaling+pathway+is+essential+but+insufficient+for+maintenance+of+naive+CD4+T+cell+survival+in+peripheral+lymphoid+organs%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">IL-7/STAT5 cytokine signaling pathway is essential but insufficient for maintenance of naive CD4 T cell survival in peripheral lymphoid organs.</a> J. Immunol. 178, 262-270 (2007).</li>
<li>Stemberger, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+single+naive+CD8%2B+T+cell+precursor+can+develop+into+diverse+effector+and+memory+subsets%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">A single naive CD8+ T cell precursor can develop into diverse effector and memory subsets.</a> Immunity. 27, 985-997 (2007).</li>
<li>Siewert, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experience-driven+development%3A+effector%2Fmemory-like+alphaE%2BFoxp3%2B+regulatory+T+cells+originate+from+both+naive+T+cells+and+naturally+occurring+naive-like+regulatory+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Experience-driven development: effector/memory-like alphaE+Foxp3+ regulatory T cells originate from both naive T cells and naturally occurring naive-like regulatory T cells.</a> J. Immunol. 180, 146-155 (2008).</li>
<li>Wang, L. X., Plautz, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor-primed%2C+in+vitro-activated+CD4%2B+effector+T+cells+establish+long-term+memory+without+exogenous+cytokine+support+or+ongoing+antigen+exposure%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Tumor-primed, in vitro-activated CD4+ effector T cells establish long-term memory without exogenous cytokine support or ongoing antigen exposure.</a> J. Immunol. 184, 5612-5618 (2010).</li>
<li>Hinrichs, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+effector+CD8%2B+T+cells+derived+from+naive+rather+than+memory+subsets+possess+superior+traits+for+adoptive+immunotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Human effector CD8+ T cells derived from naive rather than memory subsets possess superior traits for adoptive immunotherapy.</a> Blood. 117, 808-814 (2011).</li>
<li>Alajez, N. M., Schmielau, J., Alter, M. D., Cascio, M., Finn, O. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Therapeutic+potential+of+a+tumor-specific%2C+MHC-unrestricted+T-cell+receptor+expressed+on+effector+cells+of+the+innate+and+the+adaptive+immune+system+through+bone+marrow+transduction+and+immune+reconstitution%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Therapeutic potential of a tumor-specific, MHC-unrestricted T-cell receptor expressed on effector cells of the innate and the adaptive immune system through bone marrow transduction and immune reconstitution.</a> Blood. 105, 4583-4589 (2005).</li>
<li>Yang, L., Baltimore, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+in+vivo+provision+of+antigen-specific+T+cell+immunity+by+programming+hematopoietic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Long-term in vivo provision of antigen-specific T cell immunity by programming hematopoietic stem cells.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 102, 4518-4523 (2005).</li>
<li>Zhao, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extrathymic+generation+of+tumor-specific+T+cells+from+genetically+engineered+human+hematopoietic+stem+cells+via+Notch+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Extrathymic generation of tumor-specific T cells from genetically engineered human hematopoietic stem cells via Notch signaling.</a> Cancer Res. 67, 2425-2429 (2007).</li>
<li>Boztug, K. Stem-cell gene therapy for the Wiskott-Aldrich syndrome. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBoztug%2C+K+%22N.+Engl.+J.+Med%22">N. Engl. J. Med</a>. Med, N. .E. ngl.J. . 363, 1918-1927 (2010).</li>
<li>Peerani, R., Zandstra, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enabling+stem+cell+therapies+through+synthetic+stem+cell-niche+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Invest%22%5BJournal%5D)">Enabling stem cell therapies through synthetic stem cell-niche engineering.</a> J. Clin. Invest. 120, 60-70 (2010).</li>
<li>Mendez-Ferrer, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesenchymal+and+haematopoietic+stem+cells+form+a+unique+bone+marrow+niche%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Mesenchymal and haematopoietic stem cells form a unique bone marrow niche.</a> Nature. 466, 829-834 (2010).</li>
<li>Daley, G. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Towards+the+generation+of+patient-specific+pluripotent+stem+cells+for+combined+gene+and+cell+therapy+of+hematologic+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Hematology+Am.+Soc.+Hematol.+Educ.+Program%22%5BJournal%5D)">Towards the generation of patient-specific pluripotent stem cells for combined gene and cell therapy of hematologic disorders.</a> Hematology Am. Soc. Hematol. Educ. Program. , 17-22 (2007).</li>
<li>Boitano, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aryl+hydrocarbon+receptor+antagonists+promote+the+expansion+of+human+hematopoietic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Aryl hydrocarbon receptor antagonists promote the expansion of human hematopoietic stem cells.</a> Science. 329, 1345-1348 (2010).</li>
<li>Himburg, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pleiotrophin+regulates+the+expansion+and+regeneration+of+hematopoietic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Med%22%5BJournal%5D)">Pleiotrophin regulates the expansion and regeneration of hematopoietic stem cells.</a> Nat. Med. 16, 475-482 (2010).</li>
<li>Tanigaki, K., Honjo, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+lymphocyte+development+by+Notch+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+immunology%22%5BJournal%5D)">Regulation of lymphocyte development by Notch signaling.</a> Nature immunology. 8, 451-456 (2007).</li>
<li>Zhao, T., Zhang, Z. N., Rong, Z., Xu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunogenicity+of+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Immunogenicity of induced pluripotent stem cells.</a> Nature. 474, 212-215 (2011).</li>
</ol>

