Name: Preparando-se Fator de Crescimento de Células T esplenócitos Rat (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2007-10-31T22:24:33.000+00:00
Duration: 18 min 27 s
Description: Aprenda a preparar fator de crescimento de células T (TCGF) para expansão de linfócitos T em ratos. Este método utiliza baço de ratos saudáveis e concanavalina A para produzir citocinas essenciais em cultura celular.

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<ol><li> Tome baços de ratos Lewis (ratos entre 160-200g são os melhores). Dilacerar no gelo numa placa de Petri contendo PBS + antibióticos (PBS-PS) usando um filtro de células. Coloque em um tubo de 50 ml. Preencher com PBS-PS. </li><li> Giro por 10 min a 4 ° C para agregar as células. </li><li> Lave as células duas vezes. </li><li> Ressuspender o sedimento em NH 4 Cl 0,15 M (5 ml por baço). Misture delicadamente e de forma contínua com uma pipeta de 3 min no gelo para lisar as hemácias. Encha o tubo com o meio. </li><li> Giro por 10 min a 4 ° C para agregar as células. </li><li> Lave as células duas vezes. </li><li> Contagem das células. Um baço de rato dá 200-250000000 células. </li><li> A semente células em 2 milhões por ml em meio completo: 50 ml por frasco de 75 cm 2. </li><li> Deixe crescer por 48 horas na incubadora. </li><li> Rodada 15 min a 4 ° C para agregar as células. </li><li> Recolher o sobrenadante; descartar as células. </li><li> Adicionar 15 mg / ml mannoside uma metila para o sobrenadante. Misture bem. </li><li> Filtro (0,2 mm) </li><li> Alíquotas e armazenar a -20 ° C. Pode ser mantido a 4 ° C por 10 dias, se necessário. </li></ol>

<ol><li>Beeton, C., Barbaria, J., Devaux, J., Benoliel, A. -M., Gola, M., Sabatier, J. -M., Bernard, D., Crest, M., Beraud, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+blocking+of+voltage-gated+K%2B+channels+treats+experimental+autoimmune+encephalomyelitis+and+inhibits+T-cell+activation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Selective blocking of voltage-gated K+ channels treats experimental autoimmune encephalomyelitis and inhibits T-cell activation.</a> J. Immunol. 166, 936-944 (2001).</li>
<li>Beeton, C., Wulff, H., Barbaria, J., Clot-Faybesse, O., Pennington, M., Bernard, D., Cahalan, M. D., Chandy, K. G., Beraud, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+blockade+of+T+lymphocyte+K%2B+channels+ameliorates+experimental+autoimmune+encephalomyelitis%2C+a+model+for+multiple+sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad%22%5BJournal%5D)">Selective blockade of T lymphocyte K+ channels ameliorates experimental autoimmune encephalomyelitis, a model for multiple sclerosis.</a> Proc. Natl. Acad. 98, 13942-13947 (2001).</li>
<li>Mor, F., Cohen, I. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Propagation+of+Lewis+rat+encephalitogenic+T+cell+lines%3A+T-cell-growth-factor+is+superior+to+recombinant+IL-2%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neuroimmunol%22%5BJournal%5D)">Propagation of Lewis rat encephalitogenic T cell lines: T-cell-growth-factor is superior to recombinant IL-2.</a> J. Neuroimmunol. 123, 76-82 (2002).</li>
</ol>

Os autores não têm nada a declarar.

Nós preparamos TCGF de esplenócitos de ratos Lewis, uma vez que regularmente euthanize ratos ingênuos a partir desta cepa para a colheita de soro e thymi para estimular ratos Lewis linhas de células T in vitro. Este TCGF pode ser usado para promover o crescimento ea sobrevivência de linhagens de células T das estirpes outro rato. TCGF também podem ser preparados a partir de outras linhagens de ratos.

