Name: Axons, 수석 및 뇌 슬라이스의 개별 뉴런의 수지상 쪽의 전압에 민감한 염료 기록 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-11-29T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 51 s
Description: 배우세요 뇌 슬라이스에서 개별 뉴런의 축삭, 수상돌기 및 수상돌기 가시에서 막전위 변화를 광학적으로 기록하는 방법을. 이 기법은 아교세포 신경생리학 연구에서 전기 신호 통합을 고해상도로 관찰할 수 있게 합니다.

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우리는 우리의 공동 친절 염료를 제공하기 위해이 기술의 초기 개발에뿐만 아니라 레슬리 M. 로우에 참가 Knut Holthoff, 아서 Konnerth와 마르코 Canepari에 감사하고 있습니다. NSF 부여 IOS-0817969, NIH 보조금 NS068407와 M136043 의해 예일 대학에서 신경 과학을위한 Kavli 연구소에 의해 지원.

1. 장비 설치 1.1 단계. 영상 설정 전압에 민감한 염료 신호를 기록하기위한 핵심은 적절한 설치 디자인입니다. 우리는 세 대의 카메라가 장착 수직 현미경 (BX51WI 올림푸스 또는 Zeiss AxioExaminer)을 사용합니다. 설정은 니콘 60X/1.0 NA 또는 Zeiss 63X/1.0 NA 물을 찍어 목표를 사용하여 에피 형광, 넓은 필드 현미경 모드에서 여기 빛으로 뇌 조각의 조명 개별 뉴런을 위해 설계되었습니다. 우리 현미경은 진동 절연 테이블에 고정 방문객 이동 단계가 구비되어 있습니다. 각 현미경은 세 카메라 포트를 갖추고 있습니다. 하나의 카메라 포트는 비디오 현미경 (IR-1000, Dage MTI, USA) 적외선 DIC에 대한 표준 높은 공간 해상도 CCD 카메라가 있습니다. 두 번째 카메라 포트는 상대적으로 낮은 공간 해상도 (80 X 80 픽셀)하지만, 뛰어난 동적 범위 (14 비트) 및 읽기 매우 낮은과 빠른 데이터 수집 카메라 (최대 20 kHz에서 프레임 속도)이소음 (NeuroCCD-SM, RedShirtImaging LLC, 디카 터, GA). 에 대한 공 촛점 이미지의 Z-스택을 수집하는 데 사용하는 회전 - 디스크 공 촛점 스캐너 (CSU-10, 요코, 일본)에 장착, 세 번째 카메라 포트는 높은 공간 해상도를 가진 CCD 카메라 (PCO AG, 독일 PixelFly, 1392x1024 픽셀)이 스테인드 세포의 자세한 형태학의 재건. 주파수 두 배로 다이오드 펌프 ND를 : 532 nm의 (MLL-III/400 MW, CNI, 장춘, 중국)에서 YVO4 연속 웨이브 레이저 (400 MW) 발광은 여기 빛의 원천입니다. 셔터 (LS6, 빈센트 연결합니다)에 의해 개폐 2mm 직경의 레이저 빔이 뒤쪽 조리개를 너무 많이 넣다하도록 설계된 단일 포트 epifluorescence 응축기 (포토닉스 GmbH의, Gräfelfing까지 독일)를 통해 현미경에 커플 링 라이트 가이드로 이동합니다 객관적이고 객체 비행기의 균일 한 조명 근처에 있습니다. 레이저 광은이 V m-영상의 감도를 극대화 할 수있는 기존의 제논 아크 - 램프 대신에 사용됩니다 : (1) 단색 예를 사용하여염료 9, 10 (2) 아크 - 램프에 의해 달성 할 수있는 수준을 넘어서 여기 빛의 강도를 증가 V m 감도를 극대화 할 수있는 흡수 스펙트럼의 붉은 날개에서 인용 빛. 기진 빛이 560 나노 미터와 기록 형광 빛이 610 nm의 장벽 필터 (SCHOTT RG610)를 통해 전달 된의 중심 파장과 이색 성 거울로 준비에 반영되었습니다. 빛 강도 증가와 가까운 최적의 단색 여기 파장의 사용의 통합 효과는 이전의 측정 6에 비해 약 50의 요소를 기준으로 전압 이미지의 감도에 극적으로 개선했다. 1.2 단계. 균일 한 조명으로 조정 형광 슬라이드 표준을 (녹색 여진 / 빨간색 방출)을 사용합니다. CCD는 포화되지 않은 수 있도록 레이저 빔 경로에 해당하는 중립적 인 밀도 필터를 삽입합니다. 의 표면에 목표를 집중슬라이드. 레이저 런처 목표 앞의 석영 빛 가이드의 수신 끝의 위치를​​ 조정하고, 달성하기 어려운 형광 콘덴서에 적절한 액츄에이터를 사용하여 현미경에 부착 된 광 가이드의 출력 끝의 위치를​​ 조정 중심의 균일 시야의 조명. 1.3 단계. 진동 소음을 결정 형광 슬라이드의 표면에 작은 검은 색 잉크 표시를하십시오. 연속 촬영 모드에서 NeuroCCD과 기록 빛의 세기. 검은 색 잉크 마크의 어두운 가장자리에 목표를 집중하십시오. 2 kHz에서 프레임 속도 약 100 밀리 초에 대한 빛의 세기를 기록합니다. 균일하게 조명 영역에서와 잉크 마크의 가장자리 ~ 20 픽셀의 빛을받는 ~ 20 픽셀의 부분 광도 흔적 (ΔF / F)의 공간 평균을 표시합니다. 