利害の衝突が宣言されません。

<html> ACT-ベースの治療のために、in vivoでの再注入のための反応性の高い銀特異的T細胞の多数の in vitro生成の最適なアプローチです。私たちのin vitro法では、iPS細胞、iPS細胞由来の細胞は、特に4週目、4週間で死亡し、多数のより機能的なT細胞の増加を与えるが。我々は、ノッチからの生存信号がDL1と同様にIL-7とFLt3LがiPS細胞由来の前駆T細胞の生存を維持するのに十分ではありませんによって媒介されるシグナル伝達と結論付け、他の生存因子は、これらの細胞の成熟を調節するために協同組合があります。 TCR遺伝子導入やiPS細胞からのNotchリガンド主に直接T細胞分化のin vitro刺激しかし、iPS細胞由来の抗原特異的T細胞は、まだiPS細胞由来の抗原の適切な番号を取得するために防止する生存期間の延長、することはできませんACT-ベースの免疫療法のための特異的なT細胞。 ve_content &quot;&gt;胸腺におけるTリンパ球の開発は、秩序のプロセスです。CD4とCD8の発現を...

<table border="1"><tbody><tr><td> 試薬の名前 </td><td> 会社 </td><td> カタログ番号 </td></tr><tr><td> C57BL/6Jマウス</td><td>ジャクソン研究所</td><td> 000664 </td></tr><tr><td> B6.129S7-RAG1 tm1Mom / J </td><td>ジャクソン研究所</td><td> 002216 </td></tr><tr><td>抗CD3（2C11）抗体</td><td> BD PharMingen社</td><td> 553058 </td></tr><tr><td>抗CD28（37.51）抗体</td><td> BD PharMingen社</td><td> 553295 </td></tr><tr><td>抗CD3（17A2）抗体</td><td> BioLegend </td><td> 100202 </td></tr><tr><td>抗CD4（GK1.5）抗体</td><td> BioLegend </td><td> 100417 </td></tr><tr><td>抗CD8（53から6.7）抗体</td><td> BioLegend </td><td> 100714 </td></tr><tr><td>抗CD25（3C7）抗体</td><td> BioLegend </td><td> 101912 </td></tr><tr><td>不定冠詞TI-CD44（1M7）抗体</td><td> BioLegend </td><td> 103012 </td></tr><tr><td>抗CD117（2B8）抗体</td><td> BioLegend </td><td> 105812 </td></tr><tr><td>抗TCR-β（H57597）抗体</td><td> BioLegend </td><td> 109220 </td></tr><tr><td>抗IL-2（JES6-5H4）抗体</td><td> BioLegend </td><td> 503810 </td></tr><tr><td>抗IFN-γ（XMG1.2）抗体</td><td> BioLegend </td><td> 505822 </td></tr><tr><td> DMEM </td><td>インビトロジェン</td><td> ABCD1234 </td></tr><tr><td> α-MEM </td><td>インビトロジェン</td><td> A10490-01 </td></tr><tr><td> FBS </td><td>ハイクローン</td><td> SH3007.01 </td></tr><tr><td>ブレフェルジン</td><td>シグマ</td><td> B7651 </td></tr><tr><td>ポリブレン</td><td>シグマ</td><td> 107689 </td></tr><tr><td> GeneJammer </td><td>統合された科学</td><td> 204130 </td></tr><tr><td> RNAキット&lt;/ TD&gt; <td>キアゲン</td><td> 74104 </td></tr><tr><td> DNAキット</td><td>キアゲン</td><td> 69504 </td></tr><tr><td> CD8アイソレーションキット</td><td>ミルテニーバイオテク</td><td> 