Name: 마우스의 림프 Vasculature의 비 침습적 광학 이미징 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-03-08T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 52 s
Description: 배우세요 마우스의 림프관을 비침습적으로 광학 이미징하는 방법을. 근적외선 형광(NIRF) 기술을 활용하여 림프관 구조와 기능을 실시간으로 관찰할 수 있습니다. 이 기법은 암 전이 및 면역 반응 연구에 활용됩니다.

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NIH R01 CA128919 및 NIH R01 HL092923 :이 작품은 에바 Sevick에 다음 보조금에 의해 지원되었다.

모든 동물 연구는 텍사스 건강 과학 센터 (휴스턴, TX), 비교 의학 부, 검토 및 해당 기관 동물 케어하여 프로토콜의 승인 후 분자 이미징 센터 대학의 기준에 따라 수행하고위원회를 사용했다 (IACUC) 또는 동물 복지위원회 (AWC). 1. 이미징에 앞서 24 시간 동물의 작성 림프 영상이 일어나기 전에 아래의 단계 일 (필요에 따라)을 수행해야합니다. <ol><li> 장소 유도 상자에 동물과 isoflurane과 진정. </li><li> 동물은 깊이 마취 (발가락 - 핀치 연습과 모니터링), isoflurane 가스에 연결된 코 콘에서 기저귀 / 보풀 패드 및 위치 코 곳 진정제 동물의 상태에되면. </li><li> 이미징 될 수있는 영역이 주위 머리카락 / 털을 (해당되는 경우) 클립. </li><li> 클립 영역으로 탈모 에이전트 (NAIR)을 적용하고 O 남겨N 최대 3 분까지의 피부. </li><li> 부드럽게 따뜻하고 축축한 거즈 나 종이 타월로 모든 탈모 에이전트를 닦아. </li><li> 부드럽게 따뜻한 물로 피부를 씻어 부드럽게 거즈 나 종이 타월로 영역을 건조. </li><li> 동물 가열 패드 또는 열 램프 아래의 복구, 그들의 케이지로 돌아갈 수 있습니다. </li></ol> 2. 이미징의 날 <ol><li> 멸균 물 Reconstitute 이미징 에이전트 다음 cABD-IRDye800을위한 ICG 또는 200 μM (6.8 μg/10 μl)를 645 μM을 (5 μg/10 μl) 달성하기 위해 멸균, 정상 (0.85 %) 염분을 사용하여 희석. 어둠 속에서 솔루션을 유지 조건과 reconstitution 6 시간 내에 사용. </li><li> 장소 유도 상자에 동물과 isoflurane과 진정. </li><li> 동물은 깊이 마취 (발가락 - 핀치 연습과 모니터링), isoflurane 가스에 연결된 코 콘에서 기저귀 / 보풀 패드 및 위치 코의 측면에 위치 진정제 동물의 상태에되면. </li><li> (그래서 방은 불을 끄고어두운). 필요한 경우, 작은 책상 할로겐 빛이 주사를 볼 수 빛의 작은 양에 사용할 수 있습니다. </li><li> 31 게이지 바늘로 인슐린 주사기를 사용에 따라 각 뒷다리 발 /의 등 부분이나 꼬리의 기지의 왼쪽과 오른쪽에있는 ICG 또는 cABD - IRDye800의 50 μl에 ID 5 μl를 주입 관심 영역 (토론 참조). 각 주입 투여 량은 0.083에서 1.25 밀리그램 / kg (ICG) 또는 0.113-1.7 밀리그램 / kg (cABD-IRDye800)로 다양 할 수 있습니다. 사출 볼륨 동물 스트레인, 사출 사이트와 다를 수 있습니다. athymic 마우스의 경우, 사출의 볼륨은 5 μl (뒷다리 앞발로 땅을 차다) 또는 10 μl (꼬리베이스)이 될 수 있습니다. 동물 주입 (들)에 대한 이미징 시스템에서없는 경우, 바로 뒤에 이미징 시스템에서 동물을 배치 주사 (들). </li><li> 더 염료 이해가 lymphatics에서 볼 수없는 경우 동물의 프로토콜에 따라 필요한 단계 2.5 반복해야합니다. </li><li> 일단 lymphatics이 보이는되며, 검은 색 전기 테이프 나 검은 색 아빠와 주사 사이트를 포함당. </li><li> 최대 사용 1 시간에 대한 림프 이미지를 취득 V + + 소프트웨어와 작은 동물, NIRF 이미징 시스템. (동물 isoflurane으로 마취하고 이미지가 인수하는 동안 호흡을 모니터링됩니다.) 작은 동물 있지만, NIRF의 imagers가 상업적으로 사용할 수 있습니다, 우리는 785-nm의 레이저 다이오드로 구성된 사용자 정의, 작은 동물 NIRF 이미징 시스템 (1천5~9밀리미터-78503을 이용 , 강렬한, 노스 비구면 렌즈 (C24TME​​-B, Thorlabs, 뉴턴, NJ), 디퓨저 (ED1-C20, Thorlabs)와 복 브런 즈윅, 뉴저지) 및 필터 (LD01-785/10-25, Semrock, 로체스터, NY ) cm2 당 10 개씩 미만 1.4 MW의 사고 fluence 속도에서 동물을 비춰 균일 여기 필드를 만들 수 있습니다. 전자는 두 830-nm의 필터 (AND11333, 앤도버 공사, 세일럼, NH)와 28 mm Nikkor 렌즈 (1992, 니콘과 카메라 시스템 부과 - 커플 링 장치 (EMCCD, PhotonMax512, 프린스턴 악기, 트 렌튼, NJ) 곱한 멜빌, NY)이 통합 팀과 림프 이미지를 캡처하는 데 사용됩니다정적 이미지 5 동적 이미징 및 800 밀리 초 200 밀리 초의 에스. 시스템 구성, 각 구성 요소의 추가 내용은 표, 키 영상 특성에 대한 간략한 논의에 대한 토론을위한 그림 1을 참조하십시오. </li><li> 동물 가열 패드 또는 열 램프 아래의 복구와 케이지로 돌아 오거나 안락사시켜야 할 수 있습니다. </li><li> ImageJ 또는 MATLAB 소프트웨어를 사용하여 이미지를 분석합니다. 그림 6을 참조하십시오. </li></ol>