고 대비 가장자리와 픽셀의 녹음에 과다한 소음의 진동 소음을 반영시스템. 1.4 단계. 진동 절연 이 실험 녹음 조건에 비해 광도의 샷 노이즈 아래 수준으로 진동 절연 테이블을 사용하여 진동을 줄이기 위해 필수입니다. 이미지의 날카로운 가장자리를 덮고 픽셀에서 빛의 세기에 진동 소음이 무시할 때까지 진동 절연 테이블을 조정합니다. 움직이는 부품 (기계 셔터, 팬)과 장비의 없음이 테이블에 장착 할 수 없습니다. 진동으로부터 격리되지 않은 다른 구성 요소에 연결된 테이블에 장비의 케이블들은 현미경을 기계적 진동을 전송하지 않는 것이 느슨한 있도록해야합니다. 2. V m-이미징을위한 적절한 신경 세포의 선택 2.1 단계. 뉴런의 선택 표준 절차에 따라 뇌 조각을 만듭니다. 나는의 개별 신경 세포에서 EGFP을 표현 마우스 줄을 사용하여nterest. 회전 디스크 공 촛점 시스템으로 슬라이스에서 EGFP 표시 뉴런을 표시합니다. 그대로 axonal / 수지상 나무가 V m-이미징에 대한 뉴런를 선택하고 프로세스가 슬라이스의 표면과 평행과 가까이에 실행으로. axons과 얇은 수석은 대부분의 경우, DIC 현미경 모드에서 볼 수 없습니다 때문 야생 형 생쥐에서 수행 할 수 없습니다. 3. 전압에 민감한 염료로로드 뉴런 3.1 단계. 패치 피펫의 작성 전극 테이퍼의 2 / 3까지 약 15 s에 대한 부정적 압력을 적용하여 염색 무료 세포 솔루션을 끝에서 유리 패치 피펫를 입력합니다. 끝에서 염료를 무료로 솔루션은 배경 형광을 증가하고 극적 노이즈 비율로 신호를 감소 슬라이스에 염료의 유출을 방지 할 필요가 있습니다. 용해 막 impermeant 전압에 민감한 염료 JPW3028를 포함하는 솔루션을 전극을 백업 작성세포 솔루션 (0.8 ㎜). JPW3028, 세포 내 응용 프로그램에 대한 가장 성공적인 전압 프로브는 아직 microinjection에 사용 할 용해 충분히 물 lipophilic styryl 염료의 ANEP 시리즈의 이중 긍정적으로 청구 아날로그입니다. 이 염료의 디 에틸 아날로그 거의 동일한 특성을 (전압 감도 포함) 보유하고 JPW1114 (표 1 참조)와 같은 상업적으로 사용할 수 있습니다. 우리는 소주 H 2 O.에서 20 MM 주식 솔루션을 준비 재고 솔루션 50 μl aliquots는 -20 ° C.에 고정 유지됩니다 0.8 mm의 최종 염료 농도를 들어, 재고 솔루션 2 μl는 실험 당일 세포 솔루션의 50 μl에 용해되어 있습니다. 재고 염료 솔루션은 안정적이며, 몇 개월 동안 실온에서 보관 할 수 있습니다. 이 소진 될 때까지 따라서, 우리는 실내 온도에 하나의 50 μl 나누어지는을 유지. 3.2 단계. 신속 기가 - 인감을 수립 <p claSS = &quot;jove_content&quot;&gt; 패치 이전에 선택한 뉴런과 20-45 분에 대한 전체 셀 구성에서 소마에 체세포 패치 피펫에서 염료를 무료로 보급 할 수 있습니다. 이 팁에서 염료 무료 솔루션의 금액이 작은 유지 될 수 있도록 가능한 한 빠른 속도로 인장을 얻기 위해 필수적입니다. 전극에 염료없이 빠른 패치를 실행하여 시작합니다. 주변 조직을 오염하지 않고 끝에서 염료 무료 솔루션의 최소 금액을 사용하는 목적으로 염료와 다음, 연습 패치 및 로딩 뉴런. 연습으로, 그것은 1-2 분 이내에 인감을 구축 할 수 있습니다. 3.3 단계. 착색의 수준을 모니터 전체 셀 구성에 염료 확산되는 동안, 전류 클램프 모드에서 evoked 액션 잠재력을 기록하여 신경 세포의 생리 상태를 모니터링 할 수 있습니다. 또한, 2 K의 프레임 속도로 셀 소마에서 휴식 광도 (RLI)를 기록하여 착색의 양을 모니터링<html> Hz에서하고 중립적 인 밀도 필터 (우리는 400 MW 레이저에서 레이저 광 강도의 0.04 %를 사용)로 조정 전체 광도의 일부에서. 액션 잠재력은 전극의 크기와 저항에 따라, 보통 20-40분 후, 확대하기 시작 때까지 염료로드 프로세스를 계속합니다. 스파이크의 확대는 완전히 치료와 체세포의 막에있는 염료의 포화 농도의 용량 부하 효과 때문일 가능성이 높습니다. 염료 농도가 신경에 걸쳐 equilibrated 후 스파이크의 파형이 완전히 복원됩니다. 3.4 단계. 염료 전극을 제거 기간 얼룩의 말에 조심스럽게 외부 아웃 패치 구성에 전체 세포의 전환이 과정에서 달성되어 있도록 전압 클램프 구성에 소마에서 떨어져 패치 피펫을 당긴다. 3.5 단계. 염료 확산 기다립니다 다닐 &quot;&gt; neuronal 프로세스에 전파 할 수있는 전압에 민감한 염료를 사용할 수 있도록 상온에서 추가 1.5-2 시간의 조각을 배양. 수지상 및 axonal 프로세스의 파형으로 소마에서 도보로 염색 diffuses 상당한 양의 후 AP가 완전히 복원됩니다. 4. 광학 녹음 4.1 단계. 이미지에 대한 세포 구획을 선택 낮은 조명 수준의 형광 및 재 패치 DIC 아래 표준 (없음 염료) 패치 전극과 뉴런에서 스테인드 뉴런의 소마를 찾습니다. 