Name: Ex vivo Live-Imaging van Single Cell Divisies in Muis neuroepithelium (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-04-30T12:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 41 s
Description: Leer ex vivo live-imaging van enkele celdelingen in het muisneuroepitheel met behulp van tijd-afhankelijke confocale microscopie. Deze methode maakt real-time observatie van celdeling mogelijk.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Dit onderzoek werd ondersteund door een ARRA Supplement, 5 R01 NS056380. Extra steun werd verleend via de virale vector Core en de Microscopie Kern van de Emory Neuroscience NINDS Core Facilities subsidie, P30NS055077. Wij danken de Emory Transgene muis en gene targeting Core voor het afleiden van de muis lijn van GENSAT; Greg Pazour voor de stabiele SSTR3-GFP IMCD3 cellijn, en Bradley Yoder voor de Sstr3-GFP lentivirale construct. Monoklonale antilichamen werden verkregen van de Developmental Studies Hybridoma Bank, ontwikkeld onder auspiciën van de NICHD, en onderhouden door de Universiteit van Iowa, Afdeling Biologische Wetenschappen, Iowa City, IA 52242. Alle dierlijke procedures werden goedgekeurd door de IACUC en het Biosafety Comite aan de Emory University.

Volwassen muizen geëuthanaseerd mechanisch cervicale dislocatie. Alle dierlijke procedures werden goedgekeurd door de IACUC en het Biosafety Comite aan de Emory University. 1. Embryo Generation <ol><li> Cross tamoxifen-induceerbare Cre lijn, CAGGCreER en dsRedCre reporter lijn (Tg (CAG-Bgeo,-DsRed * MST) 1Nagy) (Figuur 1) 5,6. Voor het bewaken van de relatieve timing van Shh respons in de dochtercellen, kruis CAGGCreER en DsRed lijn met de Olig2-eGFP BAC transgene muizen (Tg (Olig2-EGFP) EK23Gsat) (Figuur 1) 7,8. </li><li> Ontbinden tamoxifen in 100% ethanol, en het uitvoeren van intraperitoneale injectie van 2,5 mg tamoxifen per 40 g lichaamsgewicht in zwangere vrouwtjes bij embryonale 6.5 (E6.5) naar Cre expressie en DsRed etikettering in een klein deel van de cellen te induceren. </li><li> 48 uur later ontleden embryo&#39;s, identificeren DsRed positieve embryo&#39;s met behulp van de fluorescentie microscoop, overbrengen naar de cultuur schotel en waarneembaree enkele celdelingen tijdens ex vivo beeldvorming (zie hieronder). </li></ol> 2. Hele Mouse Embryo Cultuur <ol><li> Ontleden E8.5 embryo in voorverwarmde wasmedium met DMEM/F12 (1:1) aangevuld met 10% serum van pasgeboren kalveren en 1% penicilline / streptomycine (P / S) 9. </li><li> Direct na sectie embryo plaats op 37 ° C verwarmingsstap onder de fluorescentiemicroscoop en identificeren als GFP en / of DsRed positief (zie hieronder). </li><li> Overdracht tot 2 embryo&#39;s in een 500 ul druppel vooraf geëquilibreerd kweekmedium bevattende 50% serum van een rat Sprague-Dawley mannelijke en 50% DMEM/F12 (1:1) zonder fenolrood, aangevuld met L-glutamine en 1% 1 M HEPES in 0,85% NaCl en P / S 9. </li><li> Breng een dun laagje (0,1 cm) van evenwicht lichte minerale olie op de middellange tot verdamping te voorkomen en de overdracht van de cultuur schotel met de embryo&#39;s om de 37 ° C, 5% CO 2 incubator. </li></ol> 3.Virale infectie <ol><li> Om label trilharen in de neuro-epitheel, voeg 5-10 ul van Sstr3-GFP lentivirus, circa 2 miljoen virusdeeltjes, een 500 pi evenwicht druppel kweekmedium met een E8.5 embryo. </li><li> Na 18 uur van de cultuur, de overdracht geïnfecteerde embryo in verschillende druppels wasmedium te spoelen het virus en bereiden neurale buis slice. </li></ol> 4. Neurale buis Slice Voorbereiding voor Live Imaging <ol><li> Ontleden neurale buis van het E8.5 embryo in voorverwarmde wasmedium met een micro-mes size 0.025 mm, op een 1% agar gecoate