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<li>Rasmussen, J. C., Tan, I. C., Marshall, M. V., Fife, C. E., Sevick-Muraca, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lymphatic+imaging+in+humans+with+near-infrared+fluorescence%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Lymphatic imaging in humans with near-infrared fluorescence.</a> Curr. Opin. Biotechnol. 20, 74-82 (2009).</li>
<li>Rasmussen, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+Lymphatic+Architecture+and+Dynamic+Transport+Imaged+Using+Near-infrared+Fluorescence%5BTitle%5D)+AND+%22Transl.+Oncol%22%5BJournal%5D)">Human Lymphatic Architecture and Dynamic Transport Imaged Using Near-infrared Fluorescence.</a> Transl. Oncol. 3, 362-372 (2010).</li>
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<li>Hall, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+prostate+cancer+lymph+node+metastases+with+a+multimodality+contrast+agent%5BTitle%5D)+AND+%22Prostate%22%5BJournal%5D)">Imaging prostate cancer lymph node metastases with a multimodality contrast agent.</a> Prostate. 72, 129-146 (2012).</li>
<li>Zhu, B., Sevick-Muraca, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Minimizing+excitation+leakage+and+maximizing+measurement+sensitivity+for+molecular+imaging+with+near-infrared+fluorescence%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Innovat.+Opt.+Health+Sci%22%5BJournal%5D)">Minimizing excitation leakage and maximizing measurement sensitivity for molecular imaging with near-infrared fluorescence.</a> J. Innovat. Opt. Health Sci. 4, 301-307 (2011).</li>
</ol>

저자는 공개 할 필요가 없어하지만 일부 저자는 특허에 기재되어 있습니다.

우리는 쥐이라는 림프 혈관의 이미지를 캡처하는 사용자 정의, 작은 동물 NIRF 이미징 시스템을 사용합니다. 림프 운동의 영화를 구성하는 300 개 이상의 이미지를 수집하고 있습니다. 영화에서 lymphatics의 기능 분석을 위해, 두 개 이상의 ROIs를 수동 림프 혈관을 따라 그려 있습니다. ROIs의 크기는 각 선박에 대한 지속적인 유지와 약 혈관의 직경 있습니다. 전체 동물 공간적 해상도가 100 마이크론 이하의 형광 림프 혈관을 묘사 할 수 있지만, 미세한 해상도 이미지 macrolens 10을 고용 할 수 있습니다. 해부학 참조 용으로 화이트 빛이 이미지는 또한 저전력 램프를 사용하여 취득 할 수 있습니다. 이 영상 대리인 후 다른 여진 / 형광 방출 스펙트럼, 위에서 설명한 필터를 다른 형광 염료로 구성하는 경우 이미징 성능을 유지하기 위해 변경해야하며 에이전트 투여가 잘으로 조정해야 할 수도 있습니다 것을인지해야합니다. 또한, 여기 파장은 르 경우750 나노 미터보다 SS는 다음 autofl...