전압 이미징을위한 CCD의 연속 녹화 모드에서 10-40 Hz의 프레임 속도에서 낮은 조명 수준에서 neuronal 프로세스를 표시합니다. 관심의 대상을 시각화하는 데 필요한 최소 중립적 인 밀도 필터를 빛 수준을 줄일 수 있습니다. 우리는 스테인드 신경의 위치 동안 400 MW 레이저 강도의 0.01 %를 사용합니다. XY 스테이지 사용하여 t에 대한 관심의 neuronal 과정을 위치이미지 영역의 중간 그는. 현미경의 부분적 폐쇄 필드 스톱 아이리스를 사용하여 여기 빛으로부터 소마를 보호합니다. 높은 강도 여기 빛으로부터 소마를 차폐하는 것은 상당히 녹화하는 동안 photodynamic 손상을 줄일 수 있습니다. 막 잠재적 인 과도에 관한 기록 4.2 광 신호를 단계 개인 수지상 가지의 backpropagated APS에 관한 광학 신호를 기록합니다. 축삭의 APS에 관한 광학 신호를 기록합니다. 수지상 쪽의 APS를 backpropagating에 관한 광학 신호를 기록합니다. 신호 파형의 정확한 복원에 적합한 프레임 속도를 사용하고 표백 염색 및 photodynamic 피해를 최소화하기 위해 녹음 기간과 높은 강도 여기 빛에 노출 가능한 한 짧은으로 유지. 예를 들어, 축삭에 하나의 액션 전위의 개시와 전파의 순서를 검토하는 것은 5-10 밀리 초의 기록 기간이 필요합니다. 여기 빛 intensi녹화하는 동안 티는 한 손에 신호 대 잡음 비율과 표백 염색의 정도와 다른 한편으로는 photodynamic 손상 사이의 타협이다. 우리는 직경 300 μm의 영역이 밝아 axons의 긴 섹션에서 녹화에 400 MW 레이저의 강도의 100 %를 사용합니다. 여기 광이 수지상 척추 이미징을위한 30 μm 직경 영역에 초점을 맞추고 있습니다 때, 우리는 레이저 광도의 10~25%을 사용합니다. 녹화 필요한 기간은 최적의 여기 광도의 중요한 결정자이다; 짧은 녹음 기간은 높은 빛 농도 할 수 있습니다. 최적의 조명 강도가 가장 각 준비 및 측정 설정에 경험적으로 결정됩니다. 5. 데이터 분석 5.1 단계. 알려진 오류에 대한 원시 데이터를 수정 데이터의 분석 및 디스플레이 IDL (ITT 영상 정보 Solut로 작성된 NeuroPlex 프로그램 (RedShirtImaging)를 사용하여 수행되었다이온, 볼더, 콜로라도) 및 사용자 정의 비주얼 베이직 루틴. 낮은 조명 수준의 조건에서 배경 형광은 ΔF / F 신호 크기의 중요한 결정자가된다. 원시 데이터가 먼저 슬라이스에 흠없는 지역에서 결정된 평균 배경 형광 강도를 차감하여이 효과 수정되었습니다. 그 후, 신호 정렬 소프트웨어는 AP 개시의 시간적 지터에 대한뿐만 아니라 평균 동안 준비의 가능한 작은 움직임에 대한 해결하기 위해 사용되었다. 시간적 도메인에서 AP의 신호 평균화의 시작 (그림 1B)에 인수 기준 신호 각 재판에서 전기적으로 기록 된 APS의 교차 상관 관계에 의해 정렬되었습니다. 공간 도메인에서 이미지는 준비의 가능한 작은 측면 움직임을 보상하기 위해 이미지 간 상관 관계에 의해 2 차원 오프라인으로 정렬되었습니다. Z-차원의 이미지의 정확한 초점은 각각의 재판 전에 확인했습니다, smal<html> 난 조정은 종종 필요했다. 그림 1b에 도시 된 바와 같이 spatially과 시간적으로 정렬 신호를 평균했다. 염료의 표백에 의한 빛의 세기에 느린 변경 사항은 더 자극 (그림 1B)를 기록 재판에서 파생 적절한 이중 지수 함수로 데이터를 나누어 해결되었습니다. AP 신호의 파형은 큐빅 스플라인 보간, 각 데이터 포인트를 통과 piecewise 연속 곡선을 사용하여 데이터 포인트의 세트에서 복원되었습니다. 전압에 민감한 염료 신호가 밀리 초 시간 규모에서 큰 왜곡없이 막 잠재력을 추적 확인하려면 소마에서 전기 AP 신호는 그림 3B와 같이 인접한 축삭의 소구에서 광학 AP 신호에 비해되었다. 두 신호는 광학 녹음의 샷 잡음을 허용하는 매우 밀접하게 비교하십시오. les/ftp_upload/4261/4261fig1.jpg &quot;/&gt; 1 그림. 데이터 분석 (애니메이션). (A) 상단 패널 : 기록 위치에 축삭과 스테인드 신경 세포의 고해상도 공 촛점 이미지입니다. 기록 전극 소마와 개략적으로 표시 기저 dendrite 옆에있는 세포 자극 전극에 부착. 액션 잠재력은 세포, 신경 자극에 의​​해 evoked. 낮은 패널 :. V m 이미징에 사용 (B) 소마 (검은 흔적)에서 전극 녹음, AIS (빨간색 흔적)에서 광학 녹음하고, Ranvier의 노드 (녹색 흔적)에서 CCD에 의해 얻은 축삭의 낮은 공간 해상도 형광 이미지 . 인기 흔적 : AP 개시의 관자놀이 지터를 보여 9 평가판에서 원시 데이터입니다. 트레이스의 두 번째 행 : 시간적으로 신호를 정렬. 흔적의 셋째 줄 : 평균 신호. 흔적 번째 행 : 표백제를 수정. 하단 트레이스 : 일시적으로 스무딩 중 하나를 패스 입방 스플라인 보간.