schaal. </li><li> Plaats de geïsoleerde neurale buis ventrale kant naar beneden in een 150 ul druppel evenwicht gebracht kweekmedium zonder fenol rood op de 35 mm poly-L-lysine gecoat glas onderste schaal. </li><li> Zet kleine hoeveelheden van een 1:1 mengsel gemaakt van 100% pure vaseline en gesmolten kaarsvet (kaars van IKEA) rond de gemonteerde neurale buis, en zachtjes druk door een smal stuk glas dekglaasje omimmobiliseren van het monster. </li><li> Bedek de schaal met een dunne laag (-0,1 cm) geëquilibreerd lichte minerale olie (figuur 2). </li></ol> 5. Wonen Imaging en Time-lapse confocale microscopie <ol><li> Plaats schotel onder de Nikon A1R laser scanning confocale microscoop Omgekeerde uitgerust met een klimaatkamer die temperatuur regelt, ingesteld op 37 ° C en 5% CO 2. </li><li> Gebruik 60x olie-immersie objectief om GFP gelabelde cilia en DsRed positieve cellen op te nemen, terwijl de 40x olie-immersie objectief gebruiken om toezicht te houden Olig2-GFP en DsRed positieve cellen. </li><li> Open de NOS Elements-software voor het opzetten van time-lapse imaging voorwaarden. Elke 10 min verwerven z-stapels tot 25 pm met een afstand van 1,5 urn (40x objectief) en tot 8 pm met een afstand van 0,4 urn (60x objectief). Gebruik 488 en 561 nm de excitatiegolflengten en verzonden kanaal indien nodig. Acquire beelden in 512 x 512 formaat. Instellen van meerdere door de gebruiker gedefinieerde gebieden van interest om gelijktijdig de opname uit te voeren. Optimale blootstelling aan laservermogen en de helderheid van het beeld werd aangepast door gebruik lage laserintensiteit (tot 11% voor mCherry 561; maximaal 4,5% EGFP 405/488), scansnelheid 1, lijn 2 en de gemiddelde grootte van de pin hole (61 um voor DsRed; 28,1 micrometer voor Olig2; 72 micrometer voor SSTR3GFP; 61,3 micrometer voor DsRed en SSTR3GFP; 58 micrometer voor DsRed en Olig2). Het gebruik van genetisch gecodeerde fluorescerende reporters ons in staat om de helderheid aan te sporen met een laag laservermogen. </li><li> Analyseer geregistreerde gegevens met behulp Imaris 3D reconstructie software. </li></ol> 6. Immunofluorescentie <ol><li> Fix embryo of geïsoleerde neurale buizen in 4% paraformaldehyde / 0,1 M fosfaatbuffer op ijs (4 ° C) gedurende 1 uur in een glazen schaal. </li><li> Wassen monsters 2 uur in PBS op ijs (4 ° C) (verandering PBS een paar keer) en in 30% sucrose / 0,1 M fosfaatbuffer in de nacht of tot embryo wastafel. </li><li> Insluiten in oktober, bevriezing van droog ijs en op te slaan in -80 ° C. Perform snijden op cryostaat (10 mm). </li><li> Wassen dia&#39;s voor 10 minuten in wasoplossing bevattende 1% hitte-geïnactiveerd serum schapen en 0,1% Triton X-100 in PBS. </li><li> Verdunnen primaire antilichamen in wasoplossing bij volgende concentraties: Rat monoklonale anti-RFP (5F8,) 1:200; Rabbit anti-Arl13b serum 1:1500 en muis monoklonale anti-Arl13b 01:05 (295B/54); Rabbit anti-Olig2 1:300; Mouse monoklonalen PAX6, Shh en Nkx2.2-al 01:10, en Konijn polyclonaal Ki67 1:500. Voeg ongeveer 150 ul per dia in platte vochtige kamer, dek af met parafilm om te voorkomen uitdroging en laat over de nacht bij 4 ° C. </li><li> Wassen dia in wasoplossing driemaal 20 min elke keer bij kamertemperatuur. </li><li> Verdunnen secundaire antilichamen Alexa Fluor 488, 568, 350 in wassoppen bij 1:200 concentratie. Gebruik Hoechst 1:3000 of TO-PRO-3 1:500 tot kernen vlek. Voeg 150 ul per slide, laat 1 uur bij kamertemperatuur in vochtige kamer beschermd tegen licht. </li><li> Was de dia&#39;s in wasoplossing two tijden, 30 min elke keer bij kamertemperatuur. </li><li> Mount dia&#39;s in 80% ProLong Gold anti-fade reagens en uitzicht binnen 24 uur. </li></ol>