Para preparar meio de cultura completo adicione o seguinte a uma garrafa de 500 ml de RPMI 1640 e estéril de filtro: 10% FCS, 1 garrafa de PSG, 5 ml RPMI vitaminas; 5 piruvato de sódio ml, 5 ml não-aminoácidos essenciais, 50 uM beta-mercaptoetanol, 2 ug / ml Concanavalina A.

preparando-se fator de crescimento de células t esplenócitos rat

Preparing T Cell Growth Factor from Rat Splenocytes

Manutenção de antígeno-específicas linhas de células T ou clones na cultura exige rodadas de antígeno-induzida ativação separados por fases de 1,2 expansão celular. Adição de interleucina 2 para o meio de cultura durante a fase de expansão é necessária para evitar a morte celular e suficiente para manter a curto prazo linhas de células T, mas foi mostrado para aumentar a polarização Th1 3. Substituição de interleucina 2 pelo fator de crescimento de células T (TCGF), que contém uma mistura de citocinas é mais eficaz do que a interleucina 2 na manutenção a longo prazo linhas de células T in vitro 3. Além disso, TCGF pode ser facilmente preparado em grandes quantidades no laboratório e é muito mais barato do que a interleucina 2 recombinante. Aqui, vamos mostrar como preparar TCGF sobrenadantes de esplenócitos de ratos cultura. Para este procedimento, colhemos baços de ratos Lewis ingênuo sacrificados para timo e coleta de sangue. Nós preparamos uma única célula suspensões de baço, Lyze as células vermelhas do sangue por choque osmótico, ea semente da esplenócitos em meio de cultura. As células são estimuladas com concanavalina A, um mitógeno que os não-seletivamente ativa todos os linfócitos T de ratos, induzindo a produção de citocinas. A cultura é supernantant coletadas 48 horas depois concanavalina A andexcess é obrigado a alfa metil mannoside para impedi-lo de ativar linhas de células T para que TCGF será adicionado. O TCGF é então filtrado estéril, aliquotado e armazenado a -20 ° C.

Descrevemos a preparação de fator de crescimento de células T utilizado para a expansão in vitro de antígeno-específica de linfócitos T linhas rato.

Preparando-se Fator de Crescimento de Células T esplenócitos Rat

A manutenção de linhagens ou clones de células T antígeno-específicas em cultura requer ciclos de ativação induzida por antígeno separados por fases de expansão celular 1,2. ...

Olá, sou Christine Beaton. Sou pesquisadora assistente no laboratório de George Chen, do Departamento de Fisiologia e Biofísica da Universidade da Califórnia em Irvine. E, nos próximos dois dias, vou mostrar a vocês como preparar o TCGF, que significa fator de crescimento de células T.Portanto, para a nossa cultura celular de rotina, quando não precisamos de um conhecimento preciso da composição das citocinas no meio de cultura, utilizamos o fator de crescimento de células T, que é um sobrenadante S proveniente de cultura de baço de camundongos CY, o qual contém as citocinas necessárias para auxiliar a expansão das células T. Assim, preparamos o FCT da seguinte maneira: sacrificamos ratos Louis saudáveis, retiramos seus baços, preparamos uma suspensão de células únicas, eliminamos os glóbulos vermelhos por lise e, em seguida, estimulamos as células mononucleares com concanavalina A, o que induzirá as células T a produzirem todas as citocinas necessárias para seu crescimento. Para gerar o FCT, precisamos ativar as células.Então, o modo como fazemos é adicionar lectina conval, abreviada como corona A, ao nosso cultivo celular. Quando adicionamos a conc em a ao nosso cultivo celular,

preparing-t-cell-growth-factor-from-rat-splenocytes

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Expansão ex vivo de células tumorais T-reativa por Meios de 1/Ionomycin Bryostatin eo Common Gamma Cadeia Formulação Citocinas

Este vídeo demonstra a triagem de compostos imunomoduladores por meio de ensaio baseado em fluorescência. Linfócitos T derivados de camundongos transgênicos com de expressão de proteína fluorescente verde são tratados com esses compostos. Os sinais GFP aprimorados e reduzidos permitem a identificação dos efeitos estimulatórios e inibitórios dos compostos, respectivamente.

Um ensaio baseado em fluorescência usando linfócitos projetados para triagem de compostos imunomoduladores

O vídeo mostra um ensaio baseado em citometria de fluxo para testar a imunodominância em linfócitos T citotóxicos ou respostas CTL. As células-alvo fluorescentes injetadas exibem fluorescência variável correspondente a epítopos imunogênicos. A coleta e classificação pós-baço revelam uma redução nas células fluorescentes de alta intensidade, confirmando a imunodominância nas respostas CTL.