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노래 부를 Zecevic 그는 LLC를 RedShirtImaging의 공동 소유자., 전압에 민감한 염료 녹음에 사용되는 고속, 낮은 소음 CCD 카메라 전문 회사입니다 함을 선언합니다. 다른 모든 저자는 금융 관심사 나 현재 연구에 관한 관심의 잠재적 인 충돌을보고하지 않습니다.

이 문서는 하위 마이크로 미터와 하위 밀리 초 spatiotemporal 해상도 개별 뉴런의 전기 활동을 모니터링하기위한 전압에 민감한 염료 기록 방법을 설명합니다. 가까운 최적의 파장 (신호 크기에 관한)에 레이저 여기가 ~ 50 이전 방법여의 비율에 의해 녹음의 감도를 향상되었습니다. 현재 감도는 수석, axons, 축삭의 민간인 피해와 축삭 터미널뿐만 아니라 개인 수지상의 쪽 등의 개인 뉴런의 모든 부분에서 전기 신호를 모니터링 할 수 있습니다. 현재 감도로 막전위의 과도의 녹음 최대 20 kHz에서까지의 프레임 속도로 수행 할 수 있습니다. 겸손한 신호 평균 (4-25 시험)은 쉽게 2-5의 비율에 의해 신호 대 잡음 비율로 표시 기록의 감도를 향상시킬 수 있습니다. 전압 이미지의 주요 제한은 절대 전압 규모의 여러 위치에서 광 신호의 간단한 보정이 없다는 것입니다. 어떤 준비S이 모든 위치에서 알려진 진폭을 가진 막전위 신호를 검색하여 해결 할 수 있습니다. 축삭의 일부 완벽하게 고르기 수석 6 A...