<ol><li>Yamada, T., Pfaff, S. L., Edlund, T., Jessell, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+cell+pattern+in+the+neural+tube%3A+motor+neuron+induction+by+diffusible+factors+from+notochord+and+floor+plate%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Control of cell pattern in the neural tube: motor neuron induction by diffusible factors from notochord and floor plate.</a> Cell. 73, 673-686 (1993).</li>
<li>Ericson, J., Muhr, J., Placzek, M., Lints, T., Jessell, T. M., Edlund, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sonic+hedgehog+induces+the+differentiation+of+ventral+forebrain+neurons%3A+A+common+signal+for+ventral+patterning+within+the+neural+tube%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Sonic hedgehog induces the differentiation of ventral forebrain neurons: A common signal for ventral patterning within the neural tube.</a> Cell. 81, 747-756 (1995).</li>
<li>Briscoe, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Homeodomain+Protein+Code+Specifies+Progenitor+Cell+Identity+and+Neuronal+Fate+in+the+Ventral+Neural+Tube%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Homeodomain Protein Code Specifies Progenitor Cell Identity and Neuronal Fate in the Ventral Neural Tube.</a> Cell. 101, 435-445 (2000).</li>
<li>Berbari, N. F., Johnson, A. D., Lewis, J. S., Askwith, C. C., Mykytyn, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+ciliary+localization+sequences+within+the+third+intracellular+loop+of+G+protein-coupled+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Biol.+Cell%22%5BJournal%5D)">Identification of ciliary localization sequences within the third intracellular loop of G protein-coupled receptors.</a> Mol. Biol. Cell. 19 (4), 1540-1547 (2008).</li>
<li>Vintersten, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+in+red%3A+red+fluorescent+protein+expression+in+mouse+ES+cells%2C+embryos%2C+and+adult+animals%5BTitle%5D)+AND+%22Genesis%22%5BJournal%5D)">Mouse in red: red fluorescent protein expression in mouse ES cells, embryos, and adult animals.</a> Genesis. 40 (4), 241-246 (2004).</li>
<li>Hayashi, S., McMahon, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+recombination+in+diverse+tissue+by+a+tamoxifen-inducible+form+of+Cre%3A+a+tool+for+temporally+regulated+gene+activation%2Finactivation+in+the+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Efficient recombination in diverse tissue by a tamoxifen-inducible form of Cre: a tool for temporally regulated gene activation/inactivation in the mouse.</a> Dev. Biol. 244 (2), 305-318 (2002).</li>
<li>Gong, S., Zheng, C., Doughty, M. L., Losos, K., Didkovsky, N., Schambra, U. B., Nowak, N. J., Joyner, A., Leblanc, G., Hatten, M. E., Heintz, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+gene+expression+atlas+of+the+central+nervous+system+based+on+bacterial+artificial+chromosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A gene expression atlas of the central nervous system based on bacterial artificial chromosomes.</a> Nature. 425 (6961), 917-925 (2003).</li>
<li>Mukouyama, Y. S., Deneen, B., Lukaszewicz, A., Novitch, B. G., Wichterle, H., Jessell, T. M., Anderson, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Olig2%2B+neuroepithelial+motoneuron+progenitors+are+not+multipotent+stem+cells+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Olig2+ neuroepithelial motoneuron progenitors are not multipotent stem cells in vivo.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103 (5), 1551-1556 (2006).</li>
<li>Jones, E. A. V., Crotty, D., Kulesa, P. M., Waters, C. W., Baron, M. H., Fraser, S. E., Dickinson, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+in+vivo+imaging+of+postimplantation+mammalian+embryos+using+whole+embryo+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Genesis%22%5BJournal%5D)">Dynamic in vivo imaging of postimplantation mammalian embryos using whole embryo culture.</a> Genesis. 34, 228-235 (2002).</li>
<li>Piotrowska-Nitsche, K., Caspary, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live+imaging+of+individual+cell+divisions+in+mouse+neuroepithelium+shows+asymmetry+in+cilium+formation+and+Sonic+hedgehog+response%5BTitle%5D)+AND+%22Cilia%22%5BJournal%5D)">Live imaging of individual cell divisions in mouse neuroepithelium shows asymmetry in cilium formation and Sonic hedgehog response.</a> Cilia. 1 (6), In Press (2012).</li>
<li>Nowotschin, S., Ferrer-Vaquer, A., Hadjantonakis, A. -K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+mouse+development+with+confocal+time-lapse+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Imaging mouse development with confocal time-lapse microscopy.</a> Methods in Enzymology. 476, 351-377 (2010).</li>
</ol>