<table border="1"><tbody><tr><td> 솔루션, 시약 및 장비 </td><td> 회사 </td><td> 카탈로그 번호 </td><td> 코멘트 </td></tr><tr><td> Indocyanine 녹색 (ICG) </td><td> Patheon 이탈리아 SPA </td><td> NDC 25431-424-02 </td><td> 645 μM (5 μg/10 μL)에 Reconstitute </td></tr><tr><td> 순환 알부민 바인딩 도메인 (cABD) </td><td> Bachem </td><td> 관습 </td><td> 200 μM (6.8 μg/10 μL)에 Reconstitute </td></tr><tr><td> IRDye800 </td><td> 리튬 COR </td><td> IRDye 800CW </td><td> 제조의 지시에 따라 Reconstitute는, equilmolar 농도에 cABD와 어원이 같은 말 </td></tr><tr><td> 멸균 물 </td><td> Hospira, 주식회사, 레이크 포레스트, IL </td><td> NDC 0409-4887-10 </td><td></td></tr><tr><td> NAIR </td><td> 교회 &amp; 드와이트 (주)주식회사 </td><td> 지역 상점 </td><td> <a href="http://www.nairlikeneverbefore.com" target="_blank">www.nairlikeneverbefore.com</a> </td></tr><tr><td> 이미징 시스템 (구성 요소 아래) </td><td> 분자 이미징 센터 </td><td> N / A </td><td> 우리 실험실에서 사용자 지정 - 내장. </td></tr><tr><td> 전자 - 곱 전하 결합 장치 (EMCCD) 카메라 </td><td> 프린스턴 악기, 트 렌튼, NJ </td><td> 광자 최대 512 </td><td></td></tr><tr><td> 니콘 카메라 렌즈 </td><td> 니콘 주식회사, 멜빌, NY </td><td> 모델 번호 1992 Nikkor 28mm </td><td></td></tr><tr><td> 광학 필터 </td><td> 앤도버 공사, 세일럼, NH </td><td> ANDV11333 </td><td> 두 830.0/10.0 나노 미터 대역 통과 필터는 렌즈 앞에 사용됩니다 </td></tr><tr><td> 785 나노 미터 레이저 다이오드 </td><td> 강렬한 (주), 노스 브런 즈윅, 뉴저지 </td><td> 1005-9 밀리-78503 </td><td> 광 출력 500 MW </td></tr&gt; <tr><td> Collimating 광학 </td><td> Thorlabs, 뉴턴, NJ </td><td> C240TME-B </td><td> 이전 정화 필터 Collimates 레이저 출력 </td></tr><tr><td> 청소 필터 </td><td> Semrock 주식회사, 로체스터, NY </td><td> LD01-785/10-25 </td><td> 형광 밴드에서 레이저 방출을 제거 </td></tr><tr><td> 광 확산 </td><td> Thorlabs, 뉴턴, NJ </td><td> ED1-C20 </td><td> 동물을 통해 레이저를 Diffuses </td></tr><tr><td> V + + </td><td> 디지털 광학, 브라운 베이, 오클랜드, 뉴질랜드 </td><td> 버전 5.0 </td><td> 소프트웨어는 카메라 시스템을 제어하고 컴퓨터에 이미지를 저장하는 데 사용됩니다. <a href="http://digitaloptics.net/" target="_blank">http://digitaloptics.net/은</a> </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> 다음과 같은 소프트웨어 패키지의 어느 분석 소프트웨어는 이미지 분석에 사용하실 수 있습니다 </td></tr><tr><td> ImageJ </td><td> 국립 Insti건강, 베데스다, MD의 tutes </td><td> 사용 가능한 최신 버전 </td><td> 에서 프리웨어 가능 <a href="http://rsbweb.nih.gov/ij/" target="_blank">http://rsbweb.nih.gov/ij/</a> </td></tr><tr><td> MATLAB </td><td> MathWorks, Natic​​k, MA </td><td> 버전 2008a 이상 </td><td> <a href="http://www.mathworks.com/" target="_blank">http://www.mathworks.com/</a> </td></tr></tbody></table>