<table border="1"><tbody><tr><td> 구성 요소의 이름 </td><td> 회사 </td><td> 카탈로그 번호 </td><td> 코멘트 (선택 사항) </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> 설치 구성 요소 </td></tr><tr><td> 입식 현미경 </td><td> 올림푸스 주식회사 </td><td> BX51WI </td><td> 세 카메라 포트 </td></tr><tr><td> 전동 이동식 무대 </td><td> Siskiyou </td><td> MXOPi.2 </td><td></td></tr><tr><td> 올림푸스 BX51에 대한 에피 형광 응축기 </td><td> 포토닉스까지 </td><td> 0000-560-11659 </td><td></td></tr><tr><td> 입식 현미경 </td><td> 칼 Zeiss, LLC </td><td> AxioExaminer의 D1 </td><td> 세 카메라 포트 </td></tr><tr><td> 동력 톱 플레이트 </td><td> Scientifica 제한 </td><td> MMBP </td><td></td> &lt;/ TR&gt; <tr><td> Zeiss AxioExaminer에 대한 에피 형광 응축기 </td><td> 포토닉스까지 </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 데이터 수집 카메라 </td><td> RedShirtImaging LLC </td><td> NeuroCCD-SM </td><td> 고속 낮은 읽기 노이즈 </td></tr><tr><td> IR-DIC를위한 CCD </td><td> Dage - MTI </td><td> IR - 1000 </td><td></td></tr><tr><td> 회전 - 디스크 공 촛점 스캐너 </td><td> 요코 </td><td> CSU-10 </td><td></td></tr><tr><td> 공 촛점 스캐너에 대한 높은 공간 해상도 CCD </td><td> PCO AG </td><td> PixelFly </td><td> 1392x1024 픽셀 </td></tr><tr><td> DPSS 레이저 CW (532 Nm 수준) </td><td> CNI 광전자 공학 기술. (주) </td><td> MLL-III-532 400mW </td><td> 여기 광원 </td></tr><tr><td> 멀티 모드 광섬유 실행기 </td><td> Siskiyou </td><td> SM-CFT </td><td></td></tr><tr><td> 라이트 가이드 </td><td> 사진까지NIC가 </td><td> 0000-515-11524 </td><td></td></tr><tr><td> 셔터 </td><td> 빈센트 제휴 </td><td> LS6 </td><td></td></tr><tr><td> 진동 절연 표 </td><td> 마이너스 K 기술 </td><td> MK26 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> 특정 시약 </td></tr><tr><td> 디-2-ANEPEQ (JPW 1114) </td><td> 생명 기술 </td><td> D-6923 </td><td> 전압에 민감한 염료 </td></tr><tr><td> Crym-EGFP 마우스 선 </td><td> GENSAT (MMRRC) </td><td> STOCK TG (Crym-EGFP) GF82Gsat/Mmcd </td><td> 띄엄 띄엄 레이어 5 대뇌 피질의 뉴런에서 EGFP을 표현 </td></tr></tbody></table>

axons, 수석 및 뇌 슬라이스의 개별 뉴런의 수지상 쪽의 전압에 민감한 염료 기록

Voltage-sensitive Dye Recording from Axons, Dendrites and Dendritic Spines of Individual Neurons in Brain Slices

biophysical 속성과 하나의 뉴런의 기능 조직을 이해하고 어떻게 프로세스 정보가 뇌가 어떻게 작동하는지 이해하는 중요한 요소입니다. 모든 신경 세포의 주요 기능은 보통 여러 소스에서 전기 신호를 처리하는 것입니다. neuronal 프로세스의 전기적 특성은 세부 측정의 부재에 예측하기 매우 복잡한 동적, 그​​리고 일반 경우에는 불​​가능합니다. 하나가 겠어 이러한 측정을 얻으려면 이상적으로, 그들은 neuronal 프로세스 및 작업 가능성 개시에 영향을 특정 위치에서 summate에 원산지 사이트의 여행으로 여러 사이트에서 subthreshold 이벤트를 모니터링 할 수 싶어요. 이 목표는 전극을 채용 측정의 기술적 한계로 인해 모든 신경을 달성되지 않았습니다. 이 단점을 극복하기 위해, 그것은 광범위한 병렬 recordin을 허용 이미징 기술을 패치 - 전극 접근 방식을 보완하기 위해 매우 바람직하다신경 세포의 모든 부분에서 GS. 하위 밀리 초와 하위 마이크로 미터 해상도의 특징 - 유기 전압에 민감한 염료 (V m-영상)과 막 잠재적 인 과도의 광학 녹음 - 여기, 우리는 이러한 기술을 설명합니다. 우리의 방법은 전압에 민감한 분자 프로브 2 선구적인 작업을 기반으로합니다. 초기 기술의 여러 측면이 지속적으로 수십 년 3, 5, 11을 통해 향상되었습니다. 또한, 이전의 작품은 V m 이미징의 두 중요한 특성을 문서화. 첫째, 형광 신호는 전체 생리적 범위 (, 10, 14, 16 100 뮤직 비디오에 -100 뮤직 비디오)를 통해 막전위에 비례합니다. 둘째, 여기에 사용되는 전압에 민감한 염료 (JPW 3028)와로드 뉴런이 감지 약리 효과가 없습니다. 기록 염료를로드하는 동안 스파이크를 확대하는 것은 7 4 완전히 치료입니다. 또한, 실험 증거는 확보하는 것이 가능하다는 것을 보여줍니다모든 감지 phototoxic 효과 4 이전 녹음의 상당수 (최대 수백), 6, 12, 13. 현재, 우리는 V m-이미징 기술의 감도를 극대화 할에 가까운 최적의 파장 레이저 광원의 뛰어난 밝기와 안정성의 이점을 누리십시오. 현재 감도는 axons과 축삭의 민간인 피해, 터미널 수지상 가지, 개인 수지상의 쪽 포함하여 신경 세포의 모든 부분에서 V m의 과도의 여러 사이트 광학 녹음 할 수 있습니다. 신호의 상호 작용을 취득 정보뿐만 아니라 동영상의 형태로 직접 시각화와 같은 양적 분석 할 수 있습니다.