Geen belangenconflicten verklaard.

Onze ex vivo systeem stelt ons in staat om direct waar te nemen enkele cel verdeeldheid binnen de ontwikkeling neuroepithelium in real time. Als voorbeeld nemen we onderzocht celdelingen in de muis embryonale neurale buis en bewaakt ofwel cilium vorming of Shh respons. We bevestigden onze beeldvorming resultaten (n = 24) waren in overeenstemming met de resultaten uit vaste rubrieken (n = 178) met vermelding van onze techniek biedt fysiologisch relevante gegevens. D...

<table><tbody><tr><td>Z/RED-lijn (STOCK Tg(CAG-Bgeo,-DsRed*MST)1Nagy/J</td><td>Jackson Laboratory</td><td>005438</td><td></td></tr><tr><td>Olig2-eGFP-lijn (STOCK Tg(Olig2-EGFP)EK23Gsat/Mmcd</td><td>MMRRC,</td><td>010555-UCD</td><td></td></tr><tr><td>CAGGCreER</td><td>Jackson Laboratory</td><td>003724</td><td></td></tr><tr><td>Tamoxifen</td><td>Sigma</td><td>T5648</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12 (1:1)</td><td>GIBCO</td><td>21041-025</td><td></td></tr><tr><td>Serum van pasgeboren kalf</td><td>Lonza</td><td>14-416F</td><td></td></tr><tr><td>Penicilline/Streptomycine</td><td>Invitrogen</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Ratenserum SD mannelijk</td><td>Harlan Bioproducts</td><td>4520</td><td></td></tr><tr><td>1M Hepes</td><td>BioWhittaker</td><td>17-737E</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamine</td><td>GIBCO</td><td>21041-025</td><td></td></tr><tr><td>Lichte minerale olie</td><td>Sigma</td><td>M8410</td><td></td></tr><tr><td>Sstr3-GFP lentivirus</td><td>Emory Viral Core</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Micro-mes, maat 0,025 mm</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>62091</td><td></td></tr><tr><td>35 mm poly-L-lysine gecoate schaal met glazen bodem</td><td>MatTek</td><td>P35GC-0-10-C</td><td></td></tr><tr><td>100% Vaseline</td><td>Kroger</td><td>FL9958c</td><td></td></tr><tr><td>A1R Laser Scanning Confocal Inverted Microscoop</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NIS Elements software</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Imaris 3D software</td><td>Bitplane AG</td><td>Imaris 7.2.3</td><td></td></tr><tr><td>OCT</td><td>Tissue-Tek</td><td>4583</td><td></td></tr><tr><td>Cryostaat</td><td>Leica</td><td>CM1850</td><td></td></tr><tr><td>Hitte-geïnactiveerd schapenserum</td><td>Invitrogen</td><td>16210-072</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP151</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyd</td><td>Sigma</td><td>P6148</td><td></td></tr><tr><td>Fosfaatbuffer</td><td>Zelf gemaakt</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Rat monoklonaal anti-RFP (5F8)</td><td>Chromotek</td><td>110411</td><td></td></tr><tr><td>Konijn anti-Arl13b serum</td><td>NeuroMab</td><td></td><td></td></tr><tr><td>muis monoklonaal anti-Arl13b 1:5</td><td>NeuroMab</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Konijn anti-Olig2</td><td>Chemicon</td><td>AB9610</td><td></td></tr><tr><td>Muis