마우스의 림프 vasculature의 비 침습적 광학 이미징

Non-invasive Optical Imaging of the Lymphatic Vasculature of a Mouse

림프 혈관 시스템은 유체 항상성을 유지 배에 면역 감시 및 mediates 지방 흡수를 제공하는 순환 시스템의 중요한 구성 요소입니다. 그러나 그 중요한 기능에도 불구하고 림프 체계는 건강과 질병 1이 기능을 제공하기 위해 적응하는 방법에 비교적 작은 이해가 있습니다. 최근, 우리는 세대 III는 -, 동적​​ 이미지 림프 건축과 림프 등의 추적에 가까운 적외선 형광 (NIRF) 염료의 관리 및 사용자 정의를 사용하여 림프 장애를 앓고 명에서뿐만 아니라 정상적인 인간의 과목에서 &#39;펌핑&#39;작업 할 수있는 기능을 증명 한 이미징 시스템 2-4 강화. NIRF 영상은 인간의 질병과 림프 아키텍처 및 기능에 극적인 변화를 보여 주었다. 그것은 이러한 변경 사항이 발생하여 새로운 동물 모델의 유전자와 분자 기초를 명료하게하다하기 위해 개발되는지는 확실치 남아 있습니다. 이 프로토콜에서는, 우리는 NIRF의 림프, S를 제공쇼핑몰 동물 영상 5,6 녹색 (ICG), 인간 7 50 년 동안 사용 된 염료, 그리고 우선적으로 마우스와 인간의 알부민 8 바인딩 NIRF 염료 표시 순환 알부민 결합 도메인 (cABD-IRDye800) 펩타이드를 indocyanine 사용 . ICG보다 약 5.5 배 더 밝아, cABD - IRDye800은 비슷한 림프 통관 프로필을 보유하고 있으며 영상 8 충분한 NIRF 신호를 달성하기 위해 ICG보다 작은 회에 걸쳐 주입 할 수 있습니다. 중간 공간 8 알부민에 모두 cABD - IRDye800과 ICG 구속, 그들은 모두에 그리고 lymphatics에서 활성 단백질 수송을 묘사 할 수 있습니다 때문입니다. Intradermal (ID) ICG의 주사 (5-50 μl의) (645 μM) 또는 생리에 cABD-IRDye800 (200 μM)는 각 뒷다리 앞발로 땅을 차다 및 / 또는의 기초의 왼쪽과 오른쪽의 등 부분에 관리되는 isoflurane - anesthetized 마우스의 꼬리. 동물의 결과 염료 농도는 83-1,250 μg / ICG에 대한 kg 또는 113-1,700 μg / kg을위한 것입니다cABD - IRDye800. 즉시 주사 후, 기능 림프 이미징은 사용자 정의, 작은 동물 NIRF 이미징 시스템을 사용하여 최대 1 시간에 진행됩니다. 전체 동물 공간적 해상도는 깊이 3cm 9 취득 할 수에 구조의 형광 림프 100 마이크론 이하의 선박, 이미지를 묘사 할 수 있습니다. 이미지는 V + + 소프트웨어를 사용하여 인수 ImageJ 또는 MATLAB 소프트웨어를 사용하여 분석하고 있습니다. 분석하는 동안, 전체 선박 직경을 포함한 관심 (ROIs)의 연속 영역은 주어진 림프 혈관을 따라 그려 있습니다. 각 투자 수익 (ROI)에 대한 크기가 양적 림프가 혈관을 통해 이동의 &quot;패킷&quot;을 평가하기 위해 각 투자 수익 (ROI)에 대한 측정 주어진 선박 및 NIRF 강도에 대한 지속적인 유지하고있다.