성공적인 공 촛점 현미경은 슬라이스의 표면에 인접 해 있으며, 초점 중 하나가 비행기에있는 그대로 neuronal 프로세스의 명확한 식별을 허용해야합니다. 전에 전압에 민감한 염색 로딩에 전압 이미징에 적합한 신경 세포의 선택은 중요합니다. 대뇌 피질의 슬라이스 (Crym 유전자 변형 마우스 라인)에서 EGFP을 표현 L5 피라미드 뉴런의 공 촛점 이미지의 예는 그림 2에 표시됩니다. 개별 뉴런의 Axons 명확하게 볼 수 있습니다. 슬라이스의 표면에 가까운 초점 중 하나가 비행기에서 긴 그대로 axons (흰색 화살표)로 셀이 선택되었습니다. <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/4261/4261fig2.jpg" /> 그림 2. axons의 AP 신호의 V m 이미징을위한 L5 대뇌 피질...

서브 마이크로 미터 공간과 하위 밀리 초 시간적 해상도 막 잠재적 인 변화의 모니터링을위한 이미징 기술은 설명되어 있습니다. 전압에 민감한 염색의 레이저 여기에 기반을 둔 기술은, axons과 축삭의 민간인 피해, 터미널 수지상 지점, 개인 수지상 쪽의 신호를 측정 할 수 있습니다.

Axons, 수석 및 뇌 슬라이스의 개별 뉴런의 수지상 쪽의 전압에 민감한 염료 기록

단일 뉴런의 생물물리학적 특성과 기능적 조직, 그리고 뉴런이 정보를 처리하는 방식을 이해하는 것은 ...을 이해하는 데 필수적입니다.