monoklonaal Pax6</td><td>Developmental Hybridoma Bank</td><td>Pax6</td><td></td></tr><tr><td>Muis monoklonaal Shh</td><td>Developmental Hybridoma Bank</td><td>5E1</td><td></td></tr><tr><td>Muis monoklonaal Nkx2.2</td><td>Developmental Hybridoma Bank</td><td>74.5A5</td><td></td></tr><tr><td>Konijn polyklonaal Ki67</td><td>Abcam</td><td>AB15580</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488</td><td>Molecular Probes</td><td>A11029</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 568</td><td>Molecular Probes</td><td>A11031</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 350</td><td>Molecular Probes</td><td>A11046</td><td></td></tr><tr><td>H&amp;#8211;chst</td><td>Fisher</td><td>AC22989</td><td></td></tr><tr><td>TO-PRO-3</td><td>Invitrogen</td><td>T3605</td><td></td></tr><tr><td>ProLong Gold anti-fade reagens</td><td>Invitrogen</td><td>P36934</td><td></td></tr></tbody></table>

ex vivo live-imaging van single cell divisies in muis neuroepithelium

Ex vivo Live Imaging of Single Cell Divisions in Mouse Neuroepithelium

We ontwikkelden een systeem dat levende beeldvorming van fluorescente markers en het kweken plakjes embryonale muis neuroepithelium integreert. We hebben gebruik gemaakt van de bestaande muis lijnen voor genetische cell lineage tracing: een tamoxifen-induceerbare Cre lijn en een Cre reporter lijn expressie DsRed bij Cre-gemedieerde recombinatie. Door het gebruik van een relatief laag niveau van tamoxifen, waren we in staat om recombinatie te induceren in een klein aantal cellen, waardoor ons toe om individuele divisies cel volgen. Daarnaast zagen we de transcriptionele respons op Sonic Hedgehog (Shh) signalering met behulp van een Olig2-eGFP transgene lijn 1-3 en we gecontroleerd vorming van cilia door de gekweekte slice met virus dat de trilharen marker, Sstr3-GFP 4 infecteren. Om het imago van de neuro-epitheel, we geoogst embryo&#39;s in E8.5, geïsoleerd van de neurale buis, bevestigd de neurale schijfje in de juiste kweekomstandigheden in de beeldvorming kamer en deed time-lapse confocale beeldvorming. Onze exvivo live-imaging methode stelt ons in staat om enkele celdelingen traceren om de relatieve timing van primaire cilia vorming en Shh reactie in een fysiologisch relevante wijze kan worden gemeten. Deze methode kan eenvoudig worden aangepast met behulp van verschillende fluorescente markers en geeft het veld de instrumenten waarmee naar cel gedrag in situ en in real time te volgen.

Hier voerden we ex vivo live-beeldvorming van enkele cel verdeeldheid binnen de E8.5 muis neuroepithelium. Om individuele cellen te labelen, we geïnduceerde Cre recombinase in een subset van cellen met een Cre reporter lijn die uitgedrukt DsRed na recombinatie 5,6 (figuur 3A). Zo, 48 uur later waren we in staat om enkele celdelingen tijdens ex vivo beeldvorming (Figuren 4A-D) te observeren. Gelijktijdig, we gecontroleerd wanneer de gelabelde cellen werd Shh-...