130-095-236 </td></tr><tr><td> ACK溶解緩衝液</td><td>ロンザ</td><td> 10-548E </td></tr><tr><td> mFlt-3L </td><td>ぺプロ</td><td> 250-31L </td></tr><tr><td> MIL-7 </td><td>ぺプロ</td><td> 217から17 </td></tr><tr><td>ゼラチン</td><td>シグマ</td><td> G9391 </td></tr><tr><td> FITC-抗OVA抗体</td><td>ロックランドのImmunochemicals </td><td> 200-4233 </td></tr><tr><td>透過バッファ</td><td> Biolegend </td><td> 421002 </td></tr><tr><td> BSA </td><td>シグマ</td><td> A7906 </td></tr><tr><td>ホルムアルデヒド</td><td>シグマ</td><td> F8775 </td></tr><tr><td> 0.4μmのフィルター</td><td>ミリポア</td><td></td></tr><tr><td&gt; Mofloセルソーター</td><td>岳サイトメー</td><td></td></tr><tr><td>ソウルキャリバーフローサイトメーター</td><td> BD </td><td></td></tr><tr><td> LSR IIフローサイトメーター</td><td> BD </td><td></td></tr><tr><td>マウス制止する</td><td>トリーサイエンティフィック</td><td></td></tr></tbody></table>

tリンパ球に向かって誘導多能性幹細胞の分化の指示

Directed Differentiation of Induced Pluripotent Stem Cells towards T Lymphocytes

抗原特異的CD8 +細胞傷害性Tリンパ球（CTL）の養子細胞移植（ACT）は、悪性腫瘍の1様々な有望な治療法です。 CTLは、悪性細胞を殺すためにT細胞受容体（TCR）、およびリリース毒素だけでなく、サイトカインと腫瘍抗原を作用することにより悪性腫瘍細胞を認識することができます。これは、これらのCTLは、高い増殖能を持っているより分化した細胞よりもアポトーシスが少ない傾向があると持っているのであまり差別化（ 高反応性と呼ばれる）は、中央メモリのようなCTLは、ACT-ベースの免疫療法に最適な集団であることが知られている恒常性サイトカイン2-7に応答する能力が高い。しかし、患者からこのようなCTLの高い数値を得ることが困難なため、成功したACT-ベースの治療のために反応性の高い銀特異的CTLを生成するための新しいアプローチを見つけることが急務である。 自己再生幹細胞のTCR伝達免疫再構築のための細胞が病気8月10日の治療のための治療可能性を秘めています。しかし、患者から胚性幹細胞（ESCは）を取得するためのアプローチは現実的ではありません。治療目的のための造血幹細胞（HSC）の使用は広くクリニック11-13に適用されていますが、造血幹細胞は、分化と増殖能力が低下していると、造血幹細胞は 、in vitro細胞培養14-16で展開することが困難である。最近のiPS細胞技術と遺伝子送達のためのin vitro系の開発は、すべての外科的アプローチせずに患者からiPS細胞を生成することができる。さらに、ESCのように、iPS細胞は 、in vitro で無限増殖能を有しており、造血細胞に分化することが示されている。このように、iPS細胞は、ESCのまたは造血幹細胞に比べ、ACTベースの免疫療法で使用される大きな可能性を持っています。 ここでは、Tリンパ球を生成するための方法を提示in vitroで 、やiPS細胞からの抗原特異的CTL の in vivoでのプログラミングにおける癌免疫監視を促進するためのiPS細胞からcytes。 Notchリガンドのin vitroでの刺激は、iPS細胞からT細胞分化を駆動し、腫瘍の増殖を防ぐことが生体内で抗原特異的T細胞に分化するiPS細胞のTCR遺伝子導入の結果。したがって、私たちは、iPS細胞からの抗原特異的T細胞の分化を示しています。我々の研究では、ACT-ベースの治療のための抗原特異的CTLを生成するための潜在的に、より効率的なアプローチを提供し、疾患の治療戦略の開発を容易にします。