마우스의 NIRF의 림프 영상의 예 ICG 또는 cABD-IRDye800는 보통 마우스의 꼬리의 기지에서 ID를 주입되면 꼬리의 기지에서 주입 사이트와 사타구니 림프절 (후면) 사이의 림프 vasculature은 즉시 시각화해야합니다. 얼마 주입 후 (몇 초 분), 사타구니 에선과 겨드랑이 에선 사이의 림프 배는 그림 2에서 볼 시각화해야합니다. 그들은 인간처럼 마우스의 lymphatics 동물에서 동물로 다르므로 그림 3에 도시 된 바와 같이, 동물 사이의 아키텍처에 변화를 볼 수 있습니다. ICG 또는 NIRF-cABD는 보통 마우스의 뒷다리 앞발로 땅을 차다의 등 부분에 ID를 주입하는 경우, 두 림프 혈관은 그림 4와 같이 오금 에선에 배수 시각화 할 수 있습니다. 어떤 경우에는, 그것은 서로 때문에 자신의 가까이의 두 선박을 구분하기가 어렵습니다. <p class="jove_...

가까운 적외선 형광 (NIRF)를 사용하여 최근 개발 된 이미징 기술은 림프 시스템의 암 전이에서 활약 역할, 면역 반응, 상처 수리 및 기타 림프 - 관련 질병을 명료하게하다하는 데 도움이 될 수 있습니다.

마우스의 림프 Vasculature의 비 침습적 광학 이미징

림프 혈관계는 체액 항상성을 유지하고, 면역 감시 기능을 제공하며, ... 하는 순환계의 중요한 구성 요소입니다.

이 실험 절차의 전반적인 목표는 근적외선 형광 이미징 시스템을 사용하여 소동물의 림프관을 비침습적으로 이미징하는 방법을 시연하는 것입니다. 이를 위해 먼저 이미징 직전에 형광 염료를 적절한 농도로 재구성합니다. 그다음, 진정된 동물의 해당 부위에 염료를 피내 주입합니다.이를 통해 마지막 단계에서 관심 있는 림프관을 시각화할 수 있습니다. 혈관 이미지를 획득한 후 분석을 진행합니다. 최종적으로, 근적외선.형광 림프관 영상 기법은 림프관의 구조와 기능을 입증하고 밝히는 데 사용될 수 있습니다. 이 방법은 건강한 동물의 림프계가 수행하는 역할에 대한 통찰을 제공할 뿐만 아니라, 암 전이, 급성 및 만성 면역 반응, 상처 치유, 형질 전환 모델과 같은 다양한 질병 조건에도 적용될 수 있습니다.림프 관련 질환 모델 영상 촬영 당일, 먼저 sterile water로 incy와 green을 재구성한 후 normal saline으로 희석하여 645 micromolar 농도로 맞춥니다. 그 다음, 진정 상태의 동물에서 노즈콘(nose cone)을 조정한 후, 필요에 따라 조명을 끕니다. 주사 부위를 확인하기 위해 작은 데스크용 할로겐 조명을 사용할 수 있습니다.이 실험 절차에서 가장 어려운 점은 시각화하려는 림프관으로 흡수될 수 있도록 정확한 위치에 피하가 아닌 진피 내로 마우스에 주입하는 것입니다. 성공적인 실험을 위해, 실험을 시작하기 전 각 동물의 림프관 위치를 확인하는 기저 상태 이미지를 2~3장 확보하십시오. 이제 31 gauge 바늘이 달린 인슐린 주사기를 사용하여 꼬리 기저부의 왼쪽에 염료 10 µL를 주입하여, 일반적으로 서혜부에서 액와부로 배수되는 림프관을 시각화합니다.동물의 왼쪽을 시각화하려면 5, 6, 9 또는 10번 위치에 주입하십시오. 오른쪽을 시각화하려면 7, 8, 11 또는 12번 위치에 염료를 주입하십시오. 서혜부에서 액와부로 이어지는 림프 배수를 최적으로 시각화하기 위한 흡수를 위해 1~4번 위치 또는 꼬리 하단 두 곳에 주입할 수 있습니다. 주입 시 동물이 영상 시스템 아래에 있지 않은 경우, 주입 직후 즉시 배치하십시오.다음으로, v plus plus 소프트웨어와 소동물 근적외선 형광 이미징 시스템을 사용하여 림프관을 관찰할 수 있도록 주사 부위를 검은 종이로 덮습니다. 최대 1시간 동안 림프 이미지를 획득합니다. 마지막으로, 동물들이 스너글 히트 패드(snuggle heat pad) 위에서

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Research

연구

JoVE Journal

Immunology and Infection

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