설명된 실험의 전반적인 목표는 단일 신경세포의 여러 부위에서 서브 마이크로미터 및 서브 밀리초 해상도로 막전위 신호 통합과 정보 처리를 광학적으로 모니터링하는 것입니다. 이는 먼저 막전위 과도 상태에 해당하는 빛 강도의 작은 분율 변화를 기록할 수 있도록 적절한 감도를 갖춘 이미징 설정을 구축함으로써 달성됩니다. 다음으로, 슬라이스 표면에 가까운 단일 초점 평면에서 길고 손상되지 않은 돌기를 가진 신경세포를 효과적으로 이미징할 수 있도록 적절한 구조를 가진 신경세포를 선택합니다.그 다음, 막 전위 변화를 광학적으로 추적할 수 있도록 미리 선택한 뉴런에 전압 민감성 염료를 로딩합니다. 결과는 축삭, 수지상 돌기 및 수지상 돌기 가시로부터 막 전위 신호를 모니터링함으로써 개별 신경 세포의 전기적 신호 통합에 관한 정보를 얻을 수 있는 이 접근 방식의 독특한 능력을 보여줍니다. 세포 신경생리학 분야에서.전극 측정의 낮은 공간 해상도와 축삭 측지(axon collaterals) 또는 수지상 돌기 가시(dendritic spines)와 같은 작은 구조물로부터의 기록 불가능성이라는 기존 전기생리학의 두 가지 오랜 한계로 인해 새로운 도구들이 개발되고 있습니다. 이러한 단점들을 극복하기 위해, 패치 전극 접근법을 뉴런의 모든 부분에서 병렬 기록을 가능하게 하는 광학 기술과 결합할 수 있습니다. 본 연구에서는 단일 가시 해상도로 막 전위 과도 현상을 다중 측면 광학 기록하는 이러한 기술에 대해 설명합니다.본 실험에서는 정립 현미경과 3대의 카메라를 사용하여 균일한 조명을 조정합니다. 먼저, 레이저 빔 경로에 적절한 중성 밀도 필터를 삽입합니다. 그다음, 표준 형광 슬라이드의 표면에 대물렌즈의 초점을 맞춥니다.모니터 화면에서 시야의 CCD 이미지를 관찰하면서, 시야의 중심이 맞고 균일한 조명이 이루어지도록 에피 형광 콘덴서의 적절한 액추에이터를 사용하여 쿼츠 광가이드 수신단과 광가이드 출력단의 위치를 조정하십시오. 진동 노이즈를 측정하려면 표면에 비형광 마크가 있는 표준 형광 슬라이드를 사용하십시오. 뉴로 CCD의 연속 모드를 사용하여 빛의 세기를 기록하십시오.대물렌즈의 초점을 검은 표식의 어두운 가장자리에 맞추고, 2 kHz의 프레임 속도로 약 100 ms 동안 빛의 세기를 기록합니다. 그런 다음, 균일하게 조명된 영역에서 빛을 받는 약 20개 픽셀과 검은 표식의 가장자리를 따라 있는 약 20개 픽셀에서 얻은 분수 빛 세기 트레이스의 공간 평균을 표시합니다. 고대비 가장자리 픽셀의 공간 평균에서 나타나는 과잉 노이즈는 시스템의 진동 노이즈를 반영합니다.셔터가 열릴 때 광학 기록에 진동 노이즈가 유입되지 않도록 기계식 셔터를 진동 격리 테이블 외부에 설치하는 것이 필수적입니다. 이는 매우 중요한 단계입니다. 광학 기록 시스템에 포착될 수 있는 음향 진동 노이즈를 줄이기 위해 플라스틱 나사와 진동 격리 재료를 사용하여 셔터를 설치하십시오.진동을 격리하기 위해, 이미지의 날카로운 경계(sharp edge)를 포함하는 픽셀의 진동 노이즈가 샷 노이즈(shot noise)보다 작아질 때까지 진동 격리 테이블을 조정하십시오. 기계적 진동이 현미경 본체로 전달되는 것을 방지하려면 테이블 위의 장비 배선이 느슨하게 유지되어야 합니다. 이 절차에서는 스피닝 디스크 공초점 시스템을 사용하여, 관심 있는 개별 신경 세포에서 EGFP를 발현하는 마우스 라인으로 표준 절차에 따라 300 to 400 micron 두께의 뇌 절편을 준비하십시오.슬라이스 내의 EGFP 표지 뉴런을 시각화합니다. 다음으로, 막전위 이미징을 위해 수지상 돌기 및 축삭 나무 구조가 온전하고, 돌기가 슬라이스 표면과 평행하게 가깝게 뻗어 있는 뉴런을 선택합니다. 그런 다음, 약 15초 동안 음압을 가하여 유리 패치 피펫의 팁부터 전극 테이퍼의 3분의 2 지점까지 염료가 없는 세포 내 용액으로 채웁니다.그 후, 세포 내액에 용해된 막 IMP 투과 전압 민감성 염료가 포함된 용액으로 전극을 다시 채웁니다. 염료를 전극에 채운 후 1분 이내에 이전에 선택한 뉴런을 패치합니다. 피펫을 배스(bath)에 내리기 전, 약 10 mmHg의 낮은 양압을 가하고 슬라이스 내에 전극을 배치하는 동안 이 압력을 유지하여, 씰(seal)이 형성되기 전까지 전극에서 염료가 유출되지 않도록 합니다.전극이 세포 표면에 접촉하기 직전에 압력을 수은주 100 millimeters of mercury 정도의 고압으로 높입니다. whole cell 구성으로 씰(seal)을 형성한 후, somatic patch pipette에서 세포체(soma)로 염료가 자유롭게 확산되도록 20분에서 45분 동안 둡니다. 염료 확산 과정 동안 current clamp 모드에서 유발 활동 전위를 기록하여 뉴런의 생리적 상태를 모니터링합니다.또한, 뉴트럴 밀도 필터(neutral density filters)로 조정한 전체 광강도의 일부 수준에서 2kHz의 프레임 속도로 세포체(cell soma)의 정지 광강도를 기록하여 염색량을 모니터링하십시오. 활동 전위(action potential)가 넓어지기 시작할 때까지 다운로딩 과정을 계속하십시오. 염색이 끝나면 전압 클램프(voltage clamp) 설정 상태에서 패치 피펫을 세포체로부터 조심스럽게 당겨, 전체 세포(whole cell) 설정에서 외부-외부 패치(outside-out patch) 설정으로의 전환이 이루어지도록 하십시오.그 후, 전압 민감성 염료가 신경 돌기까지 퍼질 수 있도록 슬라이스를 실온에서 1.5~2시간 동안 추가로 배양합니다. 상당량의 염료가 세포체에서 수지상 돌기 및 축삭 돌기로 확산되면, 활동 전위의 파형이 완전히 복구되어야 합니다. 다음 단계에서는 저강도 형광 하에서 염색된 뉴런의 세포체를 찾습니다.중성 밀도 필터를 사용하여 빛의 세기를 XY 스테이지를 통해 관찰 대상물을 시각화하는 데 필요한 최소 수준으로 줄입니다. 형광 뉴런이 포함된 절편 영역을 스캔하여 형광 소마를 찾습니다. 염색된 세포의 소마를 현미경 시야의 중앙에 위치시키고, DIC 모드에서 염료가 없는 표준 패치 전극으로 뉴런을 패치합니다. 그런 다음, 전압 이미징을 위해 CCD의 연속 기록 모드에서 10~40 Hz의 프레임 속도로 저강도 형광 하에 뉴런 돌기를 시각화합니다.XY 스테이지 위치를 조정하여 촬영 영역 중앙에 관심 있는 신경세포 돌기를 배치합니다. 또한, 광역학적 손상을 줄이기 위해 현미경의 필드 스톱 조리개를 부분적으로 닫아 SOMA를 여기광으로부터 보호합니다. 다음으로, 개별 수지상 돌기 분지에서 역전파 활동 전위와 관련된 광학 신호를 기록합니다.그런 다음 축삭의 활동 전위와 관련된 광학 신호를 기록합니다. 그 후, 수지상 돌기 가시의 역전파 활동 전위와 관련된 광학 신호를 기록합니다. 신호 파형을 정확하게 재구성하기 위해 적절한 프레임 속도를 사용하십시오.동시에, 염료 표백과 광동역학적 손상을 최소화하기 위해 기록 기간과 고강도 들뜸 빛에 노출되는 시간을 최대한 짧게 유지하십시오. 여기에서 광학 신호의 기록 과정이 제시됩니다. 상단 패널은 기록 위치에 있는 축삭을 포함하여 염색된 뉴런의 고해상도 공초점 이미지를 보여줍니다.중앙 패널은 막전위 이미징에 사용된 CCD로 획득한 축삭의 저해상도 형광 이미지를 보여주며, 하단 패널은 soma의 전극 기록과 A IS 및 rvi 결절의 광학 기록을 나타냅니다. 가공되지 않은 원시 데이터와 처리된 신호가 함께 표시되어 있습니다. 이 그림은 전압 민감성 염료가 로딩된 L5 피질 뉴런 축삭의 활동 전위 신호를 보여줍니다.잠재적인 관련 신호들을 10 kilohertz의 프레임 속도로 기록하였습니다. 이 트레이스들은 세 지점에서의 활동 전위 일시 변화를 나타냅니다. 첫 번째는 세포체에서 기록한 전극입니다.둘째는 축삭둔덕(axon hillock)의 광학 기록이며, 셋째는 첫 번째 마디(node of Ranvier)의 광학 기록입니다. 그리고 여기 동일한 세 지점에서 얻은 중첩 신호가 있습니다. 이 그림은 100 Hz의 짧은 탈분극 전류 펄스에 의해 유도된 L5 피질 뉴런 수지상 돌기 분지상의 여러 지점에서 발생하는 4회의 역전파 활동 전위 신호 버스트를 보여줍니다. 여기에는 개별 수지상 돌기 가시(dendritic spine)에서 측정된 활동 전위 신호가 나타나 있습니다.여기에 스피닝 디스크 공초점 이미지 스택으로 얻은 해부학적 재구성 이미지가 있으며, 여기에는 CCD 카메라로 촬영한 동일 영역의 형광 이미지가 있습니다. 막전위 이미징을 위해, CCD 이미지에 표시된 1번부터 3번 위치에서 발생하는 역방향 전파 활동 전위에 해당하는 형광 강도 추적선이 오른쪽 패널에 표시되어 있습니다. 하단 추적선은 세포체에서 기록된 전극 신호를 나타냅니다.사전 기록 준비에는 주사위 모양의 세포(dice)가 원위 돌기(distal processes)까지 퍼지는 대기 시간을 포함하여 약 3시간이 소요됩니다. 기록 시간은 준비물의 일반적인 기능 저하(rundown) 및 PO 광역학적 손상에 의해 제한됩니다. 광역학적 손상의 정도는 들뜸 빛(excitation light)의 강도, 그리고 개별 기록 시도의 지속 시간 및 횟수에 비례합니다.일부 실험에서는 1~2시간 동안 50회 이상의 기록 시험을 수행하는 것이 가능합니다. 반면, 다른 측정법들은 높은 여기 상태, 강한 빛의 세기 및 더 긴 기록 시간을 필요로 하며, 광역학적 손상으로 인해 기록 시험 횟수가 몇 차례로 제한됩니다. 이 영상을 시청하고 나면, 뇌 절편 내 개별 뉴런의 전체 축삭 및 말단 구조에서 전압 이미징을 수행하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Neuroscience