人工多能性幹（iPS）細胞からTリンパ球の生成は、T細胞ベースの免疫療法のために胚性幹細胞を使用する代替アプローチを提供します。メソッドは、どちらを利用することによってことを示しています<em&gt; in vitroで</em&gt;または<emin vivoでの&gt;</em&gt;誘導システムでは、iPS細胞は従来、抗原特異的Tリンパ球の両方に分化することができます。

Tリンパ球に向かって誘導多能性幹細胞の分化の指示

抗原特異的CD8+細胞傷害性Tリンパ球（CTL）の養子細胞移植（ACT）は、さまざまな悪性腫瘍に対する有望な治療法である1。CTLは...

この手順の全体的な目的は、人工多能性幹細胞（iPS細胞）からTリンパ球を生成し、その特性を解析することです。iPS細胞は、OP9-DL1培養系を用いてin vitroで分化させ、その後、Rag欠損マウスを用いてin vivoで成熟させることができます。あるいは、細胞を遺伝子工学的に操作してOT-1 TCRを過剰発現させ、in vivoでの発達のために養子移入させることも可能です。6週間のin vivo分化後、マウスにEEG seven腫瘍細胞を腹腔内投与してチャレンジを行い、iPS細胞由来T細胞の抗原特異性を評価できます。最終的に、iPS細胞は従来型T細胞と抗原特異的T細胞の両方に分化可能であり、後者は腫瘍チャレンジから動物を保護することができます。この手法の意義は、個別の癌免疫療法への応用にまで及びます。この手法により、最小限の患者の血液または皮膚組織から、大量の腫瘍反応性T細胞を生成することが可能です。0日目に、20% FBS含有α-MEM培地を用いて、合流したOP9-DL1細胞の単層を含む100 mm培養皿に5×10⁴個のiPS細胞を播種します。5日目に、トリプシン処理を行います。その後、細胞を新鮮な100 mm培養皿で37℃のインキュベーター内で30分間インキュベートし、遠心分離します。20% FBS含有α-MEM培地およびマウスFlt3リガンドを用い、OP9-DL1細胞の単層を含む新しい100 mm皿に、浮遊細胞のうち5×10⁵個を播種します。8日目に、緩く付着している細胞をピペッティングで優しく回収し、遠心分離した後、合流したOP9-DL1細胞でコートされた6ウェル培養プレートの1ウェルに細胞を移します。細胞を37°C、5% CO₂条件下でさらに2週間インキュベートします。22日目に。分離したiPS細胞を新しい培養皿に入れ、新鮮な培地で37°Cで30分間インキュベートします。次に、浮遊細胞の約半分を取り除き、70 µmのナイロンストレーナーに通して細胞塊を除去し、得られた単一細胞懸濁液を冷PBSで3回洗浄します。3回目の洗浄後、細胞を1.5 × 10⁷ cells/mLの濃度になるようPBSで再懸濁し、静脈内投与まで氷上で保持します。4週齢のrag欠損マウスを赤外線ランプの下に置き、尾静脈を拡張させます。次に、26.5ゲージの針を装着した1mLシリンジに200µLの細胞懸濁液を満たし、拡張させた尾静脈から細胞を養子移入します。3週間後、養子移入したマウスが安楽死したことを確認し、組織を機械的に破砕した後、リンパ節と脾臓を回収します。CK溶出バッファーを用いて単一細胞懸濁液を溶解し、得られた単核球を冷PBSで2回洗浄します。その後、細胞表面マーカーで染色し、0日目にフローサイトメトリー解析で細胞を評価します。1日目に、JAMA遺伝子導入試薬を用いて、プレートに播種したPlate Eパッケージング細胞にOT1-MIDRをオーバーナイトで導入します。2日目に、0.1%ゼラチンでプレコートした24ウェルプレートの1ウェルに1×10⁶個のiPS細胞を播種します。