Hier ontwikkelen we de instrumenten die nodig zijn voor de<em&gt; Ex vivo</em&gt; Live-imaging tot enkele celdelingen in de muis E8.5 neuroepithelium traceren

Ex vivo Live-Imaging van Single Cell Divisies in Muis neuroepithelium

We hebben een systeem ontwikkeld dat live-imaging van fluorescente markers integreert met het cultiveren van coupes van embryonaal muisneuroepitheel. We hebben gebruikgemaakt van ...

Het algemene doel van deze procedure is om live-imaging van fluorescente markers te integreren met kweekplakjes van het embryonale neuro-epithelium van muizen. Dit wordt bereikt door eerst de induceerbare Cree-muizenlijn te kruisen met de Cree-reporterlijn om zichtbaar delende cellen genetisch te labelen. Vervolgens worden de volledige muizenembryo's gedissecteerd en in vitro gekweekt in aanwezigheid van lentivirus.Vervolgens wordt het embryo in plakjes gesneden en wordt de sectie van de neurale buis voorbereid voor live imaging. Ten slotte wordt de plak van de neurale buis gevisualiseerd met time-lapse confocale microscopie. Uiteindelijk kunnen resultaten worden verkregen die een directe observatie in real-time tonen van enkele celdelingen binnen het ontwikkelende neuro-epithelium via ex vivo live imaging.Het voordeel van dit protocol is dat we individuele cellen in vivo kunnen monitoren, wat ons in staat stelt vragen te stellen over de signaleringsgebeurtenissen en het gedrag van elke individuele cel. Begin met het kruisen van de tamoxifen-induceerbare Cree-muislijn, CAGG CRE ER, met de DS Red Cree-reporterlijn. Om de relatieve timing van de sonic hedgehog-respons in de dochterce

ex-vivo-live-imaging-of-single-cell-divisions-in-mouse-neuroepithelium

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowetenschap

Imaging embryonaal weefsel in real-time is een uitdaging gedurende een lange periode van tijd. Hier presenteren we een test voor het toezicht cellulaire en sub-cellulaire veranderingen in de chick ruggenmerg gedurende lange perioden met een hoge ruimtelijke en temporele resolutie. Deze techniek kan worden aangepast voor andere gebieden van het zenuwstelsel en zich ontwikkelende embryo.

Met een hoge resolutie Live-Imaging van cel gedrag in de ontwikkelingslanden Neuroepithelium

Source: Daynac, M., et. al. Cell Sorting of Neural Stem and Progenitor Cells from the Adult Mouse Subventricular Zone and Live-imaging of their Cell Cycle Dynamics. J. Vis. Exp. (2015)This video demonstrates time-lapse imaging of neural stem cells (NSCs) from a transgenic mouse brain using a confocal laser scanning microscope. NSCs fluoresce red during the G1 phase and are non-fluorescent in other cell-cycle phases. An adhered NSC culture is placed in the imaging chamber, imaging parameters are...

Time-Lapse Imaging of Mouse Neural Stem Cell Division Using Confocal Microscopy

Source: Ing-Esteves, S. &amp; Lefebvre, J. L. Time-Lapse Imaging of Neuronal Arborization using Sparse Adeno-Associated Virus Labeling of Genetically Targeted Retinal Cell Populations. J. Vis. Exp. (2021)This video demonstrates the use of confocal microscopy to visualize dendritic dynamics in live mouse retinal explants. It outlines the steps for stabilizing the retina under a confocal microscope, performing epifluorescence imaging to visualize starburst amacrine interneurons, and capturing...