신경과학

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쥐 뇌 조각에서 뉴런의 Vibrodissociation는 시냅틱 전송 및 이미지 Presynaptic 터미널 공부

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Patch-Clamp Recordings from the Dendrite of a Dopaminergic Neuron in a Brain Slice

이 비디오는 전압 민감성 염료로 염색된 뇌 절편에서 신경 활동의 변화를 관찰하는 절차를 보여줍니다. 염료는 형광 강도를 변경하여 뉴런의 막 전위의 변화를 반영합니다. 전기 자극과 고급 이미징 기술의 적용을 통해 이 프로세스를 통해 VSD 형광을 기반으로 신경막 전위의 실시간 변화를 시각적으로 추적할 수 있습니다.

전압 민감성 염료로 염색된 뇌 절편의 신경 활동에 대한 광학 기록

이 비디오는 뉴런 특이적 형광 단백질을 포함하는 형질전환 뇌 절편에서 전기 활동을 동시에 이미징하고 기록하는 방법을 설명합니다. 이 절차에는 폭기된 인공 뇌척수액이 있는 관류 챔버에서 뇌 절편을 유지하고, 광원을 사용하여 형광 표지된 세포를 여기시키고, 다중 채널 프로브 및 패치 클램프로 전기 신호를 기록하는 것이 포함됩니다.

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생체 외 뇌 조각은 구 심성 입력에 대한 유발 반응에 대한 휘발성 마취제의 효과를 연구하는 데 사용할 수 있습니다. 광유전학은 시상피질 및 피질 피질 구심성을 비원발성 신피질에 독립적으로 활성화하는 데 사용되며 시냅스 및 네트워크 반응은 이소플루란으로 조절됩니다.

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Axons, 수석 및 뇌 슬라이스의 개별 뉴런의 수지상 쪽의 전압에 민감한 염료 기록

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