Plate E細胞から擬似ウイルスを含む上清を回収し、遠心分離後、0.4 µmフィルターに通して潜在的な不純物を除去します。ポリブレン存在下で、32°C、330 ×gで1時間、細胞を導入します。導入手順を繰り返した後、同温度で一晩インキュベートします。4日目に導入されたiPS細胞をトリプシンで処理し、ペレット化した後、細胞を新鮮な培地で再懸濁し、あらかじめコーティングされた照射済みsnl 7 6 7フィーダー細胞上に播種します。導入細胞がコンフルエントに達したら、フローサイトメトリーを用いてGFPおよびDsRedのダブルポジティブ細胞を分取します。iPS細胞の養子移行から6週間後、腫瘍負荷の50日目に、同一マウスの腹腔内に50 µLのEEG-7腫瘍細胞を注入します。Miltenyi Biotec社のCD8陽性T細胞分離キットを用いて、養子移行を行った動物の脾臓およびリンパ節からCD8陽性T細胞を分取します。単離したCD8陽性T細胞を、ナイーブなC57BL/6Jマウス由来の照射済み脾細胞と1:10の比率で混合し、0.5 µmol/mLのOVAで40時間共培養してパルスします。その後、さらに4時間、細胞にfelden Aを添加します。最後に、フローサイトメトリー分析により細胞集団を評価します。naive C 57 black six JマウスからSP細胞を分離した後、細胞懸濁液を2つのグループに分けます。CFSE high群を5 µM/mLのCFSEでラベルし、10 µg/mLのovaペプチドで1時間パルスし、CFSE low群を0.5 µM/mLのCFSEでラベルし、パルスは行わない。PBS中で、2.5 × 10⁶個のCFSE high細胞と2.5 × 10⁶個のCFSE low細胞を混合する。その後、フローサイトメトリーにより細胞のCFSE発現を解析する。対象のマウスに養子転送を行ってから16時間後、腫瘍チャレンジの20日目に腹腔内腫瘍細胞数を測定します。18.5ゲージの針を装着した10 mLシリンジと冷PBSを用いて、腹腔を洗浄します。回収した腫瘍細胞を計数し、腫瘍浸潤細胞を同定します。腫瘍チャレンジの後期段階で腫瘍を摘出し、その後、腫瘍を3等分に切断します。1つ目の腫瘍片をクライオバイアルに入れ、バイアルをドライアイスの上に置きます。2つ目の腫瘍片は直ちにホルムアルデヒドで固定します。凍結保存した組織切片を風乾させた後、条件付け済みのRPMI 1640培地中で3枚目の切片を保存します。固定した切片をさらに15分間風乾させた後、冷 acetone 中で15分間固定します。その後、PBSで5分間スライドを洗浄します。スライドを湿潤チャンバーに入れ、非特異的結合をブロックするため、組織切片に3% B, SAおよびPBSを30 µL添加し、30分間静置します。その後、ブロッキングバッファーをブロットオフし、3% PSA含有PBSで希釈したpe anti TCR RV alpha two抗体とfitzy anti ova抗体の混合液50 µLを用いて、湿潤チャンバー内で2時間、組織切片をインキュベートします。インキュベーション終了後、スライドを冷PBSで3回洗浄します。最後に、腫瘍浸潤T細胞のフローサイトメトリー解析のための蛍光顕微鏡観察を行う前に、水溶性封入剤で切片を封入します。腫瘍を押し潰して単一細胞懸濁液にします。次に、特定の表面マーカーについて細胞を解析します。T細胞のマーカーとしてCD3およびTCRβを用い、NotchリガンドDL1によるiPS細胞の刺激がT細胞への分化に寄与するかを検討しました。