Um ensaio para avaliar a imunodominância nas respostas de linfócitos T citotóxicos

Este vídeo demonstra uma técnica para a geração ex vivo de células T do receptor de antígeno quimérico (CAR) específico do antígeno tumoral. Vetores retrovirais portadores de RNA transgênico são misturados com células do baço em um meio suplementado com interleucina-2 para promover a sobrevivência e proliferação de células T. A mistura é então transferida para uma placa revestida com fragmentos de fibronectina humana recombinante e centrifugada para facilitar a fusão do vírus com a célula,...

Uma técnica ex vivo para gerar células T receptoras de antígeno quimérico específicas para tumores

Este vídeo demonstra uma técnica para gerar células T do receptor de antígeno quimérico (CAR) específico do antígeno por meio de transdução retroviral. As células T CD8+ murinas ativadas são adicionadas a uma placa de micropoços revestida com fragmentos de fibronectina recombinante. Vetores retrovirais contendo RNA transgênico que codifica um receptor de antígeno quimérico específico do antígeno (CAR) são então introduzidos e a placa é centrifugada para facilitar a transdução. Após a incubação,...

Uma técnica para a geração de células T CAR específicas para antígenos

Os efeitos linfodepletivos e imunomoduladores do padrão de tratamento da quimioterapia e radiação podem ser aproveitados para aumentar a eficácia antitumoral da imunoterapia com células T. Descrevemos um método para gerar células T do receptor de antígeno quimérico (CAR) específicas do EGFRvIII e administrá-las no contexto do tratamento padrão de glioblastoma.

Geração de células T para CAR adoptivo Therapy no Contexto do Glioblastoma Padrão de Atendimento

Aqui, apresentamos um protocolo para diferenciar murino células auxiliares (THGM) T granulocyte-macrophage-colony-stimulating-factor-producing de células T CD4 + de ingênuo, incluindo o isolamento de células T CD4 + de ingênuo, diferenciação de THGM, e análise de células THGM diferenciadas. Esse método pode ser aplicado aos estudos do regulamento e função das células THGM.

In Vitro Diferenciação de Mouse Granulócito-macrófago-colônia-estimulando Factor (GM-CSF)-produzindo pilhas de T Helper (THGM)

Aqui, apresentamos um protocolo para reproducibly e rapidamente gerar biologicamente inspirados, biodegradável articifical apresentadoras de células (aAPC) com tamanho ajustável, forma e apresentação de proteína de superfície de célula T expansão ex vivo ou in vivo .

Fabricação de anisotrópica poliméricas Artificial células apresentadoras para ativação de células T CD8 +

MALT1 regula a imunidade inata, mas como isso ocorre permanece indefinida. Usamos o inibidor seletivo de paracaspase MALT1 MIT-827 para desvendar a contribuição da MALT1 para sinalização inata, a jusante dos receptores Toll-like ou tipo C do tipo lectina, demonstrando que MALT1 regula a produção de citocinas mieloides e a jusante dos receptores do tipo lectina do tipo C, seletivamente.

Mieloide inata sinalização via regulamento por MALT1 Paracaspase atividade

Nós descrevemos aqui um ensaio in vivo cytometry-baseado do fluxo da matança que permita a examinação do immunodominance em respostas citotóxicas do linfócito de T (CTL) a um antígeno modelo do tumor. Nós fornecemos exemplos de como este ensaio elegante pode ser empregado para estudos mecanistic e para o teste da eficácia da droga.

Adaptando os ensaios de citotoxicidade in vivo para estudar Imunodominância em respostas de células T CD8+ específicas do tumor

Apresentamos protocolos aprimorados para transdução retroviral de receptores de tráfego e homing competitivo para estudar o posicionamento de linfócitos específicos de órgãos e microambientes mediados por receptores. Este método oferece informações valiosas sobre os mecanismos de tráfego de células imunes e tem aplicações potenciais em futuras pesquisas básicas e terapêuticas.

Transdução retroviral eficiente e homing competitivo para investigar a localização de células T mediadas por GPCR em diversos microambientes teciduais

Aprenda a preparar fator de crescimento de células T (TCGF) para expansão de linfócitos T em ratos. Este método utiliza baço de ratos saudáveis e concanavalina A para produzir citocinas essenciais em cultura celular.

Preparando-se Fator de Crescimento de Células T esplenócitos Rat

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