Time-Lapse Confocal Imaging of Neuronal Dendritic Dynamics in Mouse Retinal Explants

Neuroblast migratie is een fundamentele gebeurtenis in postnatale neurogenese. We beschrijven een protocol voor efficiëntie-etikettering van neuroblasts door in vivo postnatale elektroporatie en de daaropvolgende visualisatie van hun migratie met behulp van time-lapse imaging van acute hersenen plakjes. Wij beschikken over een beschrijving van de kwantitatieve analyse van neuroblast dynamiek door video-tracking.

In vivo Postnatale Elektroporatie en time-lapse imaging van neuroblast Migratie in Muis Acute Brain Slices

Dit protocol beschrijft hoe u het delende cellen binnen een weefsel in Caenorhabditis elegans embryo. Terwijl verschillende protocollen beschrijven hoe afbeelding celdeling in de vroege embryo, dit protocol wordt beschreven hoe u foto celdeling binnen een zich ontwikkelende weefsel tijdens midden late embryogenese.

Visualiseren neuroblast Cytokinese Tijdens<em&gt; C. elegans</em&gt; Embryogenese

Progenitorceltransplanten mitose is een kritische parameter van neurogenese. Veel van onze kennis van neurale voorlopercellen mitose is gebaseerd op de analyse van vaste weefsel. Live-beeldvorming in de embryonale hersenen plakjes is een veelzijdige techniek om mitose te beoordelen met een hoge temporele en ruimtelijke resolutie in een gecontroleerde omgeving.

Live-Imaging van mitose in het ontwikkelen van muis embryonale Cortex

Dit protocol Gegevens een gestroomlijnde methode voor live cell imaging uitvoeren in het kader van een intact larvale hersenen. Live cell imaging benaderingen zijn van onschatbare waarde voor de studie van asymmetrische neurale stamcellen divisies evenals andere neurogene en ontwikkelingsprocessen, consequent blootleggen van mechanismen die eerder over het hoofd gezien.

Live-Imaging van<em&gt; Drosophila</em&gt; Larvale neuroblasts

Hier bieden we een goedkope en betrouwbare methode voor het genereren van electroporated brein organotypic segment culturen van muis embryo's geschikt voor confocale microscopie en live-imaging technieken.

Ex Utero Electroporation en Organotypic Slice culturen van muis embryonale hersenen voor Live-Imaging van GABAergic interneuronen migreren

Een ex vivo slice assay maakt het mogelijk om de zenuw uitgroei van de Oculomotor in real-time te laten afbeelen. Segmenten worden gegenereerd door het insluiten van E 10.5 ISLMN: GFP embryo's in agarose, snijden op een vibratome, en groeien in een podium-top incubator. De rol van Axon guidance trajecten wordt beoordeeld door remmers toe te voegen aan de cultuur media.

Ex vivo Oculomotor segment cultuur van embryonale GFP-uitdrukken van muizen voor timelapse-beeldvorming van Oculomotor zenuw uitgroei

Ex vivo live beeldvorming is een krachtige techniek voor het bestuderen van de dynamische processen van cellulaire bewegingen en interacties in levende weefsels. Hier presenteren we een protocol dat twee-fotonmicroscopie implementeert om tandepitheelcellen live te volgen in gekweekte snijtanden van hele volwassen muizen.

Ex vivo live beeldvorming gebruiken om celdelingen en bewegingen tijdens tandvernieuwing bij muizen te onderzoeken

Tijdens de ontwikkeling van de hersenschors ontstaan neuronen en gliacellen in de ventriculaire zone die het ventrikel bekleedt en migreren ze naar het hersenoppervlak. Bij dit proces zijn veel genen betrokken. Dit protocol introduceert de techniek voor de time-lapse beeldvorming van migrerende neuronen en glia-voorlopercellen.

Time-lapse beeldvorming van migrerende neuronen en glia-voorlopercellen in embryonale hersenplakjes van muizen

Leer ex vivo live-imaging van enkele celdelingen in het muisneuroepitheel met behulp van tijd-afhankelijke confocale microscopie. Deze methode maakt real-time observatie van celdeling mogelijk.

Ex vivo Live-Imaging van Single Cell Divisies in Muis neuroepithelium

Meer video's verkennen