CD3陽性かつTCRβ陽性のiPS細胞由来細胞におけるCD4およびCD8の細胞表面発現を評価しました。右側のドットプロットは、in vitroでiPS細胞から分化誘導された、22日目のCD3陽性TCR β陽性CD4陰性CD8陽性のシングルポジティブT細胞を示しています。さらに、前図のiPS細胞由来シングルポジティブ細胞は、プレートコートした抗CD3抗体および可溶性抗CD28抗体でin vitro刺激した際にインターロイキン2およびインターフェロンガンマを産生し、受容マウスへ養子移殖した後のiPS細胞由来T細胞が機能的であることが確認されました。TCR遺伝子を導入したiPS細胞の大部分はCD8陽性CTLへと分化し、プールしたリンパ節および脾臓細胞を用いたこれらのドットプロットにおいて、ペプチド刺激に対しインターロイキン2およびインターフェロンガンマを分泌することでin vitroで応答しました。TCRを導入したiPS細胞を養子移入したマウスでは、CD8陽性Vβ5陽性T細胞が生成されましたが、コントロールを導入したiPS細胞では生成されませんでした。CD8陽性Vβ5陽性集団において、インターロイキン2およびインターフェロンガンマ産生の細胞内サイトカイン染色が陽性であり、これはシェーディングされたアイソタイプコントロールのヒストグラムと比較して、これらのヒストグラムの濃い線で示されています。これにより、iPS細胞由来のCTLが機能的であることが示されました。これらのデータは、iPS細胞移入の10週間後、またはOT-I CTL移入の1日後にマウスに注入された、エペプチドでパルスしたCFSE high細胞（各グラフの右側のピーク）およびCFSE lowコントロール細胞（左側のピーク）を示しています。抗原特異的なiPS細胞由来CTLは抗原刺激に応答し、ここでCFSE high細胞が消失していることから、細胞傷害活性を有することが示されました。OT-I TCR遺伝子を導入したiPS細胞をC57BL/6マウスに養子移入し、その後EEG7腫瘍細胞でチャレンジを行いました。20日目に腹腔内の腫瘍細胞数を計測しました。コントロール群と比較して、TCR導入iPS細胞を投与したマウスでは、腫瘍細胞数が有意に減少していることに注目してください。最も重要な点として、TCR導入iPS細胞の養子移殖により、過剰反応するCTLの腫瘍組織への浸潤が誘導され、腫瘍チャレンジから動物が保護されたことが、腫瘍チャレンジ後30〜35日に回収した腫瘍組織のH&amp;E染色で示されています。TCR導入細胞またはOT-I CTLを養子移殖したマウスの腫瘍ではこの浸潤が見られましたが、擬似注入（mock injection）群やコントロール群では見られませんでした。ここにある赤色の矢印で示されているように、導入細胞には炎症細胞が浸潤していました。赤色で示されたOva特異的Vα2陽性CTLが、緑色で示されたOva発現腫瘍組織に浸潤していることが確認されました。この図において、対照群のマウスにおける腫瘍では腫瘍浸潤細胞が少ないか、あるいは認められませんでしたが、腫瘍組織からの単一細胞懸濁液をフローサイトメトリーで解析し、CD8陽性集団をゲートした後にVα2陽性とVβ5陽性の発現を分析しました。TCRを導入したiPS細胞を養子移植したマウスの腫瘍組織では、腫瘍浸潤細胞が最も高いレベルで認められたのに対し、対照的な導入iPS細胞を投与したマウスの腫瘍では、ova特異的CD8陽性T細胞の浸潤は見られませんでした。このビデオを視聴することで、iPS細胞から抗原特異的T細胞を生成する方法、およびiPS細胞由来T細胞の機能を評価する方法について、十分に理解できるはずです。

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我々は、単一のヒトの血液ドナーからの規制は、メモリとナイーブT細胞を生成する方法を説明します。偏Tregsのは、その後もここで詳述抑制アッセイを含む遺伝的均一性を持つ遺伝子や機能のさまざまなアプリケーション内の他のサブセットと比較することができます。...

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ここでは、簡単な手動タンパク質沈殿ステップとオンラインカラム抽出を使用して、乾燥血液スポット中の免疫抑制剤タクロリムスを定量するための高速液体クロマトグラフィー-タンデム質量分析(HPLC-MS/MS)アッセイについて説明します。...

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ヒト多能性幹細胞における転写因子の過剰発現によって、造血内皮と血液の直接誘導

このプロトコルの目標は、メラノーマ腫瘍浸潤リンパ球を人工多能性幹細胞に再プログラミングするためのプロトコルを示すことです。...

ヒトメラノーマ腫瘍浸潤リンパ球から誘導多能性幹細胞の生成

ここでは、マウスモデルにおける自己免疫性関節炎の免疫療法のために、人工多能性幹細胞(iPSC)から機能的な抗原(Ag)特異的制御性T細胞(Tregs)を開発する方法を紹介します。...

自己免疫に対する幹細胞由来の抗原特異的制御性T細胞の開発

このプロトコルは、in vitroでのナイーブCD4 + T細胞から人為的な制御性T細胞（iTregs）の再現性の生成と表現型を説明しています。 Foxp3誘発のための異なるプロトコルは、それぞれのプロトコルを用いて得られた特定のiTregの表現型の研究を可能にします。...

TGF-βを含むプロトコルを使用したナイーブCD4 + T細胞からのヒトCD4 + FOXP3 +誘導された調節性T細胞（iTregs）のインビトロ分化における

本論文では、三次元(3D)胸腺培養系により腫瘍抗原特異的誘導多能性幹細胞由来の甲状腺系(iTE)を生成する新しい方法について説明する。iTEは、増殖、記憶形成、腫瘍抑制の能力を有するナイーブT細胞と密接に関連するT細胞の均質なサブセットである。...

マウス誘導多能性幹細胞由来腫瘍抗原特異的胸腺移民を生成する三次元胸腺培養システム

本稿では、OP9/DLL1共培養系を用いて機能性腫瘍抗原特異的人工多能性幹細胞由来CD8αβ+単陽性T細胞を生成する方法について説明する。...

腫瘍抗原特異的T細胞の生成にヒト誘導多能性幹細胞を用いた

ここに提示されるのは、幹細胞由来ウイルス抗原(Ag)特異的Tリンパ球の養子細胞転写(ACT)を利用してマウスにおけるB型肝炎ウイルス(HBV)複製の効果的な抑制のためのプロトコルである。この手順は、HBV感染の潜在的なACTベースの免疫療法に適合してもよい。...

幹細胞由来ウイルスAg特異的Tリンパ球はマウスにおけるHBV複製を抑制する

学ぶiPS細胞からTリンパ球を誘導分化させる方法。OP9-DL1培養系とラグ欠損マウスを用いて、抗原特異的T細胞を産生し、腫瘍免疫療法への応用可能性を評価する技術です。

Tリンパ球に向かって誘導多能性幹細胞の分化の指示

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